实验六 过氧化物酶活性测定

实验六过氧化物酶活性测定

一、实验目的

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。

二、实验原理

在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。

四、设备与试剂

分光光度计，TDL-5000B型低速冷冻多管离心机(R=18cm)，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。0.05mol·L-1的磷酸缓冲液（pH5.5），0.05mol·L-1愈创木酚溶液，2％H2O2。

五、实验步骤

（一）酶液的制备

取1.0～5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000×g离心10min，上清液转入25mL容量瓶中。沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。

（二）过氧化物酶活性测定

酶活性测定的反应体系：依次加入 2.9mL0.05mol·L-1磷酸缓冲液；1.0mL2％H2O2；1.0mL0.05mol·L-1愈创木酚和0.1mL 酶液。用加热煮沸5min 的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34℃水浴中保温3min，然后迅速稀释1倍，470nm 波长下比色，每隔1min记录1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位（U）。

六、实验结果

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。

W——马铃薯鲜重（g）；

t——反应时间（min）；

VT——提取酶液总体积（mL）；

VS——测定时取用酶液体积（mL）。

七、注意事项

酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。

实验七过氧化氢酶活性的测定

一、实验目的

过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。熟悉过氧化氢酶活性的不同测定方法。

二、实验原理

滴定法：过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢，即可求出消耗的H2O2的量。

5H2O2+2KMnO4+4H2SO4→5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

氧电极法：过氧化氢在过氧化氢酶的作用下，放出氧气，其放氧量与过氧化氢酶的活性成正比。放出的氧可用氧电极定量测定。

磷酸盐缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，即得。

磷酸盐缓冲液(pH7.8)：取磷酸氢二钠35.9g，加水溶解，并稀释至500ml。

已液：取磷酸氢二钠2.76g，加水溶解，并稀释至100ml。取甲液91.5，乙8.5混合得