巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用
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有一个外源基因 /65 等。通用的整合载体多含有 ! "#$ 启动子 ， 和一个从 ! "#$ 基因上拷贝下来的 终 表达框、 多克隆位点（ %&’ ） ， 作 为 筛 选 标 记 的 ()*+ 基 因 和 在 细 菌 中 进 行 复 制 起 止序列（ 77） 始点和选择标记（ 如 )89:5 复 制 起 始 点 和 抗 氨 苄 青 霉 素 基 因 ） 以 使外源基因能以同源重组的方式整 及 ! "#$ *;的非编码区序列， 合到染色体的 ! "#$ 部位（ 表 5） 。
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巴斯德毕赤酵母表达系统研究系统进展
➢翻译后修饰
毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差 异而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的应用受到 一定的制约。它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而 失去效能，而且有引起超敏反应的危险性。
解决糖基化策略：
①尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化；
②对非活性中心的糖基化位点进行突变改造，清除糖基 化；
稀有密码子制约翻译速率
此时需要进行全基因的合成，使编码序列 符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的
➢基因剂量
相对剂量效应
一般情况下，随着整合拷贝数的增加，表达量也会增加， 例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比例升高。 但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上 升反而减少，这可能与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关。
重组子在酵母细胞中的命运
导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到 染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：
（1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和 3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤 酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶 只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲 醇利用缓慢，表型为Muts。
若整合发生在his4位点处，可能出现表达单 元丢失现象，这可能是由于基因组中突变的his4与表 达单元中的his4基因之间发生了基因转换（gene conversion）所致，所以一般选择AOX1位点整合。
his4
用于转化子筛选的基因标记
用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养 缺陷型互补基因和显性基因：
二、巴斯德毕赤酵母简介
Pichia pastoris
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能 够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效 诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达， 因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属 强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵 母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵 母没有合适的自主复制型载体，所以外源基 因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA 上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功 表达。
巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用
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基上生长 % 上述宿主菌经过进一步改造 $ 还可得到其他衍生的宿 主 菌 $ 目 前 已 有 十 几 种 不 同 的 基 因 型 % %Vh<<;C !?(AE @9@E
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毕赤酵母表达载体
毕赤酵母表达载体包括自我复 制 型 的 游 离 载 体 和 整 合 型 载
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外源蛋白在毕赤酵母中的表达
毕赤酵母表达系统表达外源蛋白的一般步骤 首先合成或克隆目的基因 " 如果选 用 分 泌 型 表 达 载 体 " 则 外
体 " 但以整合型载体为主 ! 常见的整合载体又分为胞内表达和分 泌表达 % 类 ! 胞内表达的载体有 &’()* #&’(+*, #&’(+*-., #&/(01
基因 !"# ! 同时说明了酵母菌体内微体对合成蛋白质的作用 " 从启动子类型 # 启动强弱 # 终止子及信号肽等方面对整合型载 体做了详细的介绍 " 在外源蛋白表达方面 ! 简要介绍了表达过程 ! 重点讨论了如何防止外源蛋白降解 ! 对影响毕赤酵母高效 表达的因素做了扼要论述并提出了相应的解决方案 " ! 关键词 " 巴斯德毕赤酵母 $ 表达载体 $ 表达蛋白 ! 中图分类号 "
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巴斯德毕赤酵母新启动子PGCW14的调控结构和应用研究
摘要巴斯德毕赤酵母表达系统是分子学领域内被广泛应用于重组蛋白生产的主要系统之一，既具有操作简单，生长快等特点，又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。
在外源蛋白表达系统中，影响蛋白表达的一个主要因素是启动子活性。
启动子作为基因表达的重要调控元件，通过与转录因子相互作用控制基因转录的起始和表达水平，在转录水平上起重要作用，因而启动子活性的高低在很大程度上影响着蛋白的表达水平。
在毕赤酵母表达系统中，醇氧化酶基因的启动子P AOX1是最常用的启动子，已实现了各种外源蛋白的高效表达尤其是人源蛋白的表达。
但P AOX1是甲醇诱导型启动子，在食品、医药上的应用受到限制，且甲醇的储存和运输等存在火灾隐患，因此毕赤酵母非甲醇诱导的启动子在不断被开发。
根据本实验室对毕赤酵母转录组的研究数据，在以甘油为碳源的培养基中，转录水平最高的是被命名为GCW14(NCBI编号：XM_002490678) 的细胞壁蛋白基因，该基因为组成型表达，推断GCW14具有潜在的高活性启动子。
此外，根据已有的实验数据证明：敲除毕赤酵母基因组上的GCW14基因会降低以Gcw14p为锚定蛋白的CALB的表面展示酶活力，说明壁蛋白Gcw14p与外源蛋白表面展示的效果有关。
本研究将壁蛋白Gcw14p的启动子P GCW14应用于南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的毕赤酵母表达中，并与启动子P AOX1、P GAP、P TEF1的活性进行比较；对P GCW14启动子进行突变，初步探索该启动子的作用元件；将活性提高的突变启动子应用于CALB的表达中，提高CALB的酶活力，也为提高毕赤酵母外源蛋白的表达奠定基础。
主要研究内容如下：(1)为了比较P GCW14和其他3种启动子P AOX1、P GAP、P TEF1表达CALB的能力，构建了4种不同启动子的CALB表面展示重组菌：X33/ pPG14-CALB、X33/pZαA-CALB、X33/pPGAP-CALB和X33/pPTEF1-CALB。
毕赤酵母表达系统
毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。
抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。
毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。
GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。
转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。
培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。
在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。
贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。
注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。
以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。
载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。
如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。
单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。
介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。
关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。
2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。
绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。
后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。
巴斯德毕赤酵母
3.实验方法及结果 4)诱导表达及表达产物分析
Байду номын сангаас
GS115/F 3
GS115/F 3
3.实验方法及结果
5)重组毕赤酵母基因组的提取和 PCR鉴定阳性克隆
提取高产菌 GS115/F 3 和出发菌株 GS115/F 2 的基 因组 DNA，加入 RNase A 消除 RNA 的干扰。 以pPICZαB 质粒上的抗性基因，即 Zeocin 基因 为扩增目的片段设计引物 对提取的酵母基因组 DNA 进行 PCR 扩增验证
③下层硝酸纤维素薄膜取出，5％脱脂奶封闭 2 h ，用 TBST 洗膜 5 min，重复 3 次。用兔抗人血清白蛋白多抗 37 ℃孵育 2 h，用 TBST 洗膜 5 min，重复 3 次。
用二抗结合，37 ℃孵育 2 h，用 TBST 洗膜 5 min，
重复 3 次。加入新鲜配置的 DAB 显色液，染色
(2) 分泌型表达载体主要有 pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、 pYAM75P 等。由于毕赤酵母本 身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌 到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及 积累。
毕赤酵母同源重组的原理及目的基 因整合方式
通过转化 DNA 与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组， 毕赤酵母可产生稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无 选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现 出极度稳定性。常用的表达载体都含有 HIS4 基因，编码 组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化 以后，可在 AOX1 或 his4 位点进行同源重组， 从而产生 HIS+重组子。
3.实验方法及结果
6) Q-PCR 鉴定高产菌的目的基因拷贝数
设计基因 gapdh 、ggh片段引物 PCR 回收基因片段
重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达
重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要人血清白蛋白是一种在医学上应用广泛，需求量大的蛋白质药物。
而目前血浆提取生产的方式难以满足市场的要求，用基因工程方法生产人血清白蛋白无疑具有巨大的商业价值。
由于巴斯德毕赤酵母表达系统自身的许多优点，使得其在表达外源蛋白中具有十分大的优势。
本文的工作是用巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵纯化条件进行初步研究。
在构建高产人血清白蛋白的基因工程菌时，采用了分泌型表达质粒pPIC9K构建成质粒pPIC9K-hsa。
构建的质粒经线性化后电转化整合进入毕赤酵母GS115染色体AOX1基因中，通过MD/MM平板筛选出his+Mut s型菌株。
在此基础上，用G418平板筛选出高拷贝表达子。
BMGY/BMMY摇瓶培养对不同的拷贝子进行筛选，发现随着拷贝子的增加表达量增加。
其中菌株GS115-rHSA-8表达量最高。
免疫印迹检测所表达的rHSA具有免疫原性。
采用工业基础盐培养基，用摇瓶对发酵条件进行了实验研究。
结果表明，组氨酸的加入量为0.15g/L时，蛋白表达量增加57.1%；加入0.10%体积比油酸时，蛋白量可增加43.4%；甲醇浓度控制在0.5％体积比左右时可以获得高产量，甲醇的加量超过1%体积比时，会对蛋白的分泌表达产生抑制，在2%时已经比较明显；甲醇诱导时添加甘油时可以提高产量，但当甘油添加量达到0.2%体积比时甘油已产生抑制表达作用；诱导表达时硫酸铵浓度为7g/L时蛋白浓度最高，高于9g/L时已开始出现抑制表达作用；改变培养时发酵液的pH为7.0，诱导表达时添加 1.5%的YP(Yeast extract,5g/L; Peptone, 10g/L)均可以有效的控制rHSA的降解，而温度对蛋白的降解没有显著性影响。
另外，添加100μm的PMSF也对降解有较好的控制作用，但因为毒性原因其安全性值得评价。
甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍
甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、
被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。
目前通过毕赤
酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭
建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越
来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。
1.其优点主要为：
1) 具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；
2) 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，
从而使表达出的蛋白具有生物活性；
3) 营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4) 可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上； 5) 表达量高，许多蛋白可达到g/L以上水平；
6) 在P. pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，
自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；
7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae相比，P. pastoris不产生过度的糖基化。
P. pastoris表达的糖蛋白的糖链长度为8-14个甘露糖，而S. cerevisiae 糖链中甘露糖多达50-150个；S. cerevisiae分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有终端α-1，3糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明
显增强，而P.pastoris的糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌
的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。
巴斯德毕赤酵母表达系统
外源蛋白的引入表达
菌株类型
Mut表型与甲醇利用率
Mut 5’AOX基因 3’AOX基因 表型 存在 存在 正表型 缓慢型
Mut+ 存在 Muts 缺失
Mut- 缺失
缺失
负型
选择过程
HIS4缺陷培养基 G418酵母培养基
导入质粒
低
高
G418：是一种氨基糖苷类抗生素，Kanamycin抗性 基因能对抗G418对酵母的毒性
结构特点
一、单细胞微生物
1、兼性厌氧菌，易于进行遗传操作和培养 2、具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、 折叠、二硫键的形成和糖基化，可以获得高产量 的蛋白
二、微体（也称过氧化物酶体）
1、 合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降
解，亦不会对细胞产生毒害
2、在微体中，有大量过氧化物酶合成，甲醇代谢的 第一步就是在其中进行的，这样可以避免甲醇在 AOX催化下产的H 0 对细胞的毒害。
4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离
5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修 饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露 糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3 连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用 于临床应用 6、使用方便、简单，而且成本较低
• 80年代由Philips pertoleum公司合作开发毕赤酵 母表达外源基因的研究。研究人员分离了醇氧化 酶（AOX）的基因和启动子，构建了载体和菌株， 开发了毕赤酵母基因操作的相关技术。
• 1993年Philips pertoleum公司委托Invrtigone公 司代理毕赤酵酶（AOX）
甲醇
AOX
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略1.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。
近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。
越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究。
P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。
但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound proteases）和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的。
胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。
胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养。
根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）。
表1.2毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathwayEnzyme Type Gene Zymogen formVacuole PrA Aspartic PEP4 YesPrB Serine PRB1 YesCpY Serine PRC1 YesCpS Metallo-( Zn2+) CPS1 UnknownApI Metallo-( Zn2+) LAP4 YesApCo Metallo-(Co2+) DAP2 NoDPAP-B Serine SEC11 UnknownSecretory pathway signal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 Yes Kex1 carboxypeptidase Serine KEX1 NoDPAP-A Serine STE13 Unknown,predict noYeast as partyl protease ш Aspartic Y AP3 Unknown,predict yes酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述
毕赤酵母启动子以及诱导物
启动子 诱导表达 AOX1，AOX2(甲醇氧化酶) 以甲醇诱导表达 GAP （3 一磷酸甘油醛脱氢酶） 葡萄糖组成型 表达（甘油或甲醇诱导产量只有2/3，1/3） FLD1（甲醛脱氢酶） 以甲基化胺为氮源 (葡萄 糖为碳源)，甲醇为碳源 (硫酸铵为氮源)表达 PEX8（过氧化物酶体基质蛋白） 以葡萄糖、 甲醇诱导表达 YPT1（GTP酶） 以葡萄糖甲醇、甘露糖醇组 成型表达
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的 表达种类
具有代表性的如下列一些外源蛋白质P.pastoris中已经获得高效产 生： (1)蛋白酶类，如人溶菌酶、人胃促胰酶、葡萄糖苷酶等； （2）激素类，如胰岛素前体、人绒毛膜促性腺激素、鲤鱼生长激 素等； （3）受体、抗体及单链抗体等生物活性蛋白； (4)抗原类，如乙型肝炎表面抗原、破伤风毒素片段C、登革热病 毒E蛋白等； (5)细胞因子类，如肿瘤坏死因子、表皮生长因子、血管生成抑制 因子等； （6）酶制剂类，如植酸酶等； (7)病毒蛋白类，如乙型脑炎病毒E蛋白、伪狂犬病病毒Ea株gE蛋 白等
毕赤酵母的优点
利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。 外源蛋白基因遗传高稳定性，外源蛋白质具有一定程 度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋 白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备 有功能的蛋白质。
毕赤酵母发酵工艺对产量的影响
甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶 段，即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。 酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，另 一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径，并使 细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。 蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源 和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基 因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因 的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
第28卷第1期 农业科学研究2007年3月 Vol.28No.1 Journal of Agricultural Sciences Mar.2007文章编号:167320747(2007)0120068204巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展魏凡华1,2,3,曹瑞兵3,吴 润1,陈溥言3(1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021; 2.甘肃农业大学,甘肃兰州 730071;3.南京农业大学农业部疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京 210095)摘 要:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pasto2 ris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述.关键词:巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;研究进展中图分类号:TQ926.1 文献标志码:A 目前,大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟,但表达产物以包含体形式存在,无翻译后的糖基化等修饰加工过程,并且可能还会有细菌毒素.昆虫细胞表达存在不正确的糖基化,产物复杂,不易纯化,而哺乳动物细胞表达成本高,产量低.甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)已发展成为能够生成多种外源蛋白的卓越表达系统.1 巴斯德毕赤酵母菌株一般用于外源基因表达的Pichi a p astoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,KM71,SMD1168等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为3型[1]:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为Mut+表型.②Muts型,此型毕赤酵母(如KM71)菌细胞AOX2基因编码的醇氧化酶可依赖15%AOX活性,为甲醇慢利用型.③Mut2型(如M2G10023),此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用型.研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163, SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解.一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用.甲醇慢利用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量[2].2 Pichi a p astoris表达载体载体是由许多元件构成的,包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点和信号肽序列等,典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5′AOX1启动子和3′AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因HIS4作为互补筛选标志或ZeocinR作为筛选标志.2.1 启动子Pichia pastoris含有两个基因编码醇氧化酶: AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表达水平高于AOX2.AOX1启动子的表达受甲醇严格调控[3].以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA 由AOX1基因转录.P GA P(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,GA P启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单.Vassilen利用GA P启动子表达乙肝表面抗原获得高表达[4],Genzyme也利用GA P启动子表达人几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解[5].Phongdara在H ansenul a pol y mor p ha克隆到酸性磷酸酶(p HO1)基因启动子[6].这些启动子丰富了甲醇酵母对启动子的选择.2.2 选择标记选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因,常用HIS4,也可用来源于酿酒酵母的AR G4基因和SUC2基因.kanr基因和Shbler基因能够作为细菌和酵母菌的选择标记,因此较其他表达载体更易于筛选.2.3 信号肽序列可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的收稿日期:2006205220作者简介:魏凡华(19802),男,宁夏隆德人,硕士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究.信号肽和酵母本身的信号肽.有些蛋白的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可试用甲醇酵母信号肽.目前可供选择的酵母信号肽有α2交配因子的前导肽序列、酸性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等.其中酿酒酵母α2交配因子前导肽序列的使用最为广泛.酶切割位点周围氨基酸序列及外源蛋白的3级结构可以影响信号肽的加工效率.Waterham 等也利用定向肽在巴斯德毕赤酵母中成功地将PG AP 启动下的β2半乳糖苷酶定向输送到过氧化物酶体[7].2.4 表达载体的种类Invit rogen 公司开发出了若干系列的表达载体可供选择.当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可分为2类.①胞内表达载体.如p HIL 2D2,p AO815,p PIC3K ,PICZ ,p HWO10,p GA PZ.②分泌表达载体.如p HIL 2S1,p PIC9K ,p PICZα,p GA PZ α[8].目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基因表达产物的分泌,常用A2因子信号肽.许多蛋白的正确构像和翻译后加工(如糖基化等)都是在分泌途中完成的.3 基因整合证明表达载体构建正确后,转入巴斯德毕赤酵母中诱导表达.毕赤酵母转化方法最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合.ZeocinR 抑制细胞壁的形成,因此PICZ 系列不能使用原生质体法进行转化.转化时,载体DNA 必须切成线状才能与染色体进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入宿主染色体.通常有以下几种整合方式:①双位点互换.发生在染色体AOX1位点和表达质粒中的P AOX1及转录终止区,产生的表达菌的表型为His +Mut -[9].②AOX1单位点互换.发生在染色体和表达质粒的AOX1区.产生的表型是His +Mut +.③His 单位点置换.发生在染色体His 位点和表达质粒的His 位点,使得1个或多个表达单位插入在His 位点,产生的表型也是His +Mut +.巴斯德毕赤酵母载体在宿主染色体上大多为单拷贝整合,由于PAOX1的强启动性和整合后的稳定性,所以单拷贝也能获得较高的产量.4 重组蛋白翻译后修饰Pichi a p astoris 能进行与高等真核细胞相似的许多翻译后修饰,包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、O 2连接和N 2连接糖基化等.巴斯德毕赤酵母对分泌的外源蛋白的糖基化已成为研究的热点.巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有2个主要特征:①极少出现过度糖基化.一般情况下Pp 能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链,且较均一,长度在8～14个之间,使产物更加稳定.②糖链中不含具有潜在致敏作用的α21,32甘露糖[10].然而,一些在天然分泌时不被糖基化的蛋白,由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化.如人体内合成的胰岛素样生长因子I 为非糖基化蛋白,而由巴斯德毕赤酵母表达时,却有15%发生了糖基化作用[11].不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用,解决这一问题的可能方法主要是尝试胞内表达,利用基因工程改造糖基化位点[12],用糖苷酶进行处理,降低抗原性[13].5 影响外源基因表达的因素影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素主要包括:外源基因自身的特性、表达框的拷贝数、染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性、翻译后修饰以及培养条件等[14].5.1 外源基因自身的特性外源基因在P.p 中表达时,其自身就是影响表达水平的重要因素.许多高A +T 质量分数的基因常会由于提前终止而不能有效转录,不合适的mRNA 5′非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会影响基因的正常表达.Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白的mRNA5′非翻译区与醇氧化酶的5′非翻译区相同后,HSA 的表达量可以提高50倍以上[15].赵翔等研究证明,Pichia pastoris 有密码子偏爱倾向[16].所以一般需要进行全基因合成,使编码序列符合毕赤酵母偏爱密码子用法和具有更高的G +C 质量分数.5.2 表达框染色体整合位点巴斯德毕赤酵母中的稳定高效表达主要通过整合性载体实现.整合性载体的表达盒稳定,可以多位点整合而获得多拷贝以及进行不同整合方式.AOX1和组氨酸脱氢酶(HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白.Sreekrishna 等认为,由于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因能够发生基因转换,所以首选aox 1位点作为整合位点.5.3 宿主菌的甲醇利用表型原则上,如果是胞内表达,应尽量用Mut -细胞,这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而蛋白纯化更易进行.现在无需甲醇诱导的组成性表达载体p GA PZ 和p GA PZα已经构建成功,它们常能生产比诱导型载体p PICZ 和p PICZα更高的外源96 第1期 魏凡华等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展蛋白.Doring等研究表明,在生产哺乳动物膜转运蛋白时,p GA P比pAOX1更理想.5.4 基因剂量一般来说,高拷贝整合可以提高表达量,但许多实例表明,含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量.Jeffrey等发现,重组CD40L的最高产量是在有8个以上表达框的菌株中获得的[17].不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应,原因可能在于过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制.因此,高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准,基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白.Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法,可以快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆.5.5 分泌信号不适合的信号肽可导致信号肽加工不完全,或者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌.尝试不同的信号肽,对信号肽进行突变改造或人工全合成信号肽等策略可用于实现信号肽正确加工和提高分泌水平[18].韦宇拓等利用菊粉酶的信号肽序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了B2葡聚糖酶,结果表明ISP信号肽序列分泌效率不低于利用A因子信号肽的表达载体p P IC9K.Singh等通过定向缺失诱变导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的一种好方法.5.6 发酵系统培养巴斯德毕赤酵母在发酵系统中外源基因的转录水平是过量甲醇诱导时的3～5倍.可有效监控p H、通气量和碳源浓度并及时排出代谢产物,控制维持产物稳定性的因素,可达到最优化发酵条件,使蛋白产量在标准以上水平.现在已建立了较成熟的补料分批培养制度和连续灌注培养方法.5.7 产物稳定性酵母细胞膜上有一种KEXO2样蛋白水解酶,能专一性水解α因子前体中羧基端的肽键.改变培养基的p H值,推荐范围为2.8～6.5,加入适量的酵母提取物和蛋白胨,都能够提高外源蛋白的稳定性,而某些酶抑制剂在增加其稳定性的同时会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显,影响其使用效果.另外,使用蛋白酶缺陷株如SMD1163, SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生.在另外一种情况下,如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话,也可能出现高度降解的情况.6 结束语巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)表达系统是近年发展起来的一种新型真核表达系统,具有发酵工艺成熟,易于工业化,培养成本低廉,又具有真核表达系统,可进行蛋白翻译后的修饰、加工和折叠等优点,而得到广泛应用,目前许多诊断用的抗原及治疗用的疫苗都有在P Pichi a p astoris中得到表达.巴斯德毕赤酵母表达系统具有极好的生产应用前景,其主要优势如下:①巴斯德毕赤酵母表达载体整合后具有高稳定性.②可进行胞外表达和胞内表达,胞外分泌表达更有利于蛋白纯化.③发酵培养适合进一步大规模生产.④表达蛋白的加工修饰适中.但巴斯德毕赤酵母的更广泛应用,还有待于对此体系进行进一步的研究和开发.参考文献:[1] CREGG J M,CEREGHINO J L,SHI J,et al.Re2combinant protein expression in Pichia pastoris:a re2view[J].Molecular Biotechnology,2000,16(1):23252.[2] CREGG J M,V EDV IC K T S,RASCH KE W C.Re2cent Advances in the expression of foreign genes inPichia pastoris[J].Teclmology,1993,11(8):9052910.[3] CREGG J M,MADDEN K R,BARRIN GER K J,etal.Functional characterization of the two alcoholoxi2dase genes f rom the yeast Pichia pastoris[J].MolCell Biol,1989,9:131621323.[4] VASSIL EVA A,GHU GH D A,SWAMINA T HANS,et al.Expression of hepatitis B surface antigen inthe methylotrophic yeast Pichia pastoris using theGAP promoter[J].J Biotechnol,2001,88:21235. 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毕赤酵母表达系统简介
巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。
酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。
以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。
作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。
表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。
它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。
含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。
随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。
1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
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文章编号:100128751(2002)0620246205巴斯德毕赤酵母表达系统唐元家 余柏松 综述(中国医药集团四川抗菌素工业研究所, 成都610051) 摘要: 巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA 重组技术中得到越来越广泛的应用。
该酵母具有独特的生物学特性,作为真核表达系统,具有严格调控外源蛋白的表达,加工修饰表达产物,表达量高,营养要求低等优点;在该表达系统中,主要有3种表达宿主菌,其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体,其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂;巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外,从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。
关键词: 巴斯德毕赤酵母; 外源蛋白; 表达中图分类号: Q816 文献标识码: A 收稿日期:2001209227 修订日期:2002206215 作者简介:唐元家,男,生于1975年,在读硕士研究生,主要从事基因工程药物的研究。
余柏松,男,生于1957年,硕士,研究员,主要从事生物药物的研究及开发。
基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白展示了广阔的前景。
到目前为止,已发展了多种蛋白质表达系统,比如大肠埃希氏菌表达系统,酵母表达系统,高等真核细胞表达系统等。
长期以来,人们用大肠埃希氏菌作为宿主表达了多种蛋白。
这是因为大肠埃希氏菌具有若干优点,如遗传背景和生化特性清楚,容易操作,生长迅速,营养要求简单等。
但这一系统本身也存在若干缺陷:(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工,如剪切、糖基化、形成二硫键等;(2)表达的蛋白多形成不溶性包含体,需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性;(3)背景蛋白很多,纯化麻烦;(4)表达量一般不是很高。
从1979年开始,为了克服大肠埃希氏菌表达系统的缺点,发展了酵母表达系统。
最先使用的是酿酒酵母,它具有繁殖速度快,能高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工等优点。
1981年Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功〔1〕。
此后用该系统还表达了其它多种原核和真核蛋白,但酿酒酵母系统也具有局限性,如缺乏强有力的启动子,分泌效率差,表达菌株不够稳定,表达质粒易于丢失等。
有鉴于此,人们发展了新一代的酵母表达系统———巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )表达系统,即甲醇酵母表达系统。
1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统,有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点。
(1)具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达;(2)作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰,。
比如,用原核表达系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TI MP ),虽然获得了大量重组蛋白,但是由于重组蛋白形成包含体,难以使TI MP 分子内的6对二硫键正确折叠配对,始终未能得到有活性的全长分子。
李克勤等用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了分泌型前正确折叠的TI MP 21,重组蛋白的表达量达40mg/L 〔2〕;(3)营养要求低,生长快,培养基廉价,与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比,巴斯德毕赤酵母易于进行操作和培养。
巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长,亦有利于工业放大生产;(4)表达量高。
酿酒酵母中表皮生长因子(EG F )的表达量为714mg/L ,而在巴斯德毕赤酵母中的表达量为450mg/L ,表达量提高约60倍。
许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达到g/L 以上水平,如破伤风毒素C 片段表达量达12g/L 〔3〕,Heva brasiliensis羟腈裂合酶的表达水平高达22g/L 〔4〕;(5)在巴斯德毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌到胞外。
由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少和培养基中不含其他的蛋白质,这样分泌的外源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分,因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化,如表达的重组水蛭素(HIR ),仅经过二步层析纯化,纯度高达97%以上〔5〕,表达的人重组白细胞介素经过疏水层析、离子交换和凝胶过滤三步纯度即可达到99%〔6〕;(6)外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上,这样得到的基因工程菌株比较稳定。
巴斯德毕赤酵母的遗传操作技术和酿酒酵母非常相似,后者是现代分子生物学中研究得比较透彻和应用很广的酵母表达体系;(7)糖基化程度低。
和酿酒酵母相比,毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基,较之酿酒酵母每条侧链平均50～150甘露糖残基短得多。
此外酿酒酵母核心多糖末端存在α21,3糖苷链,而毕赤酵母没有。
一般认为酿酒酵母中糖蛋白的α21,3糖苷使得这些蛋白具有高度的抗原性,因而无治疗用途。
2 巴斯德毕赤酵母的生物学巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母。
在缺乏抑制性碳源(如葡萄糖、甘油)时,能利用甲醇作为惟一碳源。
甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下被氧化成甲醛,并产生过氧化氢。
为了避免过氧化氢对细胞的毒性,甲醇代谢的第一步在过氧化物酶体中发生。
乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱,因此巴斯德毕赤酵母代偿性地大量产生这种酶,调控这种酶的启动子是强启动子,用来调控异源蛋白的表达。
在巴斯德毕赤酵母中有两种基因编码乙醇氧化酶(即AOX1和AOX2),细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供的。
在甲醇培养的细胞中,该酶可占细胞总蛋白的30%以上。
AOX2与AOX1的同源性虽然高达97%,但只承担很少一部分活力。
当aox1基因缺失只存在aox2时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,细胞利用甲醇能力降低,细胞在甲醇培养基上生长很慢,这种菌株被称为Mut s(Methanol utilization slow);aox1基因存在时,细胞利用甲醇能力正常,在甲醇培养基上生长较快,这种菌株表型被称为Mut+。
aox1基因的表达为转录水平调控。
aox1基因的调控是一个抑制机制加上诱导机制的过程,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录,而在以甲醇为惟一生长碳源时诱导基因转录,蛋白质表达。
在一般情况下,胞内AOX酶的变化直接反映了外源蛋白的表达状况,因此通过分析检测胞内AOX酶的含量和变化速率,就可以确定外源基因所处的状态。
顾小勇等根据细胞氧化甲醇过程中消耗氧的情况,通过测定溶氧的变化,建立一种简便、可行的检测方法〔7〕。
甲醇酵母生长适宜温度一般为28～30℃。
诱导期间如果温度超过32℃,不利于蛋白表达,甚至会导致细胞死亡。
以甘油或葡萄糖为碳源时,Mut s和Mut+生长速度并无区别;而以甲醇为碳源时,Mut+的生长比Mut s的生长明显更快。
3 宿主菌和载体巴斯德毕赤酵母表达宿主菌于20世纪80年代初开发获得,大多数应用宿主菌是通过对野生型石油酵母Y211430进行突变改造而来,在组氨酸脱氢酶基因(his4)处有一突变,用于转化后筛选重组菌株(表1)。
表1 巴斯德毕赤酵母表达宿主菌菌株基因型表型Y211430W ile type野生型G S115his4Mut+H is2K M71aox1Δ::sarg4his4arg4Mut+H is2MC10023aox1Δ::sarg4aox2Δ::phis4his4arg4Mu t+H is2S M D1168pep4Δhis4Mut+H is2蛋白酶不足S M D1165prb1his4Mut+H is2蛋白酶不足S M D1163pep4prb1his4Mut+H is2蛋白酶不足目前主要有3种表达宿主菌,它们的区别在于aox1和/或aox2基因的缺失而造成对甲醇利用能力高低的变化。
最常用的宿主菌为G S115(his4),它含aox1和aox2基因,在含甲醇的培养基上以野生型速率生长。
K M71(his4arg4aox1::arg4)宿主菌的aox1已被酿酒酵母的arg4所代替,因此,此宿主菌只有依赖aox2基因合成AOX2,在甲醇中低速生长。
MC10023 (aox1Δ::sarg4aox2Δ::phis4his4arg4)的aox1和aox2都被去除,不能在含甲醇的培养基上生长〔8,9,21〕。
上述的宿主菌进一步改造,还可得到其它衍生的宿主菌,目前不同基因型已达十几种S M D1163(his4pep4 prb1),S M D1165(his4prb1)和S M D1168(his4pep4)是最近开发的一类蛋白酶缺失的宿主菌,它们为表达外源蛋白提供了一个减少降解的环境,有广泛的应用价值。
巴斯德毕赤酵母的表达载体包括整合型载体和自我复制的游离载体,现在一般都用整合型载体(表2)。
载体通常含有启动子,如aox1、gap(3′磷酸甘油醛脱氢酶)、fld1(甲醛脱氢酶)等基因启动子,多克隆位点区(MHC),aox1转录终止子(aox t),组氨酸脱氢酶基因(his4)以及来自大肠埃希氏菌质粒pBR322的氨苄西林耐药(Ap r)和C olElori序列。
Aox启动子是强启动子,可严格控制外源蛋白的表达。
与aox启动子的诱导表达不同,gap启动子具有很强的组成型表达能力。
fld1启动子也是强启动子,能在以甲醇为惟一碳源或以甲胺为惟一氮源(葡萄糖、甘油等为碳源)条件下表达〔10〕。
表达载体均不含酵母复制原点,也就是说导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组整合到染色体上,外源基因才能够稳定存在。
整合位点一般位于his4区或aox1区,对于载体的改进包括建立在体外插入多个目的基因拷贝载体,如pAO815、pPICZ、p G APZ等载体。
由于提高整合的拷贝数有可能提高外源基因的表达量,因此人们又发展了可以快速筛选高拷贝整合转化子的载体,如pPIC9K。
该载体包含来自转座子Tn903的卡那霉素耐药基因(Kan r),可依靠基因剂量效应,对G418的抗性水平快速筛选出高拷贝整合的转化子〔11〕。
Invitrogen 公司的pPICZα、pPICZ、p G AP Z、p G APZα等载体,不仅可利用高剂量的Z eocin来筛选含多拷贝载体的转化菌株,同时这些载体的c2myc抗原决定簇可方便地检测外源蛋白,C末端的多聚组氨酸(6个His)为方便使用树脂来纯化外源蛋白质提供了条件〔12〕。
表2 常用的巴斯德毕赤酵母表达载体载 体表达方式选择标记特 点pHI L2D2胞内his4在not1位点整合产生Mut s转化子pAO815胞内his4适合构建形成多个串联的表达框pPIC3K胞内H is4和kan r可筛选含多拷贝载体的转化子pPICZ胞内ble r可筛选含多拷贝载体的转化子pHW O10胞内His4外源蛋白的表达受组成型启动子控制p G APZ胞内ble r外源蛋白的表达受组成型启动子控制pHI L2S1分泌his4PH O1为分泌信号肽pPIC9K分泌his4和kan r可筛选含多拷贝载体的转化子pPICZα分泌ble r可筛选含多拷贝载体的转化子p G APZα分泌ble r外源蛋白的表达受组成型启动子控制4 巴斯德毕赤酵母的转化和大肠埃希氏菌不同,毕赤酵母转化较为复杂。