人胚胎干细胞培养手册

人胚胎干细胞培养手册操作指南运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4×106/管，可接种一块六孔板。

冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。

培养条件：温度：37±0.5℃CO2浓度：5.1±0.6％相对湿度：85-100%主要技术：1．细胞培养：当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。

此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。

当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。

工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。

2．培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2µm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。

3．细胞处理为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。

操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。

所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。

培养液准备：MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2µm的滤膜过滤。

当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。

如有可能，尽量使用相同的试剂。

使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。

生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。

MEF培养液：hESCs培养液：冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2µm的滤膜过滤,4℃保存。

明胶准备：用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2µm 的滤膜过滤。

明胶包被：接种细胞前，用0.1％明胶溶液包被培养皿，37℃至少30分钟，分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。

在接种MEF前吸除明胶溶液。

准备MEF：可靠的MEF对hESCs的生长和存活是非常重要的。

每管含4×106PMEFi，可接种一块六孔板。

在复苏/传代hESCs前一到二天接种PMEFi，MEFs超过12－14天不能再用作滋养层。

种植MEFs：37℃预温MEF培养液，吸10ml到15ml无菌离心管中。

从-80℃取出MEF冷冻管，立即沁入37℃水浴中，大约30－45秒，细胞有80％融化时取出，立即拿进超净台，70％异丙醇消毒。

把细胞加有培养液的离心管中，最好用1ml 培养液冲洗冻存管，也加到离心管中。

500－600g，离心5分钟。

离心同时，从培养皿中吸出明胶，离心后，小心弃去上清，用12ml（6个孔）培养液重悬细胞，充分混匀，每孔加入2ml。

标记MEF皿，37℃过夜，让MEF贴壁。

6小时后细胞贴壁，最好在接种24－48小时使用，不要使用超过4天的MEF. hES dells所得到的hES cells在10cm培养长满后，分装6瓶，密度4×105cells/ml —对于绝大多数冷冻管。

HUES-9为0.5ml，复苏时时间要比其系短一些。

建议每管复苏到一个35mm培养皿中，或6孔皿的一个孔。

复苏1.接种hES细胞：复苏前应确保MEF已经被准备好且状态良好，不要应用MEF状态不好或超过3天的皿，建议事先标记好所有的离心管和培养皿。

预温hES培养液到37℃，一个细胞系吸取10mlhES培养液到无菌的和标好的15ml离心管中，从液氮中取出hES冷冻管，立即将冷冻管的下半部浸入37℃水浴中，大约45~60秒，细胞80%融化时从水浴中取出，立即将冷冻管拿到超净台中，70%酒精消毒，轻轻移入10ml预温培养基中。

建议用1ml预温培养液洗冷冻管后一并移入15ml离心管500~600g，5min，离心时，从培养箱中取出MEFS，在超净台里吸出培养液（需要几个孔吸几个孔），立即加入1ml hES 培养液，小心不要碰到MEFS，将其放置在超净台内，离心完后，小心吸出培养液，不要碰触离下来的细胞团（如有必要不要吸出所有的培养液。

用1ml培养液轻轻重悬细胞团，将1ml hES 溶液轻轻滴加到预先加入1ml hES培养液的MEF上，和MEF一样尽管使其均匀分布在培养皿上，轻轻移入培养箱，37℃过夜，让hES接种到MEFS上。

hES细胞培养hES细胞培养是费力的，除了复苏/传代的之外，培养液应该每天被更换。

此外，复苏或传代之后经常出现生长滞后现象。

因此，每天观察细胞非常重要，必须保证提前两天准备MEF，因为传代的时间可能会超出你的预期。

请注意，我们已经观察到在这些HUES细胞系，染色体的改变包括12三体（在两个细胞系：hVES-3和4）和其它改变（HUES-1 2号染色体增加）。

这些染色体的异常与增殖特点和双链期短等有关。

由于染色体异常在hES细胞系中是普遍的，建议经常进行染色体分析。

Day1hES细胞复苏24h后，4倍光镜观察，能看到有一些碎屑，这是正常的，不用担心，这些碎屑是死细胞的混合物。

在这个早期阶段，不要指望看到一些细胞团，如果死细胞层完全覆盖孔皿，建议更换部分培养液。

Day2-4通常复苏48h后第一次全部换液，建议2ml/well，复苏后第二天细胞团可以看到，以后每天更换培养液。

Day4-7根据我们的经验，复苏后最早4天最晚10天（此时MEF太老了）需要传代。

传代前的天数通常依赖很多因素，包括被复苏细胞的状态，平均起来，培养接近长满大约需要7天时间，对于一个给定的细胞系如何操作，请和我们联系。

如果复苏的细胞不能重现附录中描述的景象也不要气馁，我们已经注意到在复苏时有些不一致，一些细胞系比另外一些更稳定，出现不协调、扁平的细胞团，也是不少见的，甚至在极个别情况下全出现单层细胞，此时不要放弃，HVES细胞系的细胞形态在传一到两代后得到改善是很常见的。

hES细胞传代复苏4~7天后，细胞接近融合，接近融合的细胞通常1∶3传代。

在细胞分化前进行传代是非常重要的，如果细胞团在接近融合前开始变得带褐色，需要提早1∶2传代。

同样，如果细胞密度太大传代时也需要调整（平均分配，彼此接触）。

1∶3传代传代之前，确保你有预先铺好MEF的3孔皿。

MEF贴壁24h，但不超过3天。

37℃预温hES培养液和0.05%胰酶，在超净台里，预先标记一个15ml离心管，从培养箱中取出MEF，在超净台里吸出三孔的培养液，然后立即回加1ml/孔hES培养液，小心不要碰触MEF，然后将其防在超净台里。

下面的步骤要迅速以减少细胞没有hES培养液的时间。

从培养皿吸去hES培养液，用1×PBS轻轻洗孔皿，吸去PBS，加入0.3ml0.05%胰酶到孔皿中，盖上盖，在4倍光镜下观察细胞，hES细胞团周围的MEF开始回缩。

当MEF充分变圆及hES细胞团界限变得粗糙时，放回超净台，加2ml预温hES培养液到消化的细胞上，轻轻吹吸，洗皿底，直到MEF单细胞层完全分离（单细胞层很粘，可能仍有少量贴壁）。

把细胞悬液移入预先加入10ml培养液的离心管中，用1ml培养液洗孔皿，同样加到离心管中，此时，胰酶完全被抑制。

用加样器吹吸细胞悬液5~7次，分别将1ml悬液均匀滴加到孔皿中，不要晃动瓶皿，将孔皿轻轻放入37℃培养箱过夜，让hES接种。

传代hES细胞与其上代复苏细胞特征相似。

MEF原代培养鼠准备：性交后12.5天的孕鼠。

鼠胚收集：收集前，用明胶包被15cm组织培养皿，1.5~2胚胎/皿，每只鼠大约12胚胎（需6~8个培养皿）。

此外，准备盛有PBS×1的10cm培养皿3个/鼠。

37℃预温MEF培养液和0.05%胰酶。

处死孕鼠，从子宫中取出胚胎置于1×PBS。

在超净台显微镜下从胎膜中取出胚胎，解剖去其内脏（肠、肝、心脏等）。

把干净的胚胎移到一个干燥、无菌的10cm培养皿中。

用无菌手术剪刀切碎胚胎，加0.05%胰酶10ml/10~14胚胎，反复吹吸直到胚胎小块均匀散开，将溶液移至50ml离心管中，37℃孵育1min，吹吸溶解5~10次。

接种原代MEFS加入40ml预温的MEF培养液至溶液中，500~600×g. RT.10′.弃掉上清，加入30ml预温MEF培养液重悬沉淀，接种1.5~2个胚胎（5ml溶液）/15cm明胶包被培养皿，终体积为20ml，37℃孵育。

培养皿长满后，1∶3或1∶4传代到新的25cm组织培养皿上（不用明胶包被），37℃孵育，到细胞再次长满。

原代MEF冻存预温MEF培养液和0.05%胰酶，将冷冻培养液置于冰上，向50ml离心管中加20ml预温培养液（MEF）（3个皿一管），同时取出3个培养皿，弃掉培养液，1×PBS 5ml洗一次，加5ml胰酶/皿，让细胞回缩，将胰酶溶液吸到50ml 离心管中，用另外5ml胰酶洗三个皿一次，同样加到离心管中，最后用10ml预温MEF培养液再洗一次，加到离心管中，1000×g离心5分钟，弃上清，加9ml冷冻培养液重悬（1∶3冷冻）。

每个管中加入1ml（约3×106细胞），1℃/ 分冷冻（？包好-80℃过夜），液氮贮存。

MEF传代一瓶原代MEF4~7天将长满15cm培养皿，大约有10×106个细胞（6孔皿约3×106/6孔）。

预温MEF培养液，向50ml离心管中加入10ml/冷冻管，从液氮中取出冷冻管立即将其下半部浸入37℃水浴中，停留45~60秒，此时细胞约80%融化（少部分未融），迅速拿到超净台中，70%酒精消毒，将细胞轻轻移入预温培养液中，500~600×g离心，加5ml/管重悬细胞，将15ml预温MEF培养液加入15cm培养皿中，将5ml MEF溶液加到15cm培养皿中，均匀分配，标记（日期，第2代P2），37℃，孵育。

MEF处理MEF一旦长满，必须用丝裂霉素C或δ射线抑制其分裂。

丝裂霉素C抑制有丝分裂用MMC处理培养皿，吸出培养液15ml/皿，加到50ml离心管中，加入适量MMC使终浓度为10μg/ml，混合溶液，弃掉每个皿中剩余的5ml培养液，将离心管中含MMC的培养液回加到培养皿中，15ml/皿，37℃孵育3h。

预温MEF培养液和0.05%胰酶到37℃，向50ml离心管中加入20ml预温培养液（3皿/管）。

从孵箱中同时取出3个皿，弃去培养液，用1×PBS 5ml洗1次，加胰酶5ml/皿，让细胞漂起，吸到离心管中，用5ml胰酶洗三个皿，同样加到离心管中，最后用10ml新的预温的MEF培养液洗一次，加到离心管中，用计数板计数细胞密度，500~600×g离心（继续传代和冷冻）。

接种新处理的MEF如果需要用处理过的MEF，用预温的MEF培养液重悬细胞，如果接种6孔板调整细胞密度到4×106 cells/12ml（如是10cm培养皿则为4×106cells/10ml）。