HPLC测定蛋白质含量方法验证

25.535
0.023
原液批1
供试品
300
25.541
0.050
成品批1
供试品
75
25.544
0.048
成品批2
供试品
150
25.506
0.033
成品批3
供试品
300
25.594
0.040
实验结论：RSD值﹤1%，符合2015年版《中国药典》要求
-
重复性实验（峰面积）
批序号
类别
规格
平均峰面积 RSD值
精益生产 智能管理
———HPLC测定蛋白质含量方法确认
发言人：程红波 日期：2016-3-15
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方法确认（HPLC法）
目的：证明HPLC方法适合于重组人粒细胞 刺激因子蛋白质含量检测要求
依据：《中国药典》2015年版
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洗脱梯度（2015年版中国药典）
按下表进行梯度洗脱
编号
时间/分
A/%
B/%
1
0
5063.89 0.23%
成品批3
供试品 300ug/ml
5372.14 0.40%
实验结论：RSD值﹤1%，符合2015年版《中国药典》要求
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精密度实验（出峰时间）
批序号 类别
/ / / 原液批2 成品批4 成品批5 成品批6
标准品 标准品 标准品 供试品 供试品 供试品 供试品
规格（ ug/ml)
-
方法比较（lowry与HPLC）
批序号
原液批1 原液批2 原液批3 原液批4 原液批5 原液批6 原液批7 原液批8
lowry法（ug/ml)
1477 1393 1432 1466 1389 1456 1395 1428
HPLC法(ug/ml)
1417 1358 1379 1413 1327 1415 1352 1386
3660.26 3677.38 1.30 1.11 3715.15 3722.89 1.27 0.97 3478.19 3500.13 0.93 1.59 3424.81 3434.33 1.84 1.06 4513.68 4538.38 1.28 0.99 4273.84 4333.33 1.26 1.01 3832.75 3839.97 1.10 1.66
适用于我公司产品的检测，且该方法具有一定的稳 定性及可靠性
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实验结论：RSD值﹤2%，符合2015年版《中国药典》要求
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精密度实验（峰面积）
批序号 类别
/ / / 原液批2 成品批4 成品批5 成品批6
标准品 标准品 标准品 供试品 供试品 供试品 供试品
规格 （ug/ml)
75 150 300 300 300 150 75
平均峰面积
RSD值（%）
分析员A 分析员B 分析员A 分析员Bቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
/
标准品 75ug/ml
4406.24 0.08%
/
标准品 150ug/ml
4610.70 0.13%
/
标准品 300ug/ml
4722.04 0.53%
原液批1
供试品 300ug/ml
4749.36 0.52%
成品批1
供试品 75ug/ml
4559.72 0.58%
成品批2
供试品 150ug/ml
实验结论：RSD值﹤2%，符合2015年版《中国药典》要求
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实验结论
1、 通过对峰面积及出峰时间的计算对比，重复性实 验RSD值均低于1%，精密度实验RSD值均低于 2%，说明使用以上方法对赛格力成品及原液进行 蛋白质含量测定的数据结果具备重复性、精密度
2、符合2015年版高效液相色谱法验证要求 3、通过对大量赛格力原液和成品的检测，说明该方法
结论：lowry法与HPLC法所测得的浓度存在一定的差异！
-
色谱图比较
25.757
25.688
工作标准品色谱图例
供试品色谱图例
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重复性实验（出峰时间）
批序号
类别 规格（ug/ml） 平均峰出峰时间 RSD值(%)
/
标准品
75
25.546
0.057
/
标准品
150
25.537
0.038
/
标准品
300
60
40
2
40
20
80
3
45
0
100
4
50
60
40
5
60
60
40
A：0.1%三氟乙酸的水溶液 B： 0.1%三氟乙酸的乙腈溶液
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含量计算公式
供试品蛋白质含量（ug/ml)= CR×AX×nX
AR×nR
式中 CR为复溶所得标准品溶液的蛋白质含量， ug/ml； AR为标准品溶液的平均峰面积； AX为供试品溶液的平均峰面积； nR为标准品溶液的稀释倍数； nX为供试品溶液的倍数；
75 150 300 300 300 150 75
平均峰面积
RSD值（%）
分析员A 分析员B 分析员A 分析员B
25.511 25.534 0.032 0.056 25.537 25.567 0.077 0.061 25.561 25.581 0.062 0.033 25.554 25.544 0.035 0.047 25.538 25.536 0.035 0.048 25.579 25.667 0.064 0.073 25.564 25.818 0.059 0.043
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方法比较（ lowry与HPLC）
Folin-酚（lowry）
要求人为精确控制操作时间 操作复杂，干扰因素较多
重复性、精密度较差 只适用于检测原液的蛋白质含量
HPLC
设备控制时间，减少人为误差 操作简便，干扰因素较少 重复性、精密度较好
适用于原液及成品的蛋白质含量
/
2015年版《中国药典》首次规定的 检测方法