第四章蛋白质的化学修饰

O C H
O
CH3 -H2O NH
O ENZ— N C H
CH2 OPO3H-
+H2O
NaBH4
PLP
O ENZ—NH CH2 CH3 NH CH2 OPO3H-
二、精氨酸胍基的修饰
具有两个临位羰基的化合物能与精氨酸 胍基形成稳定的杂环产物。 常用试剂有：丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛。
产物不可逆，在325 nm处有吸收，可用 于定量测定。
1.如果修饰发生在活性部位或必需基团上，则蛋白质活性的 丧失于修饰程度一定成某种化学计量关系，而且底物必然能 降低修饰蛋白质的失活程度，而与活性部位不能结合的分子 则没有这种影响。 2.当采用可逆保护试剂时，修饰失活的蛋白质随保护基的去除 可重新恢复活力，而且恢复程度应与保护基去除量成一定比例 关系。 修饰剂也可修饰远离活性部位的氨基酸，使蛋白质构象发生改 变，造成蛋白质活力丧失。引入带电或庞大基团时易出现这种 情况。
ICH2
COO-+蛋白质—SH
pH﹥7 pH﹥2
蛋白质—S —CH2COO-+H++ICH3 蛋白质—S —CH2COO-+I蛋白质—NH—CH2COO-+H++I蛋白质
N N CH2COO-
ICH2COO-+蛋白质—SCH3 ICH2COO-+蛋白质—NH2
pH﹥8.5
H N pH﹥5.5
ICH2COO- +蛋白质
O
C C
R
ENZ N C
R
H R OH N C N C H R HO
ENZ N C
H R N C R N C H O
丁二酮
对色、甲硫、胱氨酸反应性影响最小 局部极性 的变化 对氨基和组氨酸反应性影响较大 对酪、半胱氨酸、羧基反应性影响最大
（二）氢键效应 天然蛋白质或它的离子通过氢键来维持其稳定性，也 是使pk值发生改变的一个因素．
例如：2-氟酚的pk值比2-溴酚的pk值高0.7pH单位，原因是氟 与酚形成氢键的能力比溴强。 HO O
第 4 章 蛋白质的 化学修饰
内容提要
化学修饰的原理 化学修饰的方法学 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 亲和标记
蛋白质化学修饰的应用
化学修饰：凡通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质 共价结构发生改变的现象。
选择性化学修饰：肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
第一节 化学修饰的原理
蛋白质功能 基的反应性
蛋白质的构象和表面特性对氨基酸侧链的反应性有影响，同样， 它们也可能对接近功能基的修饰剂产生有利或不利的影响。
5.试剂的结合。
（一）选择吸附
化学修饰前，修饰剂根据各自的特点，选择性地吸附在低或高极 性区，根据对速度的饱和效应，可检测出蛋白质-修饰剂复合物 的形成。
D-氨基酸氧化酶的巯基与N-烷基马来酰亚胺的反应，巯基的辛 基化速度比乙基化速度快15倍。
影响因素
修饰剂的 反应性
一、影响蛋白质功能基反应性的各因素
因为大多数蛋白质分子是（亲水的表面，疏水的核），所以pk值 和影响pk值的因素应特别关注。 在水中为4.76 （一）微区的极性 醋酸的 在80%乙醇中为6.87 微区的极性是决定基团解 pk值 离状态的关键因素之一。 在100%乙醇中为10.32 微区的极性与介质的介电常数有关。
2.用甲基乙亚酰胺脒化
ENZ—NH2
+
H2N
pH﹥8.5
C R
NH2 ENZ—NH C R + R OH
RO 甲基乙亚酰胺
（二）消除电荷的修饰
这类试剂可抑制赖氨酸的ε-NH2的质子化，使形成的衍生物不带 电。
1.乙酰化
ENZ—NH2
O
+
C CH3 pH﹥7 O C CH3 O 醋酸酐
O ENZ—NH C CH3
修饰反应要完成到什么程度； 对个别氨基酸残基是否专一； 在反应条件下，修饰反应有没有限度； 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变； 是否需要分离修饰后的衍生物； 反应是否需要可逆； 是否适合于建立快速、方便的分析方法。
选择蛋白质修 饰剂要考虑：
用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备的特 征：
选择性地与一个氨基酸残基反应； 反应在酶蛋白不变性的条件下进行； 标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来进行鉴定； 反应的程度能用简单的方法测定。
（二）反应条件的选择
不造成蛋白质 的不可逆变性
条件
有利于专一性 修饰蛋白质
（三）反应的专一性
若修饰剂专一性较差，除控制反应条件外，可利用其它途径实 现修饰的专一性。
1.利用蛋白质分子中，某些基团的特殊活性蛋白质，特 殊的空间结构，能影响某些基团的活性
位置专一性：在蛋白质分子中特别活泼的基团，在适当条件下 只是其本身发生作用，而其它基团皆不作用。
(二）修饰残基的不稳定性
原始修饰以后，还可能发生共价改变。 如酰基转移、巯基转移、卤素转移及二硫交换过程可能自发地 或在纯化、降解过程中发生。
（三）没有被发现的修饰
咪唑基、巯基、羧基等在反应条件下不稳定或在以后的纯化 中被水解，因而检测不出。
有些修饰反应不能检测出来，是由于它们在蛋白质化学中不 占优势。
N
+H++I-
3.利用某些产物的不稳定性
在高pH下，氰酸、二硫化碳等可把氨基转变成脲和脲的衍生 物。但因pH高，巯基与试剂反应的产物迅速被分解。
4.亲和标记
亲和标记试剂除了能与蛋白质作用外，还要求试剂的结构和与蛋 白质作用的底物或抑制剂相似。
5.差别标记
在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋白 质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然后将过量 的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与含同位 素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的 基团是带放射性同位素标记的。
ENZ C
+ HNCO+ H2O pH=5
O ENZ C O C NH2 + OHO
羧基
ENZ
N H 咪唑基
N + HNCO pH=8
ENZ
N H
N C NH2 O
3.芳基化
三硝基苯磺酸（TNBS）与氨基作用，产生三硝基苯衍生物，反 应产物为黄色。 TNBS也能与巯基作用。
NO2 NO2 SO3H + NH2R NO2
2.选择不同的反应pH
蛋白质分子中各功能基的解离常数是不同的，所以控制不同的 反应pH，也就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的 专一性。 碘乙酸对蛋白质进行修饰，试剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组 氨酸的侧链及α -氨基、ε -氨基发生作用。
当反应pH=6时，只专一地与组氨酸的咪唑基作用。 当反应pH=3时，只专一地与甲硫氨酸的侧链作用。 在酸性pH下，比较活泼的巯基和氨基，以带质子形式存在， 变成不活泼状态。
影响超反应性的因素：
1.改变蛋白质功能基的pk值；
木瓜蛋白酶中的19个酪氨酸残基， 只有一个能与修饰剂反应，修饰 后酶活性并不改变，说明什麽？
2.蛋白质功能基具有较大的亲核性；
3.通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； 4.试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性；
超反应性可由上述一个或几个因素的综合作用而产生。 三、修饰剂反应性的决定因素
α -溴代己酸不能反应。
（四）催化因素
修饰部位附近的其它功能基，如果起一般的酸碱催化作用，也 能影响修饰反应。不同的修饰剂，反应速度和反应部位有明显 差异。 胰凝乳蛋白酶活性中 硝基苯乙酸盐反应强
心丝氨酸的乙酰化 苯乙酸盐反应弱
（五）局部环境的极性
溶剂效应是复杂的。有些有机反应的速度与溶剂的极性有关，有 些反应则与极性无关。 溶剂极性对反应速度的影响 反应类型
⑴RSR+ICH2CONH2→[R2S+CH2CONH2]I-
降低极性对速度的影响
适当降低或大大降低 没有影响
⑵RSR+H2O2→R2SO+H2O
⑶RS-+ICH2CONH2→RSCH2CONH2+I⑷RNH3++OCN- →RNHCONH2
没有影响
适当增加或大大增加
疏水环境
阻止产物中电荷分离的反应 反应类型⑴
TNBS pH﹥7
NO2 NO2 NHR + SO3H +H+ NO2
（黄色）
（三）引入负电荷的修饰 1.乙酰化 此反应类似于醋酸酐与氨基的反应，但酸酐所带的负电 荷全部引入到侧链上。
O O C CH2 pH﹥7 + ENZ—NH2 + O CH O + H C CH C ENZ NH 2 2 C CH2 O
修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件 来控制。
如果修饰的目的是改变蛋白质的带电状况或溶解性， 必须选择能引入最大电荷量的试剂。 如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质 中反应，则应选择在水中有一定溶解性的试剂。 还必须考虑，反应生成物容易进行定量测定；试剂的 体积小一些为宜。
+ CH3COO-+H+
优点是氰酸盐 离子体积小
2.甲氨酰化作用
ENZ—NH2 + HNCO
pH=7
O ENZ—NH C NH2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
副反应：
氰酸盐
ENZ—S- + HNCO+ H2O 巯基
pH6～8
O ENZ—S C NH2 + OH-
ENZ
O- + HNCO+ H2O 酚基
O O-
pH﹥5
ENZ
O O C NH2 + OH-
第三节 蛋白质侧链的修饰
一、氨基的修饰
（一）引入正电荷的修饰
氨基 修饰
引入正电荷的修饰 电荷消失的修饰 引入负电荷的修饰
下列试剂修饰赖氨酸后，可在赖氨酸侧链上留下可电离的带正 电基团。 所用的醛有不同R基 1.还原烷基化
-H2O
ENZ—NH2 + RHCO
醛
ENZ—N=CHR
希夫碱
[H]
+H2O
ENZ—NH—CH2R
琥珀酸酐
O
琥珀酸酐和苯四酸酐都可用于将负电荷引入到赖氨酸 侧链上，但用苯四酸酐引入的负电荷多。 修饰产物在低pH下保温24小时，可使蛋白质活力完全 恢复。
2.磷酸吡哆醛修饰
赖氨酸残基在中性pH下与磷酸吡哆醛（PLP）反应，形成希夫碱， 再用硼氢化钠还原，得赖氨酸的不可逆衍生物。
ENZ—NH2 +
CH3 NH CH2 OPO3H-
（四）位阻效应 如果烷基在空间上紧靠功能基，修饰剂不易与功能基反 应，出现位阻效应。 二、蛋白质功能基的超反应性
影响功能基反 应性的因素
影响功能基pk值
基团之间的功能障碍
超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常 迅速的反应。
多数蛋白质的功能基与简单氨基酸中的同样基团相比，反应性 要差。但是，每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂 显示出超反应性。
A
H ENZ
NH2 NH2
O
pH7.8
25℃
H N C O N C O O CH C
CH2 N C
+2
苯甲酰甲醛
H ENZ
C C H O
CH2 N C H
+H2O
NH2
B
ENZ NH C NH2
+
O
CH
ENZ NH C
N N
CH CH
O CH
+ 2H2O
乙二醛
C
NH2 ENZ NH C NH2
O
+
加速电荷中和的反应 反应类型⑷
对于没有电荷分离和电荷只是从一个离子转移到另一个离子的反 应，则介质的极性不重要。
第二节 化学修饰的方法学 一、修饰反应专一性的控制 （一）试剂的选择 选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。 对氨基 的修饰
修饰所有氨基，而不修饰其它基团; 仅修饰α -氨基； 修饰暴露的或反应性高的氨基，以及 修饰有催化活性的氨基等。
6.利用蛋白质状态的差异
在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。
二、修饰程度和修饰部位的测定
最常使用的是间接法。
三、化学修饰结果的解释
在确证试剂已经作用于蛋白质的基础上，除验证修饰蛋白质在 溶液中的构象是否发生变化外，还要证明修饰作用是否发生在 活性部位上。
（一）蛋白质功能改变的解释
常用方法：
OH OH
C
F
Br
水杨酸
（三）静电效应
OH
研究表明，不同蛋白质中的组氨酸残基的pk值是不同 的，原因是由于带电基团相互影响所致。
例如：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基，其pk 值是： 碳酸酐酶： 5.91； 6.04； 7.00； 7.23 葡萄球菌核酸酶： 5.37； 5.71； 5.74； 6.50 影响蛋白质中可电离氨基酸侧链的pk值的因素，也是影响侧链基 团反应性的重要因素。蛋白质中个别功能基所处的微区不同，反 应性也不同，个别功能基的反应性可通过竞争标记法来测定。
（二）静电相互作用
带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部 位。 静电排斥力能抑制修饰作用。
（三）位阻因素
蛋白质表面的位阻因素，或者底物、辅助因子、抑制剂所产生 的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。 α -溴代丁酸反应很快；
核糖核酸酶第12 号组氨酸烷化
α -溴代戊酸反应很慢；