真核生物启动子的鉴定方法
真核RNA聚合酶及其启动子
表位标签法
• 表位标签法（epitope tagging）：利用遗 传学方法将一小段氨基酸残基（表位标签） 融合到目的蛋白上，由此可使目的蛋白通 过抗体识别表位标签而进行免疫沉淀并纯 化蛋白
• 沉淀与纯化的蛋白质（或蛋白复合体）可 通过SDS-PAGE进行分离分析
10-10
酵母RNA pol II的亚基
WT转录起始位点
箭头长度表示缺失片段长度
SV40早期启动子缺失突变效应
10-17
近端启动子元件
• GC框（GC box）：具有GGGCGG序列的近端启动子元件，存在于许 多哺乳动物结构基因的启动子中，通常位于TATA box上游，无方向依 赖性，但有位置依赖性。转录因子Sp1结合GC box后可增强转录效率。
• CCAAT框（CCAAT box）具有CCAAT序列的近端启动子元件，存在 于 许 多 RNA pol II 识 别 的 真 核 生 物 启 动 子 中 。 转 录 因 子 CTF 结 合 CCAAT框后可增强转录效率。
10-18
I类启动子
不同物种的I类启动子只有2个保守元件： • 核心元件：在转录起始位点附近（-45~+20），为转录所必须；上游启
10-20
10.3 增强子和沉默子
• 增强子（enhancer）：与一个或多个激活因子结合而促进一个或多个 基因转录的DNA元件。增强子一般位于其调控基因的上游，但也可以 在下游
SV40病毒早期基因调控区结构
• 沉默子（silencer）：可以在远距离降低基因转录水平的DNA元件 • 增强子和沉默子经常是组织特异性的，都可以在数千碱基之外对基因
• 酵母RNA pol II的Rpb1、Rpb2和Rpb3为核心亚基 • Rpb1亚基存在2种形式（IIAO、IIAA），分别执行转录起始与起始
真核生物的启动子
真核生物的启动子由于真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子Ⅱ最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA 框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。
有的有多种框盒如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白，（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNA pol 结合。
转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。
(一)Ⅱ类基因的启动子和调控区Ⅱ类基因的启动子由核心元件和上游元件组成。
核心元件包括TATA框和转录起始位点附近的启始子（initiator，Inr）。
在起始点一般没有同源序列，但mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py 组成（在原核启动子的CAT起始序列也有这种情况），称为起始子（initiator），一般由PY2CAPY5构成，位于-3～+5，可能提供RNA pol Ⅱ识别。
无论TATA是否存在，Inr对于启动子的强度和起始位点的选择都是十分重要的。
现已分离纯化了与Inr特异结合的蛋白质因子。
1．核心元件TATA框合又称Hogness框，Goldberg-Hogness框，俚语称为金砖（Goldbrick），其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位点的上游-25左右，相当于原核的-10序列。
但-10是不可缺少的，而真核启动中也有的缺乏TATA 框。
其作用是：(1) 选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector），当有的基因缺少TATA框时，可能由Inr来替代它的这一作用，如鼠的脱氨核苷转移酶（Tdt）基因就没有TATA框，但有17bp的Inr；(2) 影响转录的速率。
TATA框的8bp的保守序列一般都是由A.T对组成，少数情况在其中的两个位点上由G.C对取代了A.T，可见它是较容易打开。
分子生物学——精选推荐
分子标志物：指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质（多肽）、代谢产物等生物分子。
DNA结构：DNA的二级结构是双螺旋结构：DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。
螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove) 及小沟(minor groove)相间。
碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;G=C）。
相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。
DNA的三级结构是超螺旋结构：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。
正超螺旋(positive super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negative super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。
原核生物DNA的是环状超螺旋结构核小体(nucleosome)是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成。
组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 RNA结构：一级结构：核苷酸连接方式同DNA。
RNA的一级结构即指核苷酸的连接方式、数量和排列方式。
主要结构特征：①含有稀有碱基（修饰碱基）；②不遵守Char gaff原则；③多数为单链分子，形成链内双链二级结构（发夹结构）；④碱基配对：A-U，G-C。
t RNA二级结构：DHU环反密码环额外环 TΨC环氨基酸臂t RNA的三级结构是倒L型t RNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。
m RNA的结构与功能:1）基本特点：含量低（约占总RNA的1%～5%）；种类多（上万种）；分子大小差异大（几百～约2万个核苷酸）；半衰期短。
2）结构特点：编码区——决定蛋白质的一级结构，包括起始密码子、终止密码子、外显子。
非编码区——与蛋白质生物合成的调控有关，包括5′非编码区（帽结构、核蛋白体识别结合位点等）、3′非编码区（多聚腺苷酸尾）、间隔序列（内含子）。
分子生物学-9
分子生物学-9(总分：100.00，做题时间：90分钟)一、选择题(总题数：40，分数：100.00)1.比较DNA聚合酶和RNA聚合酶，叙述正确的是：（分数：2.50）A.RNA聚合酶以dNTP作为聚合反应的原料B.DNA聚合酶以RNA作模板合成DNAC.两种酶都需要RNA引物D.两种酶催化新链的延伸方向都是5"→3"√解析：[解析] RNA聚合酶以NTP作为原料，以DNA作为模板催化聚合反应，可以从头起始RNA合成，不需要引物。
2.大肠杆菌中参与转录终止调控的是：（分数：2.50）A.TATA boxB.ρ因子√C.snoRNAD.RNase P解析：3.控制基因产物数量的最关键的步骤是：（分数：2.50）A.复制的终止B.可变剪接C.翻译的调控D.转录的起始√解析：[解析] 转录是基因表达的第一步，是表达调控的关键一步，决定基因表达产物的数量。
4.利福平是RNA合成起始的抑制剂，这是由于利福平能够与E.coil的RNA聚合酶中的______亚基结合。
（分数：2.50）A..αB..β"C..β√D..σ解析：[解析] 利福平通过与A/GTP竞争β亚基抑制RNA合成的起始阶段，一旦转录进入延伸阶段，利福平不再发挥作用。
5.Pribnow盒属于：（分数：2.50）A.绝缘子B.启动子√C.终止子D.增强子解析：[解析] Pribnow盒又称为-10区，属于原核基因的核心启动子。
6.既可利用上游启动子，又可利用下游启动子的RNA聚合酶是：（分数：2.50）A.RNA聚合酶ⅠB.RNA聚合酶ⅡC.RNA聚合酶Ⅲ√D.RNA聚合酶Ⅳ解析：[解析] 由RNA聚合酶Ⅲ结合的启动子中有的位于基因内，如tRNA基因，有的位于基因上游，如U6-snRNA基因。
7.真核生物细胞核中的RNA聚合酶Ⅱ的特异性抑制剂是：（分数：2.50）A.α-鹅膏蕈碱√B.放线菌素DC.利福霉素D.嘌呤霉索解析：[解析] RNA聚合酶Ⅱ对α-鹅膏蕈碱最敏感，10 -9～10 -8 mol/L的α-鹅膏蕈碱就能完全抑制RNA 聚合酶Ⅱ的活性。
分子生物学填空题练习
分子生物学填空题练习1.RNA是由核糖核苷酸通过键连接而成的一种。
几乎所有的RNA都是由DNA 而来，因此，序列和其中一条链。
2.多数类型的RNA是由加工产生的，真核生物前体tRNA的包括的切除和的拼接。
随着和端的序列切除，3′端加上了序列。
在四膜虫中，前体tRNA 的切除和的拼接是通过机制进行的。
3.RNase P是一种，含有作为它的活性部位，这种酶在序列的切割。
4.假定摆动假说是正确的，那么最少需要种tRNA来翻译61种氨基酸密码子。
5.写出两种合成后不被切割或拼接的RNA：和。
6.原核生物中Attenuator存在于序列中，其调控机理是Enhancer存在于序列中，其调控机理是。
7.在DNA合成中负责复制和修复的酶是。
8.染色体中参与复制的活性区呈Y型结构，称为。
9.在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为。
10.在DNA复制过程中，连续合成的子链称，另一条非连续合成的子链称为。
11.如果DNA聚合酶把一个不正确的核苷酸加到3′末端，—个含3′→5′活性的独立催化区会将这个错配碱基切去。
这个催化区称为酶。
12.DNA后随链合成的起始要一段短的，它是由以核糖核苷酸为底物合成的。
13.复制叉上DNA双螺旋的解旋作用由催化的，它利用来源于ATP水解产生的能量沿DNA链单向移动。
14.帮助DNA解旋的与单链DNA结合，使碱基仍可参与模板反应。
15.DNA引发酶分子与DNA解旋酶直接结合形成一个单位，它可在复制叉上沿后随链下移，随着后随链的延伸合成RNA引物。
16.如果DNA聚合酶出现错误，会产生一对错配碱基，这种错误可以被一个通过甲基化作用来区别新链和旧链的特别系统进行校正。
17.编码一个短肽链的双链DNA的分子序列为第一单链TCA TTTGCGTAGTGCCAT第二单链AGTAAACGCATCACGGTA第单链为有意链，极性方向为（左右），mRNA的转录方向是（左右），能翻译个氨基酸的短肽，以第链为有意链可转录出其micRNA，它的序列和极性方向为。
真核生物起始tRNA是
详细描述
真核生物起始tRNA具有特定的结构和功能 特征，这些特征在不同物种和生物群落中表 现出显著的差异。研究真核生物起始tRNA 的进化和变异有助于深入了解生物进化的机 制和历程，为生物多样性的研究和保护提供 重要依据。
在疾病发生发展中的作用
要点一
总结词
真核生物起始tRNA在疾病发生发展中具有重要作用，其结 构和功能的异常可以影响细胞的生长、发育和代谢过程， 进而导致疾病的发生。
VS
真核生物起始tRNA的特殊化学结构 使其能够与mRNA上的起始密码子形 成稳定的碱基配对，确保翻译的准确 性和效率。
遗传信息的解码
真核生物起始tRNA作为翻译的起点，参与 将mRNA上的遗传信息解码成氨基酸序列的 过程。
真核生物起始tRNA上的反密码子与mRNA 上的密码子互补配对，确保遗传信息的准确
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要点二
详细描述
真核生物起始tRNA的异常表达或功能失调与多种疾病的发 生和发展密切相关，如癌症、神经退行性疾病、心血管疾 病等。研究真核生物起始tRNA在疾病中的作用机制，有助 于发现新的治疗靶点和方法，为疾病的预防和治疗提供新 的思路和策略。
在基因编辑和合成生物学中的应用
总结词
真核生物起始tRNA在基因编辑和合成生物学中具有重要 的应用价值，通过对其结构和功能的深入研究，可以为 基因编辑和合成生物学技术的发展提供新的工具和策略 。
详细描述
真核生物起始tRNA的结构和功能特征为其在基因编辑和合 成生物学中的应用提供了广阔的空间。通过设计和改造真 核生物起始tRNA，可以实现对基因表达的精确调控，为基 因治疗、基因组编辑和合成生物学等领域的发展提供有力 支持。同时，真核生物起始tRNA的研究也有助于深入了解 基因表达的调控机制，为基因组学和表观遗传学等领域的 研究提供新的视角和方法。
真核生物三类启动子
真核生物启动子有三类，分别由RN A 聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ进行转录。
类别Ⅰ（class Ⅰ）启动子：只控制rR NA 前体基因的转录，转录产物经切割和加工后生成各种成熟rRN A 。
类别Ⅰ启动子由两部分保守序列组成：核心启动子（c ore promo t er ）：位于转录起点附近，从-45至+20；上游控制元件（u pstr e am contr ol eleme n t ，UCE ）：位于-180至-107；RNA 聚合酶Ⅰ对其转录需要2种因子参与：UBF1：一条M 为97000的多肽链，结合在上述两部分的富含G C 区；1个TBP ，即TA TA 结合蛋白（TA TA-bindi n g prote i n ，TBP ）；SL1：一个四聚体蛋白，含有 3个不同的转录辅助因子T AF Ⅰ；在SL1因子介导下R NA 聚合酶Ⅰ结合在转录起点上并开始转录。
类别Ⅱ（class Ⅱ）启动子：类别Ⅱ启动子涉及众多编码蛋白质的基因表达的控制。
该类启动子包含4类控制元件：基本启动子（b asal promo t er ）：序列为中心在-25至-30左右的7 bp 保守区，T A TAA AA/T ，称为TAT A 框或Go l dber g -Hogne s s 框。
与RNA 聚合酶的定位有关，DNA 双链在此解开并决定转录的起点位置。
失去TAT A 框，转录将在许多位点上开始。
起始子（initi a tor ）：转录起点位置处的一保守序列，共有序列为：Py PyA NT(A)P y P yPy 为嘧啶碱（C 或T ），N 为任意碱基，A 为转录的起点。
DNA 在此解开并起始转录。
上游元件（upstr e am facto r ）：普遍存在的上游元件有C A A T 框、G C 框和八聚体（octam e r ）框等。
生物化学(12.2)--作业RNA的生物合成(附答案)
说出下列各核酸序列的名称和各序列与转录的关系。 ①……TTGACA……TATAAT…… ②TATA ③AAA……AAA……(polyA) ④-CCA-OH-3′ ⑤UUU……UUU(polyU) [答案] ① 原核生物启动子的一致性序列，即转录起始点－35 区和－10 区的序列，－10 区 序列又称为 Pribnow Box。是转录起始 RNA-pol 辨认和结合 DNA 模板的位点。 ②真核生物启动子或启动子的一部分。属于顺式作用元件，称为 TATA box。其出现位置不如 原核生物那样相对固定，也不是所有转录都必须 TATA 盒： ③真核生物的 polyA(聚腺苷酸)尾巴，是转录终止与转录后修饰两个过程同时发生的现象 。 polyA 尾巴在翻译时逐渐变短，说明它在维持 mRNA 稳定性上发挥一定作用。 ④ tRNA 3′ 末端的序列，由转录后加工加上去的，其功能是在翻译过程中与 tRNA 反密码子 相对应的氨基酸结合，生成氨基酰-tRNA。 ⑤是原核生物非依赖 Rho 因子转录终止的转录产物 3′ 末端序列，跟在茎环结构的下游。其 功能与 RNA 脱离转录模板 DNA 有关。因为转录过程 RNA 3′ 端是与模板链互补结合的，AU 配对不稳定，RNA 中出现多聚 U，使 RNA 易于从模板链上脱落。
问答题 列表比较转录与复制的异同点。 [答案] 见表。
复制
转录
相同点
①都是酶促的核苷酸聚合过程 ②都是以 DNA 为模板
真核生物三类启动子
真核生物启动子有三类，分别由RNA 聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ进行转录。
类别Ⅰ（class Ⅰ）启动子：只控制rRNA 前体基因的转录，转录产物经切割和加工后生成各种成熟rRNA 。
类别Ⅰ启动子由两部分保守序列组成：核心启动子（core promoter）：位于转录起点附近，从-45至+20；上游控制元件（upstream control element ，UCE ）：位于-180至-107；RNA 聚合酶Ⅰ对其转录需要2种因子参与：UBF1：一条M 为97000的多肽链，结合在上述两部分的富含GC 区；1个TBP ，即TATA 结合蛋白（TATA-binding protein ，TBP ）；SL1：一个四聚体蛋白，含有 3个不同的转录辅助因子TAF Ⅰ；在SL1因子介导下RNA 聚合酶Ⅰ结合在转录起点上并开始转录。
类别Ⅱ（class Ⅱ）启动子：类别Ⅱ启动子涉及众多编码蛋白质的基因表达的控制。
该类启动子包含4类控制元件：基本启动子（basal promoter ）：序列为中心在-25至-30左右的7 bp 保守区，TATAAAA/T ，称为TATA 框或Goldberg-Hogness 框。
与RNA 聚合酶的定位有关，DNA 双链在此解开并决定转录的起点位置。
失去TATA 框，转录将在许多位点上开始。
起始子（initiator ）：转录起点位置处的一保守序列，共有序列为：P y P y ANT(A)P y P yP y 为嘧啶碱（C 或T ），N 为任意碱基，A 为转录的起点。
DNA 在此解开并起始转录。
上游元件（upstream factor ）：普遍存在的上游元件有CAAT 框、GC 框和八聚体（octamer ）框等。
CAAT 框的共有序列是GCCAATCT ，GC 框的共有序列为GGGCGG 和CCGCCC ，八聚体框含有8bp ，共有序列为ATGCAAAT ；应答元件（response element ）：诱导调节产生的转录激活因子与靶基因上的应答元件结合。
真核生物启动子研究概述
真核生物启动子研究概述李圣彦;郎志宏;黄大昉【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】启动子是调控基因表达的重要基因元件，它的调控作用是多层次多因素共同作用的结果。
通过启动子的调控能够控制基因表达的水平、部位及方式。
深入研究启动子对于了解生物的生长发育、防御系统、疾病等都有非常重要的意义。
本文综述了启动子克隆、生物信息学分析和预测的方法，比较了两种启动子分析方法，介绍了启动子甲基化、多态性和合成启动子的研究进展，以期能够为启动子的研究提供参考。
%Promoter is an important element in regulation of gene expression. The regulation role of promoter is the result of a multi-level interaction of multiple factors. The level, location and manner of gene expression are regulated by the promoter, so deeply study of promoter isof great importance for understanding biological growth, defense system and disease. This paper reviews the methods of promoter cloning, bioinformatics analysis and forecasting of promoter, compares two methods of promoter analysis, introduces the progress of promoter methylation and polymorphism, so as to provide a reference for further study of promoters.【总页数】7页(P158-164)【作者】李圣彦;郎志宏;黄大昉【作者单位】中国农业科学院生物技术研究所，农业部农业基因组学重点实验室北京，北京100081;中国农业科学院生物技术研究所，农业部农业基因组学重点实验室北京，北京100081;中国农业科学院生物技术研究所，农业部农业基因组学重点实验室北京，北京100081【正文语种】中文【相关文献】1.真核生物启动子TATA-box·GC-box和CAAT-box的分析 [J], 张小辉;祁艳霞2.几个真核生物启动子计算机预测数据库资源概述 [J], 刘玉瑛;张江丽3.真核生物启动子的预测技术 [J], 孙吉贵;韩霄松;卢欣华;行荣;仲洋4.真核生物启动子的研究及应用 [J], 黄玉;杨波;迟小华;刘丽宏;李薇;卢学春5.真核生物启动子的鉴定方法 [J], 石慧;李建远因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鉴定启动子dna上反式作用蛋白结合位点的方法_3191
鉴定启动子DNA上反式作用蛋白结合位点的方法1酵母单杂交技术酵母单杂交（yeast one hybrid）技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析。
运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。
酵母单杂技术基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域（DNA-binding domain, BD）和转录激活结构域（activation domain, AD）。
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点（UAS），而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。
在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。
其基本操作过程为：①设计含目的基因（称为诱饵）和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中；②将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中；③若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来。
酵母单杂交技术广泛用于DNA 与蛋白相互作用的研究，鉴定了大量与逆境相关基因的启动子区域特异互作的转录因子（Melegari et al., 1998; Liao et al., 2008）。
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》考试试卷(2664)
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出从组织中抽取RNA的关键步骤，并解释如何判断RNA质量。
答案：（1）从组织中提取RNA的步骤如下：①将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol 裂解液溶解样品，充分吹打混匀。
②每1ml TRIzol加入2.0ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。
③4℃，10000g离心15min，此时RNA主要集中在水相中。
④将中多水相转移至新的离心管当中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。
⑤4℃，10000g离心10min，此时可在离心管底部这时观察到深蓝色沉淀，即为RNA。
⑥用75冷的氯化氢洗涤沉淀，4℃，7500g以下，离心5min，弃上清。
⑦超净台中吹干，加入无RNase的水溶解。
（2）检测RNA质量的方法如下：①凝胶成像：取适量RNA溶液加入电泳缓冲液后，飞奔琼脂糖凝胶电泳，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量是好的。
②吸光度检测：换用紫外分光光度计检测RNA样品在260nm、280nm处的吸光度，若两者的比值在1.8～2.0时，可认为RNA纯度良好，蛋白质等其他物质酵素的污染可以接受。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 真核生物利用polyA聚合酶在新转录出的mRNA3′端加上polyA尾巴形成polyA＋的mRNA。
（）答案：正确解析：DNA序列中没有多聚T的序列，说明细胞分裂后加上了3′尾巴。
加工过程首先是3′末端一些过剩的核苷酸被核酸外切酶切去，然后由多聚腺苷酸聚合酶催化，以ATP为底物，在mRNA3′末端逐个加上腺苷酸，形成polyA尾巴。
基因启动子及其在真核生物基因表达调控中的作用
基因启动子及其在真核生物基因表达调控中的作用基因是所有生命活动的基础，控制着生物体的发育、生长和适应环境。
除了遗传物质DNA外，还存在一些重要的调控元件，其中最重要的就是基因启动子。
基因启动子是指位于基因核心区域的DNA序列，可以被转录因子和其他调控因子所识别和结合，从而启动某一特定基因的转录。
基因启动子的活性决定着基因的表达量以及表达的时空模式。
在真核生物中，基因启动子通常包含一个核心启动子（core promoter）和一个活化子结合区（enhancer）。
核心启动子一般位于基因起始位点（transcription start site，TSS）附近，提供了基础的转录起始功能。
活化子结合区则位于核心启动子上游或下游数千个碱基对外的位置，可以被转录因子或其他调控因子所识别和结合，增强或抑制基因转录活性。
基因启动子的组成和作用基因启动子通常由多个DNA结构元件组成。
除了核心启动子和活化子结合区外，还有其他重要的结构元件如TATA motif、Inr motif、NC motif等。
这些结构元件的序列、位置和相互作用都对基因启动子的转录活性和表达模式产生影响。
核心启动子：核心启动子是基因启动子的最基本结构，通常位于基因的TSS附近，其中最常见的结构是TATA motif和Inr motif。
TATA motif一般位于TSS大约30个碱基对上游的位置，可以被转录因子TFIID所识别和结合。
Inr motif则位于TSS的下游数个碱基对位置，是另一类常见的启动子序列。
活化子结合区：活化子结合区是基因启动子的主要调控区域，由多个强转录因子结合位点组成。
这些转录因子可以直接结合到活化子结合区，或者通过介导因子（mediator）等辅助蛋白结合。
通过转录因子和介导因子的共同作用，可以调控基因的转录活性、表达时机、时间和空间分布等多个方面。
其他结构元件：除了核心启动子和活化子结合区外，还存在一些次要的结构元件，如钙离子响应元件（CRE）、脱氧核糖核酸响应元件（DRE）、热激响应元件（HSE）等。
分子生物学-10
分子生物学-10(总分：100.00，做题时间：90分钟)一、问答题(总题数：20，分数：100.00)1.比较真核生物RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子和原核生物RNA聚合酶所识别的启动子的结构特点，并解释为什么原核生物的一种RNA聚合酶能识别不同的结构基因?（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：原核生物RNA聚合酶所识别的启动子由上游增强元件、-35区、-10区以及转录起始位点构成；真核生物RNA聚合酶Ⅱ识别的启动子由TATA盒、转录起始位点、TFIIB识别位点以及下游启动子元件构成。
由于原核生物的RNA聚合酶含有能特异性识别启动子的σ因子，所以不需要其他辅助蛋白就能识别不同的结构基因。
2.比较真核生物rRNA、mRNA以及tRNA合成的特点。
（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：核仁是28S rRNA、18S rRNA以及5.8S rRNA合成的场所，这三种rRNA共享一个启动子，由RNA聚合酶Ⅰ合成，45S rRNA是它们的共同前体，通过转录后加工产生各自成熟的终产物。
核质是mRNA和tRNA、5SrRNA合成的场所，分别由定位于细胞核质的RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ合成，产生的前体均要经过转录后加工才能成为终产物。
3.简述真核生物rRNA基因(不含5S rRNA基因)和tRNA基因的转录起始机制。
（分数：5.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：()解析：真核生物28S rRNA，18S rRNA以及5.8S rRNA基因由RNA聚合酶Ⅰ负责转录，首先组装因子UBF分别与上游控制元件UCE和核心启动子结合，随后招募定位因子SL1与启动子结合，SL1引导RNA pol Ⅰ正确定位到启动子上，起始转录。
你
阻滞 暂停的RNA pol倒退，使 RNA堵塞了有关的通道，转录就会 被完全阻滞。解除RNA pol的阻滞状态，同样需要GreA或GreB剪切 突出的RNA,解除RNA pol前进的障碍
3、 转录的终止
终止因子(termination factor)， 协助RNA pol识别终止子的辅助因 子(蛋白质)。 终止子(terminator)，转录终止于具有终止功能的特定DNA序列。
RNA pol II
核质
8种以上
20%～40%
RNA pol III
核质
4种以上
10%
tRNA、5S rRNA、 U6 snRNA和scRNA 线粒体RNA
线粒体RNA pol
线粒 体
2种
叶绿体RNA pol
叶绿 体
3种以上
叶绿体RNA
不敏感
羧基端结构域(carboxyl terminal domain, CTD)]：RNA pol II最大的亚 基的一个重要结构域。由7个共同的氨基酸序列(YSPTSPS)重复多次构成。 CTD磷酸化使RNA pol II脱离起始复合物，是进行RNA链延长的关链步骤。
1、原核生物转录的起始 鉴定转录起始位点的方法：足迹法(foot printing)
核酸内切酶处理
以DNA编码链的标记方法： 对应于RNA 的第1个核苷酸为+1，其下游 (downstream) 转录区依次记为正数，上游依 次记为负数(没有0)，
启动子(promoter)是RNA聚合酶识别、结合并起始转录 的一段特异性的DNA序列，一般位于转录起始位点(+1) 的上游，可以同RNA聚合酶特异性结合，但本身的序列 不被转录。细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子
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立，近 年来 关于该方 法的优化 有许 多报道 ［４－５］ｏ其基 本原理是首 以在高分 辨率 的变性 聚丙烯酰胺 凝胶 电泳上 观察抗性 片段的大
先构建 噬菌体 Ｍ１３衍生 型质粒 ，该质粒包括 含有假定 转录起 始 小。此方法必须解决 的一 个问题是 探针的长度，探针越长 ，分析
位点和其下游 的部分核苷 酸的基 因区域 、限制性酶切位点。将引 就越灵敏，但长探针形成二级结构 的概率大 ，将 导致背景信号 和
ｍＲＮＡ序 列设计 合成寡 核 苷酸引物 ，并将引物 的 ５ 末端 用 ３２ｐ 有效 定位无 效转 录基 因或其他方法不适用 的基 因转录起始位 点 ；
标 记。在根据经验确定 的反应条件下，使过量 的放射性标 记引物 缺 点是 ＰＣＲ可能优 先扩增不代表真正转 录物 ５ 末端 的产物 ，从
与总 ＲＮＡ中特异的 ＲＮＡ分 子或经过 寡聚 ｄＴ纯化的 ｍＲＮＡ退火 。 而使定位的准确性 降低 。
产物大小 ，最后进行放射 自显影或磷酸成像分析。抗性产物的长 伸至 ｍＲＮＡ ５ 末端。利用 ＲＮＡ连接酶将序列 已知 的寡聚核苷 酸
度应该与从探 针的 ５ 末 端到转 录起始位 点的距离相等。这种方 片段和 ｃＤＮＡ的 ３ 末 端连 接，再利 用和连接 上的寡 聚核 苷酸 片
法 的缺点是杂交分子易发生瞬间解离 ，产生相当多的背景条 带。 段 互补 的上游 引物和用于合成上述 ｃＤＮＡ的引物稍靠 内的下游 引
物和单链噬菌体 ＤＮＡ进行 退火，加入 Ｋｌｅｎｏｗ和 ｄＮＴＰｓ，其 中一 无效杂交 ，而且较长的探针还可能包括 噬菌体聚合酶不能有效延
种 ｄＮＴＰ经 放射性标记 ，以产生放 射性标记 的探针。利用限制性 伸 的 ＤＮＡ区域。为避 免产生大 量不完全转 录物，通常 需要对较
内切酶将 ＤＮＡ切割成线形，通过 变性凝胶电泳分离放射 性探针， 长 的探针进行凝 胶纯化。
综 述 Ｚｏｎｇｓｈｕ 《中外医学研究》第１０卷 第８期（总第１６０￣）２０１２＆Ｖ ３，４
真 核 生物 启 动子 的鉴 定 方 法
石慧① 李建远①
【摘 要】 启动子 ＲＮＡ聚合酶识别 、结合和开始转录 的一段 ＤＮＡ序列。它对基因的表达调控起着至关重要的作用。本文 对真核生物肩动子 的鉴
在 真核生物 中，启动子一直没有 明确的概 念，一般 认为启动 子是
ＲＮａｓｅ保护 ［７－８］，首先 构建质粒 ，该 质粒应含有假 定转 录起
位 于基 因编码 区上游，与 ＲＮＡ聚合酶 相互识别 、结合并启动转 始位点和其下游部分核 苷酸的基 因区域、ＳＰ６启动子 和常见的 限
录的 ＤＮＡ序列 ，它包 括在起始位 点附近直接活化 或抑制转 录的 制性酶切位 点。用相应 的限制性 内切酶将质粒切 割成 线形。再加
将反转 录酶、脱 氧核苷三磷 酸和适宜 的缓 冲液 加到引物 一ｍＲＮＡ ５ 足迹法（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）
杂交分子 体系中，催 化引物延伸到 ｍＲＮＡ的 ５ 末 端。用变性 聚
足 迹 法 （ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ） ，指 ＤＮＡ 序 列 一 旦 结 合 了 某 种 蛋 白 质 ，
丙烯 酰胺 凝胶电泳分析产生的放射性标记 的 ｃＤＮＡ产物。通过与 便 会排斥其他任何 因子的进 一步 结合。将 ＤＮＡ起 始转 录的限制
ＤＮＡ序列元件 。启动子的定位是研 究转录起始 调控 模式 的前 提， 人 转 录 缓 冲 液、ＳＰ６ＲＮＡ聚 合 酶、含 有 ｆｃ￣－３２ｐｌＵＴＰ的 ＮＴＰｓ以
能否对其精确定位是后续功能性分析成败的关键 ］。本文对真核 生 成反 义 ＲＮＡ探 针。将 探 针 和分 离 到的 ｍＲＮＡ进 行 杂交，用
旁边 的标准分子量 比较，在凝胶中检测条带的分 子量大小。然后 片段分离出来 ，加 ＲＮＡ聚合 酶使之结合。再用 ＤＮＡ聚合酶部 分
计 算从合成 的寡 核苷 酸 ５ 末端 到 ｍＲＮＡ转 录起始位 点 的距 离。 水 解，与 ＲＮＡ聚合酶结合 的部位被保 护而不水解 ，其余 部位 水
如果标 记的 ｃＤＮＡ产 物在凝 胶的分 辨率范围内，转 录起 始位 点的 解成长短不 同的片段 ，经凝胶 电泳 即可测出酶所 结合 的部位 ，即
定方 法作了简要的总结 ，并对其优缺点进行了比较 。
【关键词 】 真核 ； 启动子 ； 表达调控 ； ＲＮＡ
￣ｓｆＩｌＹ）＂类号 Ｒ３１８．０４
文献标识码 Ｂ
文章编 号 １６７４—６８０５（２０１２）０８—０１５４—０２
在 原核 生物 中，ＲＮＡ多 聚酶结 合 的位置 即为启动子 Ｊ。但 ３ ＲＮａｓｅ保 护
再将 探针和分离到的 ｍＲＮＡ进行杂交 。然后用 Ｓｌ核 酸酶进行消 ４ ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末 端的迅速扩增）
化 ，单链 ＲＮＡ和 ＤＮＡ被消化 ，生成含有部分核苷酸的双链片段。
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端的迅速扩增 ）［９－１３１，首先将引物与 ｍＲＮＡ ５ 末
通过 变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳确定放 射性标记 的抗 ｓ１核酸酶 的 端 的 １００～２００核苷 酸处 杂交 ，利用反转 录酶和 ｄＮＴＰｓ将引物延
启动子 的鉴定方法进行了简要的综述 ，并比较了优缺点。
ＲＮａｓｅＴ１和 ＲＮａｓｅＡ消化 ，ＲＮＡ分子 的单链 突出部分被消化 ，而
１ Ｓ１核 酸 酶 法
ＲＮＡ～ＲＮＡ杂交分 子抗 消化 。则探针抗消化 的长度将与探针 ５ 末
ｓ１核 酸 酶 法 口 由 Ａｒｎｏｌｄ Ｂｅｒｋ和 Ｐｈｉｌｉｐ Ｓｈａｒｐ于 １９７７年 创 端到转录起始位点的长度相等。由于该 探针是放 射性 标记的，可
２ 引物 延 伸 方 法
物进行 ＰＣＲ扩增，将扩增产物插入到载体 中，分离多个单质粒克
引物延伸 方 法 嘲 由 Ｐ．Ｋ．Ｇｈｏｓｈ和 ｓ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ于 １９７８年提 隆，对每个克隆进行 测序 ，通 过对 ＰＣＲ混合 物的许多克隆测序，
出。首先 根据与起始位点 ５ 末端下游大 约 ５０～１５０个核苷酸 的 可 以推 测 ＲＮＡ起 始位 点的位 置。ＲＡＣＥ的优点 是灵敏 度高，可