人外周血淋巴细胞分离
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。
下面是使用该试剂的详细说明：
1. 实验准备：
- 准备干净的工作台和操作工具。
- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。
- 为实验准备足够数量的外周血样本。
2. 样本处理：
- 从被试者的外周血中采集适量的血液。
- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。
3. 样本离心：
- 将含有外周血的离心管放入离心机中。
- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。
4. 废液处理：
- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。
5. 细胞分离：
- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1 mL的细胞悬浮液。
- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。
- 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。
6. 细胞收集：
- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。
- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。
- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。
请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。
在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。
同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。
希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。
外周血细胞分离的方法有几种
外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细
胞的重要来源。
其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法。
自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中，在37℃水浴中静置，自然沉降1-2h，可见到红细胞下沉，并有明显分层，上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞，下层主要为红细胞。
此方法简便但各层中
的细胞种类多，不纯。
血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主，但也含有血小板，大单核细胞和
少量红细胞。
下层虽以红细胞为主，但也有上述各种细胞，此法适用于淋巴细胞转化试验。
差异沉降法：
用6%的右旋糖酐或3%的明胶溶液无菌消毒后，分装于中试管中，由于这些物质能使红细胞
形成“串状”，比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快，因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开。
其方法如下：用6%的右旋糖酐溶液5-10ml，经抗凝血5ml加入上层中混合后静置于37℃水
浴中30-60min，即可见红细胞下沉，上层富含大量粒细胞和淋巴细胞，下层为红细胞，使两
者易于分离开，取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验，下层可用于红细胞培养和实验，经PBS洗3次后即可加入培养基培养，可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产。
此法分离的细胞纯度也不高。
氯化铵分离法：
0.83%氯化铵（NH4CL）可使红细胞破裂，通常将分离获得的粒细胞。
淋巴细胞中混有的少
量的红细胞用0.83%氯化铵进行裂解，以排除红细胞的干扰。
另外，此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备，在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用。
提取外周血淋巴细胞
/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。
现在大多数用的密度梯度离心法。
一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。
现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。
我的经验1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
4. 离心 .转速：1500/分温度20c －28c时间：20分钟no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)5。
取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。
还有办法的。
8 离心。
转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)时间：10分钟温度：4c9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）10.细胞计数＋洗涤细胞。
刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。
这样是不是很节省时间？？11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液使用说明使用人外周血淋巴细胞分离液的步骤如下：1.样本准备：准备外周血样本，并将其采集到一个干净的试管中。
确保样本是新鲜的，并在使用前充分混合。
2.离心：将样本离心，以去除血浆或血浆和血小板，通常以低速（300×g）离心5-10分钟。
将离心管中的血浆小心吸除。
3.阻止红细胞溶解：加入足够的红细胞阻断缓冲盐溶液到血细胞沉淀中，使其与样本体积相等。
这将阻止红细胞的溶解和污染淋巴细胞。
4.包裹淋巴细胞：将滤质或管中的混合物转移到一个滤筒或离心管中，并加入合适的分离液。
分离液的添加量通常是样本体积的2-3倍。
5.混合和离心：彻底混合分离细胞和分离液，然后以适当的速度和时间进行高速离心（500×g，5-10分钟）。
此步骤将导致淋巴细胞在分离液的底部形成一个沉淀。
6.转移沉淀：使用无菌吸管或移液器小心地将沉淀转移到干净的离心管中，以避免污染。
7.洗涤：向沉淀中加入足够的平衡缓冲盐溶液，如磷酸缓冲盐溶液，轻轻混合后进行低速离心。
再吸去上清液，保留沉淀。
8.储存：沉淀可在冷藏条件下暂时储存，或冷冻保存以备将来使用。
需要注意的是，在使用人外周血淋巴细胞分离液时，一些步骤可能因其具体的类型和制造商而有所不同。
因此，建议在使用前仔细查阅并遵守产品说明书和使用手册。
此外，使用前要确保实验室操作是在严格的无菌条件下进行的，以避免污染和细胞的损伤。
总而言之，人外周血淋巴细胞分离液是一种用于从人类外周血样本中分离和富集淋巴细胞的试剂。
准确遵循产品说明和使用手册中的步骤和建议，能够帮助实验者在研究和临床应用中有效地使用该分离液。
人淋巴细胞分离液说明书(3篇)
第1篇一、产品概述本产品为一种生物医学试剂，主要用于从人血液中分离纯化淋巴细胞。
淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分，广泛用于免疫学研究和临床诊断。
本产品采用特殊的分离技术，能够高效、快速地从人外周血中分离出高纯度的淋巴细胞，为后续的免疫学研究提供高质量的实验材料。
二、产品规格| 产品规格 | 批号 | 有效期 || :-------: | :---: | :----: || 100ml/瓶 | ABC123 | 2025年12月 |三、产品特性1. 高效分离：本产品采用独特的分离介质，能够高效地将淋巴细胞与其他血细胞分离，分离效率高，纯度好。
2. 操作简便：本产品使用方法简单，无需特殊设备，适合实验室常规操作。
3. 稳定性好：本产品在规定的储存条件下，稳定性良好，保质期内质量稳定。
4. 无污染：本产品在生产过程中严格遵循无菌操作规程，产品无细菌、病毒等生物污染。
四、产品用途1. 免疫学研究：用于分离淋巴细胞，进行细胞因子检测、细胞培养、细胞因子基因表达等研究。
2. 临床诊断：用于检测血液中的淋巴细胞，辅助诊断某些疾病，如自身免疫性疾病、肿瘤等。
3. 药物研发：用于药物筛选、药效评价等。
五、使用方法1. 准备工作：- 将分离液室温下平衡至室温。
- 准备无菌试管、移液器、吸头等实验器材。
- 准备适量抗凝剂（如EDTA-K2）。
2. 操作步骤：- 将抗凝全血加入分离管中，轻轻混匀。
- 将分离液加入另一支无菌试管中，加入量约为全血量的2倍。
- 将全血和分离液轻轻混合，避免产生气泡。
- 将混合后的样品垂直静置1-2小时，直至形成清晰的三层界面。
- 小心吸取淋巴细胞层，避免混入其他细胞层。
- 将淋巴细胞转移至新的无菌试管中，加入适量磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，重复洗涤2-3次，以去除残留的分离液和杂质。
- 最后，将洗涤后的淋巴细胞悬浮于适量的PBS中，即可进行后续实验。
六、注意事项1. 操作过程中应严格遵守无菌操作规程，防止污染。
免疫实验 人外周血单核细胞分离
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验 细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异 始 应h合性 母 答o c成抗 细 功yte
二 、 B细胞 增殖 试验
B 细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高 R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
酶联免疫斑点法 （En zym e-Link edImm un o spo t,
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
4. 计数：将EP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
qPCR 样本处理(1) 人外周血淋巴细胞RNA的提取方法
qPCR 样本处理(1) 人外周血淋巴细胞RNA的提取方法qpcr样本处理(1)----人外周血淋巴细胞rna的提取方法人外周血淋巴细胞rna的提取方法一、收集血样，室温留存。
采用一次性的抗凝的真空扣血管展开献血。
通常采用edta 或肝素抗凝均可；血量通常为1ml；通常地，1ml外周血中所含大约1-2*10^6个单个核细胞（pbmc，即为淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
取1.5ml无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ulpbs（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。
然后缓慢把混匀的血样pbs混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：1、从收集血样至已经开始实验的时间最出色不少于4小时。
实验过程中一直维持室温条件，通常20摄氏度比较相对较低，因为细胞的拉沙泰格赖厄县温度就是体温37摄氏度，但是温度减少又可以减少细胞的新陈代谢，两者有些矛盾，所以挑中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞拆分液就是一种根据细胞密度差异，利用Vergt产生的重力加速度，展开细胞的拆分提纯的常用试剂，为具有乳光或微乳光的杀菌水溶液，主要成分就是葡聚糖与和泛影酸葡甲胺。
人外周血淋巴细胞培养
通过人外周血淋巴细胞培养，可以研究疾病的预 防策略，如利用疫苗进行预防接种等。3Fra bibliotek个体化医疗
利用人外周血淋巴细胞培养，可以开展个体化医 疗研究，根据患者的免疫状况制定个性化的治疗 方案。
05
结论
研究成果总结
01
成功建立了人外周血淋巴细胞的培养方法，并观察到了淋巴细胞的生 长和增殖过程。
02
细胞活性检测
使用台盼蓝染色等方法检测细胞的活性。
培养基检测
定期检测培养基的pH值和营养物质浓度， 确保培养条件适宜。
04
人外周血淋巴细胞培养的 应用和前景
在免疫学研究中的应用
免疫应答机制研究
通过人外周血淋巴细胞培养，可以深入了解免疫应答的机 制，包括抗原识别、信号转导、细胞活化等过程。
免疫细胞功能分析
淋巴细胞分为T细胞、B细胞和NK细胞等多种类型，每种细胞类型具有不同的功能和 特点。
淋巴细胞在人体健康和疾病发生中起着至关重要的作用，因此研究淋巴细胞对于了 解疾病机制和开发治疗手段具有重要意义。
淋巴细胞培养技术
淋巴细胞分离技术
淋巴细胞功能检测方法
通过密度梯度离心法和免疫磁珠分离 法等手段从外周血中分离出淋巴细胞。
疫苗免疫原性研究
通过培养的人外周血淋巴细胞，可以研究疫苗对免疫系统的刺激作 用，评估疫苗的免疫原性。
疫苗效果评估
利用人外周血淋巴细胞培养，可以对疫苗进行效果评估，包括疫苗 的保护率、免疫持久性以及对不同人群的适应性等。
在疾病治疗和预防中的应用前景
1 2
疾病治疗
利用人外周血淋巴细胞培养，可以为某些疾病的 治疗提供支持，如肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾 病治疗等。
研究意义
实验三外周血单个核细胞分离
实验目的
掌握外周血单个核细胞分离的原理与操作 掌握外周血单个核细胞的概念
实验原理
人外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell， PBMC）包括淋巴细胞 和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和比重与外周 血其他细胞不同。因此利用一种介于 1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺 （ficoll-hypaque）分离液作密度梯度 离心，离心后不同比重的血细胞在分离 液中中各种细胞的密度如下：
红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/H= 1.077±0.001
实验步骤
1.用抗凝管抽取外周血2ml； 2.将装有2ml分离液的试管微微倾斜，用吸管
将抽取的抗凝外周血缓缓加入到分离液上 层，保持液面分层清晰； 3.水平离心机中离心，2000rpm，20min； 4.将离心好的试管轻轻拿出，用毛细吸管吸取 PBMC层细胞涂片； 5.将涂片进行瑞氏染色。
封抗操作规程
人外周血淋巴细胞分离操作规程原理：采用密度梯度离心法提取人外周血淋巴细胞用于培养或治疗材料：淋巴细胞分离液、RPMI1640（无血清）/PBS/Hank’s液、RPMI1640完全培养液、刻度离心管、吸管、血球计数板、水平转头离心机等。
步骤：1.将采到的肝素抗凝血取样计数白细胞总数。
2.使用Hank’s液/PBS液/无血清RPMI1640将血样1：1稀释，混匀时要沿管壁吹出，避免产生气泡。
吹匀后于37℃水浴中平衡。
3.从冰箱中取出4℃避光保存的淋巴细胞分离液。
摇匀后在无菌状态下加入刻度离心管中。
操作中尽量避免吸管碰触管壁。
原则上分离液的高度不超过管高的1/4。
4.将盛有分离液的离心管放入37℃水浴中平衡。
5.用吸管将稀释的血液沿离心管壁徐徐加到分离液面上，用力要轻，避免血液冲入分离液中，使得稀释血重叠在分离液面以上，拧紧管盖。
稀释血与分离液的高度比在1：2-2：1之间。
原则上两者的总高度不超过离心管的2/3。
6.将离心管放置于水平离心机中，室温下 2000rpm离心20min。
离心过程中要观察离心速度是否正确，且在停止时选择“no break”，避免因为急剧减速将已经分离的单个核细胞层重新弄混。
注意离心结束时的减速过程，不要太快。
7.离心结束后可见管内分为四层，从上至下分别为：血浆层（含部分血小板）、白膜层（含单个核细胞及少量血小板）、分离液层、粒细胞及红细胞层。
将吸管轻轻穿过血浆层至白膜层，沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白膜层细胞，置于新离心管中。
尽量少吸取分离液。
8.加吸出体积5倍以上的Hank’s/PBS/无血清RPMI1640液体，用吸管吹打均匀，避免产生气泡，液拄高度不要超过离心管的2/3。
室温1500rpm离心10min，快速倾倒出上清液。
9.用Hank’s/PBS/无血清RPMI1640重悬细胞，注意吹打均匀，不要有细胞团块。
室温下1500rpm离心5min，洗涤两次。
最后一次洗涤时定量加入RPMI1640，吹打均匀后取样计数细胞。
人全外周血血浆与PBMC分离
人全外周血血浆与PBMC分离
前期准备：离心机降温；
冻存液配制：血清：DMEM:DMSO按5：4：1的比例配制
1.拿到血，配平，500g x4℃离心5分钟，升6降5(加速度);
2. 上清为血浆，取上清分装至冻存管保存至-80℃冰箱；
3.往剩余的血中加入3-4ml PBS稀释血液，取50ml离心管加入15-20ml人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll) ，用胶吸管将血缓慢加入装ficoll的离心管中。
4．400g x20℃离心25分钟，升5降0(加速度);
5.离心完后轻轻吸掉上清，取中间飘浮的一层细胞，加4-5ml PBS，400G离5分钟，升6降5(加速度),
6. （方法同冻细胞）加入3-5ml冻存液，分装至冻存管冻存3-5管，转到程序降温盒，放入-80℃冰箱冻存。
外周血淋巴细胞分离
外周血淋巴细胞分离：外周血淋巴细胞分离是一种实验技术，用于分离外周血中的淋巴细胞。
淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞，参与机体的免疫应答反应。
外周血淋巴细胞分离通常用于研究淋巴细胞的特性、功能和作用机制，以及用于诊断和监测某些疾病，如淋巴瘤、白血病、自身免疫性疾病等。
外周血淋巴细胞分离的原理是利用各种血细胞的密度不同，通过离心和分层液的分离作用，将淋巴细胞从其他血细胞中分离出来。
常用的分离方法包括密度梯度离心法和免疫磁珠分离法等。
淋巴细胞分离与培养
• （2）培养空间 • 培养液与液面上的空间二者的体积比例 一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好 维持在2～5mm 的范围,以便于气体交 换。 • （3）恒温培养箱 • 温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。
• 5、常见失败原因 • (1) 污染 • 污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括 细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。 支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响 较小,尤其只培养72 小时。一般是分离 过程中的用液和培养基出现了污染。
• EB病毒可有效地转化外周血B淋巴细胞, 建立永生的淋巴母细胞系,可永久保存宝 贵的病例材料。世界上许多遗传研究中 心都用此方法处理每一份血标本，在液 氮中冻存转化后的淋巴细胞。这样就可 以无限期地保存、复苏和增殖病人体细 胞样本，建立人类遗传种质库
• 淋巴细胞是EBV的天然宿主，EBV对B 细胞有天然的亲和力并可使其发生转化 并增殖。与通常在体外使用的B细胞活化 剂引起的B细胞的暂时的一过性分裂不同， EBV转化的淋巴细胞是一种非裂解型细 胞：病毒感染后不能在细胞体内复制后 代，但能整合在宿主细胞基因组上，一 部分整合了病毒基因组的细胞发生转化
• （2）血样本的采集：先以碘酒和75%乙 醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约 0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血 1ml。转动针筒以混匀肝素 • （3）接种：常规消毒后，立即将针头插入 灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁 将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养 瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾 斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以 混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温 箱内静置培养72h。
• 2、方法 • (1)．采静脉血2ml 加入肝素抗凝管 • (2)．用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用 玻璃棒），2000rPm 离心20 分钟，用毛 细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中， 于4℃冰箱保存备用，
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
淋巴细胞分离液
Lymphocyte Separation Medium(淋巴细胞分离液）Density(密度) = 1.077-1.080 g/mL at 20ºC【分离目的】方便在人体外对机体各种免疫细胞分别作鉴定，计数或功能测定。
淋巴细胞分离以后可以做淋巴细胞抗原片制备，E花环试验，淋巴细胞转化试验，淋巴细胞培养（需无菌操作）【分离原理】人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低，根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。
分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。
此次实验采用的1就是密度梯度离心法。
其原理是：人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。
密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。
【材料】1、肝素抗凝管，普通管（负压），采血针，血清收集管2、淋巴细胞分离液(比重1.077– 1.080 g/mL）。
3、无Ca++、Mg++、Hank's 液4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。
5置于冰箱的冷丙酮（固定细胞，保持细胞的完整性）【方法】1．采静脉血2ml加入肝素抗凝管（或枸橼酸钠），3ml加入普通管。
2．普通管斜面放置30MIN，此时可分离淋巴细胞。
用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用玻璃棒），2000rPm离心20分钟，用毛细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中，于4℃冰箱保存备用，用于以后的ELISA实验，对流免疫电泳实验和伤寒试管凝集实验，溶血反应，免疫比浊测定补体C3或C4等等。
（剥离时也可用毛细吸管轻轻剥离）3．趁普通管放置30MIN时，将装有静脉血2ml加入肝素抗凝管（或枸橼酸钠）轻轻摇动使血液与抗凝剂混匀，出现凝集不能继续实验。
人外周血淋巴细胞分离管说明书
人外周血淋巴细胞分离管说明书【产品名称】产品名称：人外周血淋巴细胞分离管英文名称：Lymphocyte Separation Tube for Human Peripheral Blood【包装规格】货号产品描述规格7922112筛板分离管，单支规格为15ml20支/盒7922021筛板分离管，单支规格为50ml25支/盒【预期用途】用于从人外周抗凝全血中分离淋巴细胞。
【检测原理】本品采用密度梯度沉降法，根据细胞密度差异，借助分离液和离心，进行细胞分离纯化。
细胞梯度密度分离液产生一定程度的密度梯度，将抗凝全血倒入分离管。
离心后，红细胞、粒细胞沉于管底；PBMC（单个核细胞，包括淋巴细胞和单核细胞等）漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。
吸取分离液液面的细胞，就可从外周血中分离到淋巴细胞。
【检验方法】1.检查。
如图（A）所示。
取出分离管，观察筛板材料之上是否有游离的分离液，筛板下方是否有气泡。
如果有，请用离心机20℃，800g，离心1min。
2.倒入血液。
血液样品必须为抗凝全血，无需稀释。
如图（B）所示。
3.离心。
20℃，800g，15min。
设置较慢的加速与减速（如果共有十档且第十档为最高档，加速与减速应该调整到第三档）。
4.将部分血浆吸出后，直接将筛板上方剩余的少量血浆、PBMC细胞层和少量分离液直接倒入干净的离心管中。
如图（C）所示，PBMC层在血浆下面，分离液上面。
5.RPMI1640洗涤1-2次（20℃，250g，10min）。
用0.9%(W/V)生理盐水或合适的培养基将淋巴细胞重悬备用。
人外周血淋巴细胞分离管分离血液的过程【主要组成成分】本品为筛板管，主要组成成分是聚蔗糖、泛影酸及PP或PE材质筛板。
【储存条件及有效期】未开封2~30℃避光保存，有效期为2年。
【适用仪器】水平转子离心机。
【样本要求】本品要求样本为新鲜的抗凝血，血液收集时应无菌操作且储存、处理和运输过程中避免冷冻和冷藏。
人淋巴细胞分离液
人淋巴细胞分离液
人淋巴细胞来源于人外周血，可根据不同实验目的可选择密度梯度离心法、吸附分离法或其它特殊分离方法。
Böyum在密度梯度离心法的基础上提出通过使用Ficoll®甲泛影钠溶液离心快速分离的方法，操作更方便、更快速。
稀释的血液在Ficoll®甲泛影钠溶液中通过短时间的低速离心即可分层，红细胞和粒细胞沉降至管底、淋巴细胞和血小板在中间形成2个分层。
MP Bio生产的LSM，成功地用泛影酸钠代替了甲泛影酸钠，是一种灭菌过滤溶液，每100毫升包含6.2克聚蔗糖和9.4克泛影酸钠。
密度是1.0770-1.0800克/毫升20℃。
使用说明：
1.轻轻颠倒瓶子使LSM充分混合
2.无菌转移3mlLSM到15ml离心管中。
3.混合2ml除纤维蛋白血液或肝素处理血液和2ml生理盐水
4.仔细的将稀释血液加入3mlLSM（室温）于15ml离心管中，在血液和LSM 中形成一个明显的分层。
不要将稀释血液混合入LSM中。
5.室温下400g离心15-30分钟，离心可以沉淀红细胞和多核白细胞同时可以在LSM上形成一层单核淋巴细胞。
6.吸出淋巴细胞上方2-3mm的血浆。
7.吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM和转移到另外的一个离心管。
加入等体积的平衡盐缓冲液至淋巴细胞离心管中，室温离心10分钟，离心速度设定在既不损伤细胞又能沉淀细胞即刻，例如160–260x g（去除LSM和降低血小板的百分比）。
8.用平衡盐缓冲液清洗细胞，用适当的培养基重悬细胞。
提取外周血淋巴细胞
/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。
现在大多数用的密度梯度离心法。
一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。
现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。
我的经验1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
4. 离心 .转速：1500/分温度20c －28c时间：20分钟no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)5。
取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。
还有办法的。
8 离心。
转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)时间：10分钟温度：4c9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）10.细胞计数＋洗涤细胞。
刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。
这样是不是很节省时间？？11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。
实验一外周血淋巴细胞的分离
Enzyme-linked immunoabsobant assays
融合剂
• PEG： • 亲水性，使细胞表面极性降低，导致脂质
双分子层不稳定，引起细胞融合。 • 分子量：1500-2000
HAT选择性培养
HAT: 次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基碟呤（aminopterin，A） 胸腺嘧啶（thymidine, T）
细胞的DNA生物合成有两条途径：
• 1、熟悉酶联免疫检测手段的原理。 • 2、掌握双抗夹心ELISA的试验操作。
实验四
B淋巴细胞杂交
杂交瘤的目的 --- 制备单克隆抗体
杂交瘤技术的基本原理
具有分泌抗体功能的B细胞难以在体外长期存活。 利用细胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能 长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养 获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞. （Hybridoma）
• 脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即杂交瘤细胞，既从 脾细胞获得了HGPRT和TK，从而利用培养液中的H和T合 成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能 在HAT选择培养液中生存下来。
实验步骤：免疫脾细胞的制备
处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置 于120目的钢丝网中，将网移入盛有20ml生理盐水的 平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬 液，吸取1ml细胞悬液（约5×106细胞）, 与骨髓瘤 细胞SP2/0（5×105细胞）混合，离心后弃上清 •骨髓瘤细胞:脾细胞为1:10 •一个脾脏可获约108个细胞