第九章 植物细胞培养_PPT幻灯片

第二节 细胞悬浮培养
细胞悬浮培养是使离体的植物细胞悬浮在液 体培养基中进行的无菌培养。建立在愈伤组织的 液体培养技术基础上。目前已发展到全自动控制 的大容积发酵罐的大规模工业生产的连续培养。 为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验 系统。
一、前期准备
1、愈伤组织诱导
材料自来水冲洗——75%的乙醇擦洗——将 材料切成小块（带形成层）——接种到MS+2,4-D 2mg/L+CH 500mg/L+琼脂0.8%,pH5.8的培养基 上——得愈伤组织——扩大繁殖。 2、单细胞悬浮液的制备
封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基 由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡， 从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生 长的需要。
悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培 养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间 延长，细胞密度不断增加。
开放型连续培养：为了不使限制细胞生长的因子出 现，创造一个稳定的细胞生长的环境，必须建立一 套自动控制系统来调节培养基注入的数量和培养液 的总体积。
细 胞 数 目
静止期 缓慢期
直线生长期
延滞期
对数增长期
时间
细胞生长周期
（二）半连续培养
指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液， 并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复 地取得大量、均一的培养细胞，供生物研 究之用。
（三）连续培养
是利用特制的培养容器进行大规模细胞培 养的一种方式。
在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并 注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分 补充，保持其恒定体积的培养。
二、培养类型和方法
（一）成批培养 指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养， 当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细 胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生 化研究常用的培养方法。
1、成批培养法
（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的 养分为细胞耗尽为止。 （2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在 培养基中的均匀分布。 （3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈 现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。 （4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外 进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞 和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养 瓶里，继续进行培养。
第一节 第二节 第三节 第四节
单细胞培养 细胞悬浮培养 植物细胞生长和活力的测定 植物细胞培养的应用
植物细胞培养，即对植物器官或愈伤组织 上分离的单细胞(或小细胞团)进行培养， 形成单细胞无性系或再生植株的技术。
第一节 单细胞培养
一、定义 单细胞培养：对分离得到的单个细胞进行培养，诱导
其分裂增殖，形成细胞团，再经过分化形成芽、根 等器官或胚状体，甚至长成完整植株的技术。 二、意义 1、建立单细胞无性系 2、对培养的单细胞可以诱发突变 3、排除体细胞干扰 4、遗传转化受体的建立
在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流 出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定， 并通过调节流入和流出的速度，使细胞的生长速度 一直保持在一个稳定状态，流出的细胞相当于培养 系统中新细胞的增加数。
3、为了保持在开放连续培养中细胞增殖的稳定性， 采取的控制方法： （1）浊度恒定法 （2）化学恒定法
愈伤组织转移到液体培养基中——4r/min转 床培养10d——140m×140m的细胞筛过筛——使 细胞密度达到10 个/ml左右——得单细胞悬浮液。
在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、 适合悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法是： （1）从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快 的浅色愈伤组织。 （2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。 （3）接种在固体培养基上培养2周。 （4）挑选生长快的细胞株并继代培养。 （5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定， 筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。
为了加速细胞增殖，有的甚至在对数生长期 末就进行继代。
四、培养细胞的同步化
同步培养：在培养基中大多数细胞都能同 时通过细胞周期的各个阶段，同步性的程度 以百分百分数表示。
Fra Baidu bibliotek
实现悬浮培养细胞同步化的方法：
1、饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分 裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期 或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养 基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同时进入 分裂。
三、悬浮细胞的继代
在悬浮培养中，为了保持一定的悬浮细胞增 殖速度和增殖量，应定期做继代培养，最适的周 期一般为1-2周。但实际所需的时间和接种量应 视不同细胞系而定。
继代时间为1周的细胞系可用1：4的接种量， 继代时间为2周的可用1：10的接种量。
在悬浮培养中，细胞刚进入静止期之初，细 胞悬浮液达到最大量，就必须进行继代培养。因 为处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长会引起 细胞的大量死亡和解体。
（二）微室培养法 人工制造一个小室（载玻片和盖玻片），将单细胞
培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团 的方法。小室可通过毛细管与外界通气，便于观察。
注意载玻片厚度1mm，微室厚度最好不超过20um， 盖玻片厚度在0.17-0.18mm左右，观察效果才好。
（三）平板培养法 平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基
1、连续培养的特点 （1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充 分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。 （2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。 细胞增殖速度快。 （3）适于大规模工业化生产。
2、连续培养的种类
封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。 开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。
均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方 法。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培 养。
步骤： 1、单细胞悬浮液的制备 2、悬浮细胞密度的调制 3、琼脂培养基的配制 4、平板制作 5、培养
（四）条件培养基：在培养基中加入高密度的细胞 进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分 泌一些物质，使培养基条件化。 方法：把液体培养基中培养了4-6周的高密度细胞 过滤掉，将其培养基制成液体培养基或固体培养基 来培养单细胞或低密度细胞群体，这样可明显提高 单细胞培养物存活和分裂的能力。