稳定株构建 FAQ
稳定细胞株构建方法
稳定细胞株构建方法我折腾了好久稳定细胞株构建方法，总算找到点门道。
说实话，稳定细胞株构建这事，我一开始也是瞎摸索。
我先讲讲我最开始犯的错啊。
我就想着只要把目的基因转染进细胞不就成了嘛。
我就用了脂质体转染法，转染的时候，我就按照说明书大概弄了一下那个比例，结果转染效率超级低。
就像你想给一群人送信，结果只找到几个人能帮忙送，大部分信都送不出去一样，失败得很彻底。
后来我就研究转染效率低的原因。
发现那个脂质体和DNA的比例很关键。
我就开始一点一点试着调整比例，每次调整完就做一次转染，看看效果。
这就像做饭，盐放多放少得试出个合适的量。
经过好多次尝试，转染效率终于提高了一些。
转染成功只是第一步。
接下来要用抗生素筛选。
我一开始用的抗生素浓度不太对。
浓度低了吧，好多没转染成功的细胞也能存活，这样建出的细胞株就不纯。
浓度高了呢，连转染成功的细胞都被杀死了。
这就是我又一个失败的经历。
然后我就查各种资料，询问身边的同行，大概确定了不同细胞类型适合的抗生素浓度范围，再在这个范围内进行多次测试，才找到了合适的浓度。
我还试过病毒感染的方法构建稳定细胞株。
这个方法呢，病毒包装就很关键。
我自己包病毒的时候，一不小心就容易污染，前面的努力就白费了。
就像盖房子，基础都被破坏掉了。
我总结的经验就是，在包病毒的时候，所有的操作都要超级小心，从试剂的准备开始，每一步都要保证是无菌的，手消毒，台面消毒，试剂瓶消毒一个都不能少。
还有一点，无论是哪种转染或者感染的方法，细胞状态很重要。
我有一次没注意细胞的状态，拿了状态不太好的细胞做实验，转染后细胞死了一大片。
所以呢，养成提前查看细胞状态的习惯特别好。
一定要找那些看起来很健康的细胞来进行构建操作。
总的来说，稳定细胞株构建真的是个需要耐心，不断尝试并且细心对待每一个环节的工作啊。
如何构建稳定转染的细胞系（株）？
如何构建稳定转染的细胞系（株）？稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？A：如下♀一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：表达之类构建细胞转染pool细胞筛选单克隆筛选细胞库建立表达质粒构建A：如下♀将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不同载体上。
为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。
细胞转染A：如下♀将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。
转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。
Pool细胞筛选A：如下♀细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。
选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。
过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。
在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。
单克隆筛选A：如下♀单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。
为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。
三级细胞库的建立A：如下♀细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。
根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。
构建细胞稳转株
构建细胞稳转株（一）慢病毒包装：1．转染前24小时，将293T细胞以4-5×106接种于10cm的大皿中，加入10ml DMEM 完全培养基，轻轻摇晃，混匀，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
注：细胞转染前密度应达到80%-90%。
3．充分混匀，离心管1，离心管2室温孵育5分钟。
4．将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。
注意加入顺序非常重要。
5．室温孵育转染混合液15分钟6．将步骤1准备的细胞换液（95%DMEM+5%灭活FBS）。
7．将1ml转染混合液逐滴加入换液好的细胞培养皿中，前后晃动培养皿，充分混匀。
8．37℃培养。
4-6小时后，用10ml培养基换液（90%DMEM+5%灭活FBS+5%双抗）。
9．转染48小时收集细胞培养上清。
500g离心10min去除细胞碎片。
该上清可以直接用于慢病毒感染，也可进行病毒滴度测定或病毒浓缩。
如需长时间保存，可-80℃冻存。
注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。
（二）慢病毒感染待测细胞：1.取新包装的或冻存于-80℃冰箱的慢病毒于冰上缓慢解冻。
2.慢病毒与培养基（DMEM+5%灭活FBS+1%双抗）按一定的体积混匀，加转染增强剂polybrene至终浓度为10μg/ml。
3.待转染的细胞吸去原培养液，PBS洗3次。
4.把混合好的慢病毒培养基加到细胞培养瓶中进行感染。
5.将细胞培养瓶放回培养箱中培养过夜，PBS洗3次，更换为完全培养基继续培养。
6.感染72h后，荧光显微镜观察荧光，拍照，分析细胞生长状态。
（三）稳转细胞株筛选：将慢病毒感染成功的细胞继续培养，并在培养基中加入嘌呤霉素进行筛选。
筛选持续一周，在荧光显微镜下观察，至感染效率达到80%嘌呤霉素最佳筛选浓度测定：将对数生长期的细胞消化，均匀铺在24孔板上，5×104/孔。
隔夜将细胞换液，并设置嘌呤霉素梯度：0 ug/ml；0.5 ug/ml；1.0 ug/ml；1.5 ug/ml；2.0 ug/ml；2.5 ug/ml48 h后换正常培养基。
稳定细胞株的构建流程
稳定细胞株的构建流程以稳定细胞株的构建流程为标题，写一篇文章细胞株是一种在实验室中长期培养的细胞群体，可以用于研究细胞功能和生物学过程。
在科学研究中，稳定细胞株的构建是一项重要的技术，可以用于表达感兴趣的基因或蛋白质，并进行相关功能研究。
本文将介绍稳定细胞株的构建流程，帮助读者了解该技术的基本原理和操作步骤。
1. 选择合适的细胞株稳定细胞株的构建首先需要选择一个合适的细胞株作为基础。
常用的细胞株有HEK293、CHO、HeLa等。
选择细胞株时需要考虑其易于培养、易于转染以及适合研究目的的特点。
2. 构建表达载体表达载体是构建稳定细胞株的关键，它可以帮助将感兴趣的基因或蛋白质引入到细胞中。
常用的表达载体有质粒、病毒、RNA干扰等。
根据实验需要选择合适的表达载体，并将感兴趣的基因或蛋白质插入到载体中。
3. 转染细胞将构建好的表达载体转染到目标细胞中。
转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法、病毒介导转染等。
选择合适的转染方法，将表达载体引入到细胞中。
4. 选择稳定细胞转染后的细胞群体中，只有少数细胞成功地表达了目标基因或蛋白质。
为了筛选出这些稳定细胞，可以加入适当的筛选物质。
例如，如果表达载体中带有抗生素抗性基因，可以在培养基中加入相应的抗生素，只有表达了该基因的细胞才能存活下来。
5. 单克隆分离从筛选后的细胞中挑选出单个细胞，进行单克隆分离。
这可以通过限稀稀释法或流式细胞分选法来实现。
将单个细胞分离培养，得到单克隆细胞株。
6. 鉴定稳定细胞株对得到的单克隆细胞株进行鉴定，确认其是否稳定地表达目标基因或蛋白质。
常用的鉴定方法有Western blot、荧光定量PCR等。
7. 扩大培养经过鉴定的稳定细胞株可以进一步扩大培养，得到足够数量的细胞供后续实验使用。
在扩大培养过程中，需要注意细胞的培养条件、培养基的配方等。
8. 长期保存为了保证稳定细胞株的长期保存，可以采取冻存的方法。
将稳定细胞株冻存于液氮中，以备将来使用。
构建稳定的敲除和过表达的方法
构建稳定的敲除和过表达的方法
在生物学研究中，稳定的敲除和过表达是常用的实验方法，用于研究基因的功能和影响。
通过敲除或过表达特定基因，研究人员可以揭示该基因在生物体内的作用和相互关系。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，需要采用稳定的敲除和过表达方法。
下面将介绍一些构建稳定的敲除和过表达的方法。
1. 选择合适的载体，在进行敲除和过表达实验时，选择合适的载体是非常重要的。
常用的载体包括质粒、病毒载体和转基因动植物。
选择合适的载体可以确保基因的稳定表达和传递。
2. 优化转染条件，对于细胞实验，优化转染条件可以提高敲除和过表达的效率。
包括转染试剂的选择、转染时间和细胞密度等因素。
3. 使用适当的筛选方法，在进行敲除实验时，需要使用适当的筛选方法来筛选出敲除目标基因的细胞系。
常用的筛选方法包括抗生素筛选和基因编辑技术。
4. 确定稳定的过表达细胞系，在进行过表达实验时，需要确保
过表达基因的稳定性和可靠性。
可以通过PCR、Western blot等方法来鉴定过表达细胞系。
5. 确保实验重复性，为了确保实验结果的可靠性，需要进行多次重复实验，并对实验结果进行统计分析。
总之，构建稳定的敲除和过表达的方法是生物学研究中非常重要的一步。
通过选择合适的载体、优化转染条件、使用适当的筛选方法和确保实验重复性，可以确保敲除和过表达实验的准确性和可靠性，为研究人员揭示基因功能和相互关系提供可靠的实验手段。
稳定细胞株的构建流程
稳定细胞株的构建流程以稳定细胞株的构建流程为标题，写一篇文章。
一、引言稳定细胞株的构建是生物学研究中常用的实验技术之一。
通过构建稳定细胞株，可以使目标基因在细胞中稳定表达，从而对其功能进行深入研究。
本文将介绍稳定细胞株的构建流程。
二、选择适当的宿主细胞稳定细胞株的构建首先需要选择适当的宿主细胞，常用的细胞包括人类胚胎肾细胞293细胞、小鼠骨髓细胞NIH3T3细胞等。
选择宿主细胞时需要考虑其易于转染、高细胞增殖率和细胞稳定性等因素。
三、构建载体1.选择适当的表达载体：常用的表达载体有质粒和病毒载体，根据实验需要选择合适的载体。
质粒载体便于操作和大规模扩增，而病毒载体能够高效地转染细胞。
2.插入目标基因：将目标基因插入表达载体中，可以通过PCR扩增得到目标基因片段，并使用限制酶切将其与表达载体连接。
连接后进行酶切鉴定和测序验证。
3.构建转染载体：将表达载体转化至适当的细菌宿主中，利用细菌的复制机制进行扩增。
扩增后提取纯化质粒。
四、转染宿主细胞1.选择合适的转染方法：常见的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒转染法等。
根据宿主细胞的特性和实验要求选择最适合的转染方法。
2.优化转染条件：转染条件的优化对于获得高转染效率和稳定性的细胞株至关重要。
可以调整转染剂的浓度、时间和转染温度等因素。
3.筛选转染细胞：在转染后，使用适当的筛选压力，如抗生素选择、荧光标记等，筛选出转染成功的细胞。
五、稳定细胞株的筛选和鉴定1.单克隆细胞的筛选：通过稀释法将转染细胞稀释至单个细胞，然后培养形成单克隆细胞株。
2.目标基因表达的鉴定：通过Western blot、RT-qPCR等方法对目标基因的表达进行检测，确认稳定细胞株中目标基因的稳定表达。
3.稳定性的验证：长期培养稳定细胞株，观察目标基因的表达是否稳定，并进行细胞传代实验，验证细胞株的稳定性。
六、应用稳定细胞株稳定细胞株的构建完成后，可以用于进一步的实验研究，如基因功能研究、药物筛选和蛋白质表达等。
稳定过表达细胞株的鉴定
稳定过表达细胞株的鉴定
鉴定稳定过表达细胞株是确保实验结果准确可靠的重要步骤。
通常，稳定过表达细胞株被构建来表达外源基因，这些基因可以编码蛋白质、RNA或其他生物分子。
在构建过程中，细胞株被转染并在筛选过程中选出表达外源基因的细胞株。
然而，仅仅检测外源基因的表达并不足以证明细胞株是稳定的。
为了鉴定稳定过表达细胞株，需要进行以下步骤：
1. 稳定性测试：通过连续培养稳定过表达细胞株多代，观察外源基因表达是否稳定。
通常，细胞株需要在稳定条件下培养至少20代，以确保表达稳定。
2. 比较分析：与野生型细胞株进行比较分析，例如测量细胞增殖速率、形态学、细胞周期等。
如果稳定过表达细胞株与野生型细胞株存在显著差异，则该细胞株可能存在异常。
3. 稳定性标记：将可观察的标记或标签引入到外源基因表达系统中，以确定细胞株是否稳定。
例如，可以将荧光蛋白或其他荧光标记引入到外源基因中，观察标记的表达是否稳定。
通过以上步骤鉴定稳定过表达细胞株，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
稳定细胞株筛选实验
稳定细胞株筛选实验实验稳定细胞株是指将外源基因通过转染等方式插入到目标细胞中，并通过筛选得到具有稳定表达外源基因的细胞系。
稳定细胞株在研究基因功能、开发生物制药等方面有着广泛的应用。
本实验旨在介绍一种基于抗生素筛选的稳定细胞株筛选方法。
实验步骤1. 细胞的培养和分装将需要转染外源基因的细胞经过预处理后分装到96孔板中。
预处理的方法包括细胞数的调整、培养条件的优化等。
2. 转染外源基因将目标外源基因通过转染等方式导入到细胞中。
转染方法包括磷脂质体转染、病毒载体、基因枪等。
转染参数设置需要根据不同类型的细胞和外源基因来优化。
3. 抗生素筛选将不同类型的抗生素添加到分装好的细胞中，各种抗生素对应的筛选浓度需要根据实验的设计来确定。
筛选中心目的是筛选出稳定表达外源基因的细胞株，并筛选出能够在低浓度抗生素下存活的细胞株。
4. 稳定细胞株的测试和验证通过多次传代观察稳定细胞株的稳定性和表达效果，进行各项功能和表达水平的测定，如蛋白表达水平的检测、酶活性检测等，最终得到稳定的细胞株。
实验优化和注意事项1.在细胞分装前需要严格控制细胞数，以避免细胞过密或过稀的情况出现。
2.转染参数的设置需要根据细胞类型和外源基因进行调整，一般需要进行多次实验才能确定最佳的转染条件和过程。
3.实验中选用的抗生素应根据细胞特性和耐药性来确定，合理调整浓度以取得最佳的筛选效果。
4.稳定细胞株的鉴定需要进行多次测试和验证，其中包括蛋白表达水平、酶活性检测等。
实验结果和分析经过实验，我们成功地筛选出了稳定表达外源基因的细胞株。
经过多次传代和验证，细胞株的稳定性和表达效果得到了进一步的确认。
通过此次实验，我们发现抗生素浓度和稳定细胞株的筛选密切相关，合理选择抗生素种类和浓度能够有效地提高细胞株的稳定性和筛选效率。
本实验基于抗生素筛选的稳定细胞株筛选方法能够实现稳定表达外源基因的效果，为生物技术、药物开发等领域提供了有力的技术支持。
在实验设计和实验参数设置中需要严格控制，才能取得最好的效果。
转录因子E2F1及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立
行检测，如图 2 所示，Flag-E2F1 单克隆的 #6 细胞
株 和 Flag1-60E2F11E71032 单18克0 隆 的190 #2 细20胞0 株2分10 别 稳220定 表
达 Flag-1E602F1 1和70 Fla1g80-E2F1190E132 蛋2白00 且免210疫荧2光20 染色
（1. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2. 天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）
摘 要：通过细胞转染、药物筛选等方法，获得 Flag-E2F1 和 Flag-E2F1E132 稳定表达的 HeLa 细胞株，用蛋白印迹杂交和细 胞免疫荧光染色的方法对其进行鉴定。结果表明，本研究构建了 Flag-E2F1 和 Flag-E2F1E132 稳定表达的 HeLa 细胞株，这些稳 筛细胞株对于进一步寻找 E2F1 的关键下游靶基因十分重要。
·45·
E2F1 的关键下游靶基因的筛选具有重要意义。
同时，分别将对应细胞转移至 10 cm 培养皿，用 G418
1 材料与方法
1.1 材料
（750 μg/mL）进行筛选，挑取单克隆。通过 Western blot 检 测，将 能 表 达 Flag-E2F1 和 Flag-E2F1E132 的
HeLa 细 胞 和 pFlag 真 核 细 胞 表 达 载 体 由 天 津 师 范 大 学 分 子 细 胞 系 统 生 物 学 重 点 实 验 室 提 供；
Steri-Cycle 直 热 式 Forma CO2 细 胞 培 养 箱，Thermo 公 司；Mini P4 小 型 蛋 白 电 泳 仪，Bio-Rad 公 司；
亮氨酸（L）和 133 位天冬酰胺（N）分别替换为谷氨 酸（E）和丝氨酸（S），使其失去 DNA 结合能力 [6]。
一文搞定CHO稳转细胞株构建
一文搞定CHO稳转细胞株构建随着生物技术的迅猛发展,全球化资源整合为生物制药行业提供了越来越全面的技术支撑,抗体药物的发展也获得越来越多的重视。
抗体药物开发是一个非常繁杂的过程,而稳定细胞株适用于抗体药开发的各个阶段,如重组蛋白和抗体生产、检测分析、功能性研究等等。
构建适用于工业生产的高表达细胞株是第一步也是关键步骤之一。
普健生物在重组蛋白表达、抗体生产及稳转细胞株构建等方面有着10余年经验。
今天小普与大家分享一种基于CHO细胞株构建的高效抗体药开发策略,能显著提高细胞株开发效率,实现高效、稳定的细胞株开发。
CHO表达系统哺乳动物细胞是用于生产单抗在内的商业化治疗性蛋白产品的主要宿主细胞。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞,因为与其他系统相比,CHO细胞具有以下优点：①CHO 细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能,因此其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；②CHO 细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强,可根据培养要求选择贴壁培养或悬浮培养的方式；③整合外源基因后的细胞稳定,重组基因能高效扩增和表达；④表达目的蛋白可由细胞内运输到细胞外,并且CHO 细胞只表达少量的内源蛋白,有利于目的蛋白的提取。
GS筛选系统原理哺乳动物细胞的培养生长过程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺，哺乳动物细胞通过这一酶促反应获得谷氨酰胺。
CHO细胞内源的谷氨酰胺合成酶活性比较低,需要在培养基中额外添加外源谷氨酰胺才能促进细胞生长。
利用GS抑制剂,L-氨基亚砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制内源性GS活性，用含目的基因和GS基因标记的表达载体,转染宿主CHO细胞,通过MSX加压筛选，促使GS基因和目的蛋白基因扩增,只有转染了额外GS基因的细胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培养基中生长,从而筛选获得重组表达细胞株。
单克隆稳定株细胞构建实验方法说明
稳定株（单克隆）构建实验方法成功感染同时表达puromycin抗性和目的基因慢病毒的细胞，能在含一定浓度puromycin 的培养基中存活，而未感染上慢病毒的细胞则无法存活。
因此，在puromycin抗性筛选压力下，稳定表达目的基因的细胞株可被成功筛选获得。
如果慢病毒同时带目的基因或针对目的基因的shRNA，感染细胞并用puromycin进行筛选，即可获得稳定表达该目的基因或shRNA 的稳定细胞株。
对上述稳定细胞株进行稀释培养，挑取单一细胞生长而成的细胞克隆，再进行扩大培养，以获得性状单一、稳定的细胞株。
该实验常使用同时表达GFP的病毒对目的基因的表达进行示踪，以便于单克隆筛选。
实验仪器与材料仪器：CO2培养箱（MCO-15A SANYO）倒置荧光显微镜（XDS-100 上海蔡康光学仪器有限公司）超净台（EQR/GL-41 ESCO）离心机（TDL-50B 安亭）隔水式恒温培养箱（GHP-9080 Blue pard）；通风橱；材料：移液器（P1ml，P200，P20，P10，P2，GILSON；4415678，eppendorf）；吸头（10 µl ，100 µl ，1000 µl ，Axygen）；盖玻片（24×60mm）；培养板（3599 corning）试剂：培养基(RPMI1640 , 31800-012 Invitrogen或DMEM, 12800-017 Invitrogen)胎牛血清(10099-141 Invitrogen)0.25％胰蛋白酶D-Hanks液1.将目的细胞接种于48孔板中至70-80%融合度2.待细胞贴壁后，加入puromycin药物进行空细胞致死最低浓度筛选，一般药物浓度梯度设置为1ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml（终浓度）进行筛选3.药物处理48h后细胞全部死亡的最低药物浓度即后续稳定株筛选的药物使用终浓度4.将目的细胞接种于24孔板中，待细胞贴壁后进行慢病毒感染，感染后第二天，加入puromycin药物筛选，显微镜下观察存活细胞中示踪基因的表达，估算阳性比例。
CHO稳定细胞株开发步骤有哪些？稳定细胞株筛选原理详解
CHO稳定细胞株开发步骤有哪些？稳定细胞株筛选原理详解CHO（中国仓鼠卵巢）细胞株是目前最常用的哺乳动物细胞株之一，被广泛应用于生物制药、生物技术、疫苗制备等领域。
稳定细胞株是指在细胞培养中，将外源基因集成到细胞染色体中并稳定表达的细胞群体。
稳定细胞株具有表达稳定、重现性好等优点，可用于大规模蛋白质生产。
CHO稳定细胞株开发的主要步骤如下：克隆：选择具有高表达能力的基因，将其克隆到合适的表达载体中，如pcDNA3.1、pCDM8等。
转染：将表达载体导入CHO细胞中，使其表达外源基因。
转染方式有多种，如电穿孔、钙磷共沉淀、透析等。
筛选：利用筛选标记（如耐药基因或荧光标记）对转染细胞进行筛选，筛选出高表达的克隆细胞。
扩增：将选出的细胞进行扩增，直至获得足够量的细胞。
稳定化：将稳定的克隆细胞继续培养，保持其稳定表达目标基因。
鉴定：通过Western blot、ELISA等方法对细胞株进行鉴定，验证其表达目标基因的能力和稳定性。
在CHO稳定细胞株开发过程中，还需要注意培养条件的优化，包括培养基配方、温度、CO2浓度、氧气含量等。
此外，对于不同的目标蛋白，还需要针对性地优化表达条件和纯化方法。
稳定细胞株筛选原理及方法：稳定细胞株筛选是指通过对转染后的细胞群体进行筛选，筛选出稳定集成了外源基因并稳定表达的细胞株。
其基本原理是依赖于转染细胞后外源基因的选择性筛选和纯化。
常用的稳定细胞株筛选方法有两种：抗生素筛选法：将外源基因构建在带有特定抗生素耐受基因的质粒上，转染细胞后在培养基中加入相应抗生素，使只有带有外源基因的细胞能够在抗生素的选择压下存活，其他未集成外源基因的细胞则被杀死。
选择性标记物筛选法：外源基因构建在带有选择性标记物（如荧光蛋白、酶标记等）的质粒上，转染细胞后通过标记物筛选，筛选出带有外源基因的细胞群体。
选择性标记物可以使用光学显微镜、流式细胞仪等设备进行检测和纯化。
两种筛选方法各有优缺点，抗生素筛选法虽然常用但存在一些问题，如转染细胞的抗生素耐受性存在差异，有可能导致筛选结果的不确定性；而选择性标记物筛选法可以减少抗生素对细胞的影响，但其纯化效率较低，需要更复杂的实验设备和技术。
稳定株构建方法及注意事项
稳定株构建方法及注意事项
构建稳定株的方法
其实用脂质体转染、磷酸钙转染法等理论上是可以构建稳定株的，但这些方法整合入基因组的效率极低，很难成功。
而慢病毒可以携带外源基因随机整合进基因组，效率很高，是建立稳定株的最优方式。
构建稳定株的注意点
稳定株构建是个长期过程，从质粒构建到慢病毒包装，再到细胞感染及后期的筛选，每一步都至关重要，所以建立稳转株花个半年时间，也是常有的事，而且要承担病毒包装不成功，细胞感染效率低等风险。
稳转细胞株（系）构建方法
稳转细胞株（系）构建方法
稳转株即稳定表达细胞株，指的是基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。
慢病毒感染-药物筛选法是目前广泛应用的稳转株构建方法，具有高效整合、目标细胞广泛等特点。
稳定转染：
转染的质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。
需要在瞬时转染基础上对
靶细胞进行筛选或者应用高转染效率的病毒，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物进行细胞传代，
从而得到可稳定表达目的基因的细胞系。
筛选稳定细胞系有两种方法：
1）转染质粒后，筛选获得稳转细胞系；
2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。
慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
稳转株应用：
1）基因过表达服务
2）shRNA 干扰服务
3）miRNA过表达
4）任意非编码基因的过表达
稳转株构建中的常见问题
1.支原体污染问题
由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖，故被许多实验室所忽略。
但支原体易在病毒感染细胞后爆发，出现大量细胞碎片，甚至导致细胞死亡，导致稳转株筛选的失败。
我们建议在稳转株构建之初，务必排除细胞及培养环境中的支原体污染（赛业可提供稳定细胞株构建）。
2. 其他问题
除支原体污染之外，还有以下问题会经常出现于稳转株构建中。
构建稳转细胞株命名
构建稳转细胞株命名
构建稳定细胞株是生物学研究中常见的实验操作，命名稳定细
胞株时需要考虑以下几个方面：
1. 表达载体或基因的命名，如果稳定细胞株是通过转染表达载
体或基因来构建的，可以在命名中包含表达载体的信息，比如
pCMV-EGFP稳定细胞株表示该细胞株是通过pCMV载体转染表达EGFP
基因构建的。
2. 细胞类型，稳定细胞株所使用的细胞类型也可以作为命名的
一部分，比如HEK293稳定细胞株表示该细胞株是在HEK293细胞中
构建的。
3. 转染方法，有时候稳定细胞株是通过特定的转染方法构建的，比如利用CRISPR/Cas9技术构建的稳定细胞株可以在命名中体现出来。
4. 蛋白功能或特性，如果稳定细胞株是用于研究特定蛋白的功
能或特性，可以在命名中体现出该蛋白的名称或功能，比如EGFP-overexpressing HEK293稳定细胞株表示该细胞株是用于过表达
EGFP蛋白的。
5. 序号或日期，为了区分不同的稳定细胞株，可以在命名中加入序号或日期信息，比如pCMV-EGFP-HEK293-1表示第一个构建的pCMV-EGFP稳定细胞株。
总之，在命名稳定细胞株时，需要清晰明了地体现出细胞株的基本信息，方便其他研究人员理解和识别。
同时，命名需要简洁明了，避免过于复杂的命名方式，以免造成混淆。
稳定细胞株 构建
稳定细胞株构建稳定细胞株的构建是分子生物学和基因工程学领域中的重要技术之一。
它是研究基因在体内作用和基因功能的实验研究中必不可少的工具。
稳定细胞株指细胞在一定条件下能够长期稳定地表达特定基因的细胞系。
本文将从稳定细胞株的定义、构建方法、选择与鉴定等方面进行介绍。
一、稳定细胞株的定义稳定细胞株是指在体内、外转染过程中，选用合适的筛选、克隆和鉴定方法后，成功获得细胞固有基因改变或是外源DNA转移并集成到基因组的一种特殊细胞株。
与病毒感染后获得的短暂性表达不同，这种稳定细胞株能够持续稳定地表达需求的基因，从而称其为经过稳定转染的细胞株。
这种细胞株的构建对于探究生物分子的功能及其相关基因及信号通路的研究具有非常重要的意义。
1. 选择适当的载体：要构建稳定细胞株首先需要选择合适的载体，常用的载体有质粒、病毒、人工染色体等。
选择载体的关键是该载体能否满足待表达基因的大小、结构和表达水平要求。
2. 转染DNA：将表达目的基因的DNA载体导入到目标细胞内，并带入一个选择性基因，用来区分携带目标DNA的细胞和不携带的细胞。
转染方法可以选择化学法、电转法、导出法、生物法等。
3. 筛选细胞：待转染完成后，可以通过添加对应抗生素或药物，选择对基因表达有利的细胞，最终选择转染成功且能够稳定表达目的基因的细胞。
4. 克隆稳定细胞株：将稳定表达目的基因的单个细胞进行克隆成纯种，常用方法有限制性酶切，PCR扩增等。
5. 筛选和鉴定：对克隆的细胞进行筛选和鉴定。
其中，鉴定的指标需要依据实验需要进行调整，如基因表达水平、蛋白质水平等。
同时，也需要确保稳定细胞株在长期维护中能够稳定表达目的基因。
选择稳定细胞株时，需要确保细胞具备稳定性、高的表达水平和特异性。
同时，还需要有合理的对照组。
常用的鉴定方法有：Western blotting、流式细胞术等。
四、一些常见的问题1. 容器类型：选择扁平形状且易于吸附细胞的容器，如96孔板、24孔板等。
稳定细胞株构建流程
稳定细胞株构建流程
构建方bai法：先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA 中的抗性标志来筛选该细胞系，就行成了稳定表达的细胞株。
细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finite cell line)，如可以连续培养，则称为连续细胞系(continuous cell line)，培养50代以上并无限培养下去。
细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。
从培养代数来讲，可培养到40-50代。
细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。
对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。
扩展资料：
一般流程
1、筛选浓度测定：以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；
2、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。
进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖；
3、细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6 ）；
4、利用质粒上含有的抗性选择进行筛选；
5、鉴定筛选结果。
稳定表达细胞株的构建注意事项
稳定表达细胞株的构建注意事项
1. 长期在目的细胞中研究基因功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究；
2. 部分蛋白半衰期极长，瞬时 RNA 只能干扰表达，无法去除已经表达的目的蛋白，通过构建稳定株可以实现更好的基因干扰效果；
3. 瞬转往往会引入极高拷贝数的表达，导致因为人为因素造成实验结果的不精确，构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究；
4. 需要用诱导表达系统的，主要是一些致死基因或者是需要时空表达的；
5. 需要用细胞做动物实验的，比如裸鼠成瘤等，往往需要构建成稳转株。
(完整word版)Vigene稳转株构建流程
Vigene 稳转株建立流程稳转株即稳固表达细胞株，指的是鉴于某一细胞系建立的连续过表达或扰乱某特定基因的细胞系。
慢病毒感染 -药物挑选法是当前宽泛应用的稳转株建立方法，拥有高效整合、目标细胞宽泛等特色。
一．准备及预实验1.确立细胞系有关信息，需包含以下内容目标细胞系培育条件目标细胞增殖速度支原体污染状况注：为防止慢病毒感染后细胞死亡，务必保证细胞无支原体污染！2.预实验确立 MOI 值（1）查阅文件确立慢病毒在目标细胞系中的 MOI；（2）参照察阅获取的数据，设计梯度实验，探索最适MOI。
3.预实验确立挑选药物用量：（1）查阅 Puromycin/Blastincidin 等在目标细胞系中稳转株挑选的致死用量信息；（2）参照察阅获取的数据，确立 3 个药物浓度梯度（如没有有关信息，则需将药物浓度梯度范围增大，数目增加至 6 个）；（3） Day0 将细胞铺于 6 孔板中，使 Day1 细胞交融度约 90%；（4） Day1 按（ 2）中设置的药物梯度，加入药物；（5） Day4 换液，并从头加入药物；（6） Day7 察看，找到致死率 100%的孔，该孔使用的药物浓度，即为药物筛选浓度。
附 1：经验挑选药物用量二．稳转株挑选及建立注：以下实验参数，按 1 株稳转株为例描绘，实验需考虑有无比较稳转株！4.细胞铺板：将细胞接种于 6 孔板中（ 4 个孔），使第二天细胞交融度约 70%5.病毒感染：依据预实验确立的MOI 值，计算慢病毒体积，增添慢病毒（每孔增添ADV-HR 2μL）；6.换液：慢病毒感染第二天，将细胞进行换液办理；7.察看感染效率：感染后 72 小时，察看感染效率，效率最低不该低于 40%。
8.挑选：（1）多克隆稳转株：从感染 72 小时后开始于 6 孔板中加挑选药物，每隔 2 天，从头换液加入药物。
药物挑选需起码连续 14 天，直至显微镜下察看荧光细胞比率为 100%。
注：第一次加入药物时在上午进行，4-6 小时后察看细胞状态，如细胞死亡过多，需改换新鲜不含药物的培育基。
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稳定株构建FAQ(慢病毒包装)1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。
这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。
不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。
2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：1)，外源插入片段的拷贝数。
多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。
2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。
3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。
最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。
4)，整合后的稳定性。
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。
5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。
3，什么时候需要稳定细胞株？答：以下实验，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求：1)，外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。
虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率，但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。
而非分裂细胞，可以使用腺相关病毒载体转导外源基因，因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。
2),需要构建使用诱导表达系统，这主要是由于：a.过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素;b.目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。
3),希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数，以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。
构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。
3)，部分细胞种类，病毒载体亦无法达到高转导效率，通过构建稳定株，达到外源片段的高效表达。
4)，长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究。
5)，部分蛋白稳定性极强，瞬时RNA干扰因为作用周期短，只能抑制目的基因的表达，但无法去除已经表达的目的蛋白，所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。
6)，需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。
需要构建稳定细胞株，以防止注射入动物体内后，很快外源片段表达丢失。
7)，细胞个体差异(同一类细胞，不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰，需要构建单克隆细胞株去除干扰。
8)，需要将外源片段插入基因组中，比如基因敲除，基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。
4，什么时候不需要构建稳定株？答：以下实验不需要构建稳定株：1)，希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果。
例如在正式实验之前进行的小规模预实验。
2)，2-4天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的，比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用，或者观察某些细胞周期抑制，凋亡或细胞存活相关基因的细胞表型。
3)，细胞个体差异对实验结果有影响。
体外培养非原代细胞，多为转化细胞系或者癌细胞，细胞个体差异大，瞬时转染或者使用腺病毒/腺相关病毒载体进行转导更可以反映细胞群体行为。
或者使用逆转录病毒载体构建混合稳定株。
5，病毒载体构建稳定细胞株有什么优势？答：化学试剂介导的转染方法和电转，整合率低，同时整合位点不稳定，易发生再次丢失的情况，而且整合位点一般都在转录活跃区之外，所以并不是理想的稳定整合工具。
另外，整合后的拷贝数是由核内的外源DNA局部浓度，而不是转染时的DNA的量决定，而化学方法在输入质粒载体入核的效率比电转和病毒载体相比要低得多，导致其转染相同细胞所用质粒载体用量要大大高于其它方法，造成入核质粒载体量难以控制，这也解释了为什么化学转染方法和其它两种方法比，更倾向于得到串联多拷贝。
以上种种因素，导致使用非病毒载体转染方法构建稳定株，成功率低，稳定性差，稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等缺点。
逆转录病毒载体由于整合率高，是非常理想的稳定株构建工具(表1)。
而且通过控制逆转录病毒载体转导的实验条件，理论上可以确保每个细胞只有单拷贝插入。
同时由于病毒载体是通过病毒重组酶将外源片段整合入染色体中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于转录活跃区段，且整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基因组中。
最重要的是整合几率和所有其它化学，物理转染方法比，增加5至6个数量，使得稳定株构建不再成为实验研究的障碍。
由于整合几率非常高，所以很容易获得混合稳定株。
表1:不同转染方法介导的稳定整合参数比较腺病毒载体整合率和普通转染方法差异不大，被认为是不能整合的一类病毒载体，因此相关研究数据较少，不建议用来构建稳定株。
非野生型腺相关病毒载体(Rep-)整合率较低，但因为野生型病毒载体可以定点将病毒基因组整合于人19号染色体，所以从安全性和稳定性角度来说，潜力都非常巨大。
由于诸多因素，研究人员仍然在对其进行改造中，包括考虑到啮齿类动物不含有人19号染色体对应的整合位点序列。
6，筛选稳定细胞株的方法主要有哪些？答：主要有三类方法：1)，单克隆环法：此类方法多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株的实验。
其优点在于工作量小，只需将转染或者病毒载体感染后的细胞按照一定的细胞密度转移至新皿中，并使用合适的药物进行筛选，最后在克隆环的帮助下对单克隆细胞株进行挑选，并在新皿中完成扩增。
缺点在于需要对细胞密度和药物浓度绘制致死曲线并选取合适的细胞密度和药物浓度进行筛选，一些细小的密度和浓度差别都会导致难以获取均一的单克隆，结果导致获取的克隆不纯，含有非整合的细胞。
稳定整合的细胞在这样一类混合细胞中，很快会失去生长优势，最终导致失去稳定株。
2)，96孔单克隆稀释法：此类方法同样多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株以及筛选悬浮细胞稳定株的实验。
其优点在于，理论上可以得到非常均一的单克隆，同时可以筛选悬浮细胞稳定株。
其缺点在于，工作量比较大。
3)，逆转录病毒混合克隆制备法：此类方法适用于需要制备混合稳定株。
优点在于可以在短时间内(1周)获得稳定细胞株，同时也可以随时将细胞稀释转移至新皿中获得单克隆细胞株。
缺点在于需要制备逆转录病毒载体。
思路迪公司的研究人员开发出快速制备病毒并获得稳定细胞株的技术，帮助科学家们迅速获得稳定株。
7，为什么常规转染方法筛选稳定株异常困难？答：常规化学转染或者电转方法，其整合是非同源重组随机整合，几率非常低(10-8-10-6)，且这些转染条件下发生的整合多发生在转录非活跃区或者重复序列区，导致外源片段表达效率低，同时这些整合常常不稳定，随着传代次数的增加，即使在有压力选择的情况下也容易发生丢失。
8，为什么病毒载体介导的稳定株筛选方法效率要比常规方法高？答：逆转录病毒载体的染色体整合依赖于病毒重组酶，是一个酶催化反应，因此效率相比随机整合要高多个数量级。
而且整合位点多位于转录活跃区，因此表达效率高。
同时其整合非常稳定，连续传代100代以上仍然保持稳定表达。
9,如何选择适合的病毒包装类型进行稳定株筛选？答：并非所有的病毒载体都适合用来进行稳定株筛选(表六)，首先需要挑选整合效率高，整合位点稳定的病毒载体。
至今为止，逆转录病毒载体是最有效的可以介导基因整合的病毒载体。
其次，依据具体实验要求，挑选不同整合位点倾向性的逆转录病毒载体。
倾向于整合于转录起始位点附近的，容易造成下游基因的激活;而整合于转录活跃基因内的，容易导致整合区基因的插入失活。
10,病毒载体介导的稳定株筛选方法可以适用于任何靶细胞吗？答：虽然普通的逆转录病毒载体可以用来进行稳定株的构建，然而这一类病毒载体并不能高效感染非分裂细胞，因此对于这一类分化细胞，可以使用慢病毒载体进行稳定株构建。
也可以使用腺相关病毒载体高效感染非分裂细胞，这一类病毒载体虽然整合率低于慢病毒载体，但其可以以染色体外形式长期(数月至数年)存在于非分裂细胞中，因此可以避免进行稳定株筛选。
11,思路迪提供的含有病毒载体元件的细胞稳定株的安全性如何？答：这些病毒载体在整合入靶细胞后，缺少必要的病毒包装元件，产生功能性病毒的几率非常低，因此进行体外细胞实验或者动物实验时，很安全。
不过，即使如此，对这些携带有病毒载体元件的细胞株处理也要按照标准废弃病毒载体操作流程执行。
12,为什么稳定株构建服务中不使用腺病毒载体？答：腺病毒载体由于其整合几率极低，被普遍认为是不具备整合能力的病毒载体，所以一般不用来进行稳定株构建。
13,单克隆稳定株和混合克隆稳定株有什么区别？我该选择哪一类用于我的实验？答：单克隆稳定株顾名思义来源于含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增，而混合稳定株则由多个单克隆稳定株构成的克隆群，不同的单克隆其外源片段的整合位点不一样。
由于体外细胞多属于细胞系，其基因组呈现不稳定的特点，因此即使是同类细胞，不同细胞个体基因组背景都存在差异。
当需要去除细胞群体干扰因素的时候，推荐使用单克隆稳定细胞株，其基因组背景相对单一，对实验结果干扰因素小。
当进行系统生物学研究时，多考虑这类因素。
同时也是由于不同细胞个体差异大，而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞行为可能不一致，所以许多实验使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰。
混合稳定株可以通过逆转录病毒直接筛选获得，或者通过讲众多不同的单克隆稳定株混合获得。
前者无论是是从质量，还是时间周期来看都更好。
14,怎么判别筛选的稳定株是单克隆？答：1)，如果外源片段含有荧光标记，可以直接使用流式细胞仪检测其荧光是否均一;如果还有其它标签，可以进行免疫荧光标记，再使用流式细胞仪观察荧光分布是否出现均一峰值。
因为不同单克隆由于整合位点不一样，其表达强度也会受附近染色体结构的影响，出现差异。