真核生物启动子的鉴定方法

２ 引物 延 伸 方 法
物进行 ＰＣＲ扩增，将扩增产物插入到载体 中，分离多个单质粒克
引物延伸 方 法 嘲 由 Ｐ．Ｋ．Ｇｈｏｓｈ和 ｓ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ于 １９７８年提 隆，对每个克隆进行 测序 ，通 过对 ＰＣＲ混合 物的许多克隆测序，
出。首先 根据与起始位点 ５ 末端下游大 约 ５０～１５０个核苷酸 的 可 以推 测 ＲＮＡ起 始位 点的位 置。ＲＡＣＥ的优点 是灵敏 度高，可
ｍＲＮＡ序 列设计 合成寡 核 苷酸引物 ，并将引物 的 ５ 末端 用 ３２ｐ 有效 定位无 效转 录基 因或其他方法不适用 的基 因转录起始位 点 ；
标 记。在根据经验确定 的反应条件下，使过量 的放射性标 记引物 缺 点是 ＰＣＲ可能优 先扩增不代表真正转 录物 ５ 末端 的产物 ，从
与总 ＲＮＡ中特异的 ＲＮＡ分 子或经过 寡聚 ｄＴ纯化的 ｍＲＮＡ退火 。 而使定位的准确性 降低 。
产物大小 ，最后进行放射 自显影或磷酸成像分析。抗性产物的长 伸至 ｍＲＮＡ ５ 末端。利用 ＲＮＡ连接酶将序列 已知 的寡聚核苷 酸
度应该与从探 针的 ５ 末 端到转 录起始位 点的距离相等。这种方 片段和 ｃＤＮＡ的 ３ 末 端连 接，再利 用和连接 上的寡 聚核 苷酸 片
法 的缺点是杂交分子易发生瞬间解离 ，产生相当多的背景条 带。 段 互补 的上游 引物和用于合成上述 ｃＤＮＡ的引物稍靠 内的下游 引
定方 法作了简要的总结 ，并对其优缺点进行了比较 。
【关键词 】 真核 ； 启动子 ； 表达调控 ； ＲＮＡ
￣ｓｆＩｌＹ）＂类号 Ｒ３１８．０４
文献标识码 Ｂ
文章编 号 １６７４—６８０５（２０１２）０８—０１５４—０２
在 原核 生物 中，ＲＮＡ多 聚酶结 合 的位置 即为启动子 Ｊ。但 ３ ＲＮａｓｅ保 护
旁边 的标准分子量 比较，在凝胶中检测条带的分 子量大小。然后 片段分离出来 ，加 ＲＮＡ聚合 酶使之结合。再用 ＤＮＡ聚合酶部 分
计 算从合成 的寡来自百度文库核苷 酸 ５ 末端 到 ｍＲＮＡ转 录起始位 点 的距 离。 水 解，与 ＲＮＡ聚合酶结合 的部位被保 护而不水解 ，其余 部位 水
如果标 记的 ｃＤＮＡ产 物在凝 胶的分 辨率范围内，转 录起 始位 点的 解成长短不 同的片段 ，经凝胶 电泳 即可测出酶所 结合 的部位 ，即
ＤＮＡ序列元件 。启动子的定位是研 究转录起始 调控 模式 的前 提， 人 转 录 缓 冲 液、ＳＰ６ＲＮＡ聚 合 酶、含 有 ｆｃ￣－３２ｐｌＵＴＰ的 ＮＴＰｓ以
能否对其精确定位是后续功能性分析成败的关键 ］。本文对真核 生 成反 义 ＲＮＡ探 针。将 探 针 和分 离 到的 ｍＲＮＡ进 行 杂交，用
再将 探针和分离到的 ｍＲＮＡ进行杂交 。然后用 Ｓｌ核 酸酶进行消 ４ ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末 端的迅速扩增）
化 ，单链 ＲＮＡ和 ＤＮＡ被消化 ，生成含有部分核苷酸的双链片段。
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端的迅速扩增 ）［９－１３１，首先将引物与 ｍＲＮＡ ５ 末
通过 变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳确定放 射性标记 的抗 ｓ１核酸酶 的 端 的 １００～２００核苷 酸处 杂交 ，利用反转 录酶和 ｄＮＴＰｓ将引物延
在 真核生物 中，启动子一直没有 明确的概 念，一般 认为启动 子是
ＲＮａｓｅ保护 ［７－８］，首先 构建质粒 ，该 质粒应含有假 定转 录起
位 于基 因编码 区上游，与 ＲＮＡ聚合酶 相互识别 、结合并启动转 始位点和其下游部分核 苷酸的基 因区域、ＳＰ６启动子 和常见的 限
录的 ＤＮＡ序列 ，它包 括在起始位 点附近直接活化 或抑制转 录的 制性酶切位 点。用相应 的限制性 内切酶将质粒切 割成 线形。再加
启动子 的鉴定方法进行了简要的综述 ，并比较了优缺点。
ＲＮａｓｅＴ１和 ＲＮａｓｅＡ消化 ，ＲＮＡ分子 的单链 突出部分被消化 ，而
１ Ｓ１核 酸 酶 法
ＲＮＡ～ＲＮＡ杂交分 子抗 消化 。则探针抗消化 的长度将与探针 ５ 末
ｓ１核 酸 酶 法 口 由 Ａｒｎｏｌｄ Ｂｅｒｋ和 Ｐｈｉｌｉｐ Ｓｈａｒｐ于 １９７７年 创 端到转录起始位点的长度相等。由于该 探针是放 射性 标记的，可
立，近 年来 关于该方 法的优化 有许 多报道 ［４－５］ｏ其基 本原理是首 以在高分 辨率 的变性 聚丙烯酰胺 凝胶 电泳上 观察抗性 片段的大
先构建 噬菌体 Ｍ１３衍生 型质粒 ，该质粒包括 含有假定 转录起 始 小。此方法必须解决 的一 个问题是 探针的长度，探针越长 ，分析
位点和其下游 的部分核苷 酸的基 因区域 、限制性酶切位点。将引 就越灵敏，但长探针形成二级结构 的概率大 ，将 导致背景信号 和
物和单链噬菌体 ＤＮＡ进行 退火，加入 Ｋｌｅｎｏｗ和 ｄＮＴＰｓ，其 中一 无效杂交 ，而且较长的探针还可能包括 噬菌体聚合酶不能有效延
种 ｄＮＴＰ经 放射性标记 ，以产生放 射性标记 的探针。利用限制性 伸 的 ＤＮＡ区域。为避 免产生大 量不完全转 录物，通常 需要对较
内切酶将 ＤＮＡ切割成线形，通过 变性凝胶电泳分离放射 性探针， 长 的探针进行凝 胶纯化。
综 述 Ｚｏｎｇｓｈｕ 《中外医学研究》第１０卷 第８期（总第１６０￣）２０１２＆Ｖ ３，４
真 核 生物 启 动子 的鉴 定 方 法
石慧① 李建远①
【摘 要】 启动子是 ＲＮＡ聚合酶识别 、结合和开始转录 的一段 ＤＮＡ序列。它对基因的表达调控起着至关重要的作用。本文 对真核生物肩动子 的鉴
将反转 录酶、脱 氧核苷三磷 酸和适宜 的缓 冲液 加到引物 一ｍＲＮＡ ５ 足迹法（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）
杂交分子 体系中，催 化引物延伸到 ｍＲＮＡ的 ５ 末 端。用变性 聚
足 迹 法 （ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ） ，指 ＤＮＡ 序 列 一 旦 结 合 了 某 种 蛋 白 质 ，
丙烯 酰胺 凝胶电泳分析产生的放射性标记 的 ｃＤＮＡ产物。通过与 便 会排斥其他任何 因子的进 一步 结合。将 ＤＮＡ起 始转 录的限制