土壤里的根际菌产几丁质酶的定性检测
产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定_顾真荣
上海农业学报2001,17(3):92～96 Acta Agriculturae Shanghai 文章编号:1000-3924(2001)03-92-05产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定顾真荣 马承铸(上海市农业科学院植物保护研究所,上海201106)韩长安(上海市农业技术推广服务中心,上海201103) 摘 要 从103份采自中国各地的土样中分离得到了312株芽孢杆菌,用平板透圈法筛选到3株产几丁质酶菌株G 1、G 2和G3。
经鉴定,G1为短芽孢杆菌(Bacillus brevis );G2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis );G3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。
它们在几丁质平板上的透明圈直径以G1>G 3>G2为序,在以Schales '法测定壳聚糖酶活力时,其摇瓶发酵上清液的酶活力以G 3>G1>G2为序。
本文首次报道短芽孢杆菌产生几丁质酶和壳聚糖酶。
关键词 芽孢杆菌;几丁质酶;筛选;鉴定;测定中图分类号:Q 55;Q 939.124 文献标识码:A 几丁质又称甲壳素,是广泛分布于自然界的生物多聚物,每年都有上百亿吨的生物量产生,数量仅次于纤维素。
几丁质和几丁质酶的利用一直是生命科学中的重大课题,在环境保护、医学、化学和农业等方面具有重大的潜在应用价值[1,2]。
几丁质酶广泛存在于植物、动物和微生物中。
细菌的几丁质酶由于潜在的商业用途倍受人们关注,粘质沙雷氏菌(Serratia marc enscens )是人们长期来研究的热点[3]。
对环境和卫生方面安全的芽孢杆菌亦有较多的研究。
已报道能产几丁质酶的芽孢杆菌有环状芽孢杆菌(B .circulans )[4,5]、蜡状芽孢杆菌(B .cereus )[4]、地衣芽孢杆菌(B .licheniformis )[4]和枯草芽孢杆菌(B .subtilis )[4,6]。
几丁质酶基因对根际微生物群落结构与生态作用的影响
几丁质酶基因对根际微生物群落结构与生态作用的影响微生物群落是土壤生态系统中最复杂的生态系统之一，包括许多种类的微生物，如细菌、真菌、古菌等。
这些微生物在土壤中发挥着重要的作用，如固定氮、分解有机物质、促进营养元素的循环等。
根际微生物群落是微生物群落中重要的组成部分，与植物生长和健康密切相关。
其中，几丁质酶是具有高度生物催化活性的酶类，对环境保护和农业生产具有重要的意义。
本文将从几丁质酶基因的角度探讨其对根际微生物群落结构与生态作用的影响。
几丁质酶基因是一类广泛存在于微生物中的酶基因，具有高度的生物学功能和生物催化作用。
这类酶可以分解几丁质，一种结构特殊的多糖物质，被广泛应用于食品、医药等领域。
然而，几丁质酶不仅仅是一种有价值的生物材料，还对土壤中的营养元素循环、微生物群落结构与功能等方面具有重要的影响。
几丁质酶基因在根际微生物群落中具有重要的功能。
研究发现，几丁质酶基因的存在可以促进根际微生物群落的多样性和稳定性。
一方面，几丁质酶可以分解几丁质等多糖类物质，将其转化为可被微生物利用的低分子营养物质。
另一方面，几丁质酶的活性会吸引一部分微生物群落中的优势菌株，进而形成稳定的微生物生态系统。
这种吸引力的机制与生物气味相关，这些生物气味可以被微生物识别并且感知，使得微生物能够在土壤中寻找到适合其生长和繁殖的环境。
除了稳定微生物群落外，几丁质酶基因还可以促进根际微生物群落的互惠共生效应。
互惠共生是指不同生物之间的相互作用，其中每一方都可以从中获得益处。
在根际微生物群落中，植物根系分泌物和微生物之间存在着复杂的互动关系。
这些根分泌物中含有多种有机和无机物质，可以为根际微生物群落提供生长和繁殖的基础。
几丁质酶基因的存在可以促进微生物吸附于植物根系表面，形成一层具有保护和降解能力的生物膜，有效地防止土壤侵蚀和水土流失等现象的发生。
此外，几丁质酶基因对根际微生物群落的生态保护和治理具有重要的意义。
根据研究发现，几丁质酶基因的存在可以阻止或减少有害微生物对植物生长的影响。
土壤几丁质酶的测定方法
土壤几丁质酶的测定方法我折腾了好久土壤几丁质酶的测定方法，总算找到点门道。
说实话，一开始我真的是瞎摸索，走了不少弯路。
我最开始尝试的时候，都不知道从哪儿下手。
只知道要把土壤样本准备好。
土壤样本的采集可不能马虎，就好比我们做饭选食材，得找那种有代表性的土壤，你不能专挑个特殊的小角落取土，得在一片区域不同点采集然后混合起来。
采好的土还得处理呢，我一开始就忽略了杂质的影响，以为只要是土就行，结果大错特错。
这就像淘米一样，你得把土壤里的小石头啊树枝啊啥的都去除干净。
后来到了测定几丁质酶的核心步骤。
我试过用那种常见的比色法。
这过程就像是一场化学反应的魔术。
首先要把土壤样品和含有几丁质底物的溶液放到一起，然后让它们充分反应一段时间，这个时间得控制好，就像烤蛋糕定时间似的，我第一次就没控制好，不是太长就是太短，整得结果乱七八糟的。
接着呢，就要加入一些显色剂，当这个显色剂一进去，溶液就会变色，这个颜色的深浅就和几丁质酶的活性有关系啦。
这里面最难的就是要制作标准曲线，我也是试了好多次。
最开始我对这个标准曲线的制作理解得不太透彻，按照书上的步骤做也老是出错，不是浓度算错了，就是点标错了，就像在迷宫里盲目地找出口一样。
后来慢慢就明白，每一步都得特别仔细，仪器读数的时候眼睛瞪得老大，就怕看错。
还有一种方法我还在摸索，就是那种采用荧光标记底物的检测法。
这个嘛，理论上它看起来挺不错的，感觉更灵敏呢。
不过目前我还不确定具体要怎么把这个方法和我的实验条件调到最佳状态，还得继续尝试。
但是呢不管用哪种方法，准确吸取溶液的量是超级重要的，哪怕是一点点的偏差，最后结果可能就差很多，就像厨师做菜盐撒多撒少差很多是一个理儿。
反正测定土壤几丁质酶的方法就是得不断试错不断总结经验。
在处理土壤样本的时候我还犯过个错误，没注意样本存储的温度和湿度，搞得好几次样本可能变质了，测定结果那肯定是不对的。
所以啊要是你们要做这个测定，样本存储环境一定得好好控制，就像我们保存食物要有合适的冰箱温度一样。
快速、准确鉴别产几丁质酶菌株的新方法
快速、准确鉴别产几丁质酶菌株的新方法胡晓;张敏;刘彭强;邓秋蕾;舒凯【期刊名称】《植物保护》【年(卷),期】2010(36)4【摘要】使用几丁质平板法筛选具有几丁质酶活性的细菌时,由于几丁质平板本身趋于透明,而降解环也为透明色,不易观察到明显的抑菌圈,故在筛选几丁质降解菌时,其观察结果受人为因素影响较大.本文首次使用刚果红染色的方法,对几丁质平板进行染色,降解环为浅红色,而未降解部分为深红色;结果表明,降解环的直径大小随着接种时间的延长而逐步增大,且降解环的大小可反映酶活大小.因此,此法可以直观、清晰、准确地对具有几丁质酶活性的菌株进行筛选,在相关菌株的筛选中具有较大的潜在应用价值.【总页数】4页(P163-166)【作者】胡晓;张敏;刘彭强;邓秋蕾;舒凯【作者单位】四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014;四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014;四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014;四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014;四川农业大学农学院植物病理系,雅安625014【正文语种】中文【中图分类】Q93-31【相关文献】1.产几丁质酶菌株 S68-CM5产酶条件优化研究 [J], 胡基华;曹旭;孟力强;陈静宇;姜威;刘宇帅;张淑梅;李晶2.一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化 [J], 苗飞;孟阳;王悦;袁春营;崔青曼3.产几丁质酶菌株的分离鉴定及产酶条件探究 [J], 左一萌;石晓玲;潘晓梅;王欢;尹永得;董雪滢;王超4.产低温几丁质酶菌株的筛选、鉴定与产酶条件优化 [J], 陈立功;吴家葳;张庆芳;迟乃玉;王晓辉5.产几丁质酶菌株GXUN-20的筛选、鉴定及其产酶条件优化 [J], 张奇;王一兵;申乃坤;姜明国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
几丁质降解菌的分离鉴定与产酶条件探究
山西农业科学2021，49（4）：420-424几丁质降解菌的分离鉴定与产酶条件探究王敏,辛二娜,王瑶,张天宝,郭继虎,杜慧玲（山西农业大学基础部，山西太谷030801）摘要:随着黄粉虫养殖规模的扩大，废弃物中含有大量的黄粉虫虫蜕，而虫蜕中含有不易降解的几丁质。
为缓解环境污染，实现黄粉虫养殖废弃物中虫蜕的资源化利用，以自然填埋黄粉虫虫蜕1a 的土壤为材料，采用透明圈法筛选几丁质降解菌（命名为Wn ），经16S rDNA 同源进化关系鉴定种属，最后通过单因素试验下的酶活性确定最优培养条件。
结果表明，Wn 为类芽孢杆菌属菌株，在以8g/L 的胶体几丁质为唯一碳源、装液量为1/3（50mL/150mL ）、pH 值为7.5、温度为30℃的发酵培养液中，培养96h 时的酶活性最大，为0.155U/mL 。
研究结果可为黄粉虫废物利用和生物防治奠定基础。
关键词:黄粉虫虫蜕；透明圈法；几丁质降解菌；最优培养条件中图分类号:S154.3文献标识码:A文章编号:1002-2481（2021）04-0420-05Isolation and Identification of Chitin-Degrading Bacterium and Exploration ofthe Optimal Culture Conditions for Enzyme ProductionWANG Min ，XIN Erna ，WANG Yao ，ZHANG Tianbao ，GUO Jihu ，DU Huiling（Department of Foundation ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）Abstract ：With the expansion of the breeding scale of Tenebrio molitor L.,there are a lot of Tenebrio molitor L.molts in the waste,and the molting contains chitin which is not easy to degrade.To alleviate the environmental pollution and realize the resource utilization of molting in Tenebrio molitor L.breeding waste,the chitin-degrading bacterium named Wn were isolated from the soil of natural landfill of Tenebrio molitor L.molts for one year by transparent circle method and identified by 16S rDNA homologous evolutionary relationship.The optimal culture conditions were determined by enzyme activity under single factor test.The results showed that Wn was Paenibacillus sp.strain.In the fermentation medium with 8g/L colloidal chitin as the sole carbon source,50mL of liquid volume,pH 7.5,30℃,the enzyme activity was the highest （0.155U /mL ）at 96h of culture.The results laid a foundation for the utilization of Tenebrio molitor L.waste and biological control.Key words ：Tenebrio molitor L.;transparent circle method;chitin-degrading bacterium;optimal culture conditions收稿日期:2021-01-15基金项目:山西省重点研发计划一般项目（201903D221050）；山西省重点研发计划项目（201703D221025-3）；山西省重点研发计划（重点）项目（201603D211202）作者简介:王敏（1995-），女，山西文水人，在读硕士，研究方向：生物化学与分子生物学。
几丁质酶的活性测定
几丁质酶活性的测定⑴几丁质酶几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。
但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。
在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。
特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。
几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。
而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。
几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。
⑵试剂的配制①胶状几丁质的制备称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。
当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。
倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。
将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。
取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。
高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定的开题报告
高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定的开题报告摘要：几丁质酶是一种特殊的酶，在海洋生态系统中具有重要的生物学功能，因此对于高效的几丁质酶菌株的筛选和几丁质酶的纯化与鉴定具有重要意义。
本文将实验室中先前筛选出的CK1-3菌株进行体外培养，通过测定其几丁质酶的活性进行筛选，同时优化产酶条件，最终得到高产几丁质酶的菌株。
接下来对于CK1-3菌株进行几丁质酶的纯化与鉴定，使用超滤、离子交换层析和凝胶过滤三个步骤纯化CK1-3菌株的几丁质酶，测定其纯化比和比活力，同时采用SDS-PAGE和质谱分析进行鉴定。
关键词：几丁质酶；菌株筛选；纯化；鉴定；CK1-31. 研究背景随着人们对生物化学及海洋生态系统的研究深入，几丁质酶作为一种具有右旋螺旋结构的酶，逐渐成为研究重点。
它是一种特殊的酶，在海洋生态系统中，它可以释放出被几丁质包裹的有机物，为微生物提供能量和营养素。
同时，几丁质酶也被广泛应用于食品工业、纺织业等领域。
因此，对于高效的几丁质酶菌株的筛选和几丁质酶的纯化与鉴定具有重要意义。
2. 研究目的本研究旨在筛选高产几丁质酶的菌株，同时对CK1-3菌株的几丁质酶进行纯化与鉴定。
3. 研究方法3.1 菌株的培养先前从海波中分离出的CK1-3菌株通过体外培养的方式进行増菌。
用含有几丁质的培养基进行培养，其成分为（每升）：几丁质4.0 g、柠檬酸0.5 g、胰蛋白酶1.0 g、NaCl 1.0 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.25 g、FeSO4 0.002 g和微量元素液体1 mL。
3.2 几丁质酶的筛选对体外培养的CK1-3菌株进行几丁质酶的筛选，分别在不同的温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和培养时间（12、24、36、48、72 h）下测定几丁质酶的活性，最终确定其最佳产酶条件。
3.3 几丁质酶的纯化利用超滤、离子交换层析和凝胶过滤三个步骤对CK1-3菌株的几丁质酶进行纯化，测定纯化比和比活力。
产几丁质酶菌株的筛选及酶解产物鉴定
产几丁质酶菌株的筛选及酶解产物鉴定谭海刚;李静;赵祥颖【摘要】几丁质酶是一种专一性降解几丁质的水解酶.在工业上,几丁质酶可用于制备功能性甲壳低聚糖.结合平板透明圈法和摇瓶发酵测酶活力的方法,从土壤中筛选到一株产几丁质酶的菌株L012,酶活力为0.75 IU/mL;采用离子色谱法对菌株L012产几丁质酶的酶解产物进行分析,初步确定产物中有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖以及聚合度小于10的寡糖.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2013(021)002【总页数】3页(P65-67)【关键词】几丁质;几丁质酶;几丁寡糖【作者】谭海刚;李静;赵祥颖【作者单位】山东省食品发酵工程重点实验室,山东济南 250013【正文语种】中文【中图分类】TS201.3几丁质酶专一性降解几丁质，水解得到的几丁寡糖、几丁二糖或N－乙酰葡萄糖胺在食品及药物方面有广泛的用途。
几丁质酶(chitinase，EC3.4.1.14)的酶源相当丰富，自从 Benecke［1］首次报道分离到几丁质酶产生菌以来，发现微生物中细菌、放线菌、真菌、酵母及某些病毒都能够产生几丁质酶。
不同来源的微生物的酶系有所不同，酶学性质差异较大。
一般微生物产几丁质酶的酶系含有外切几丁质酶、内切几丁质酶和几丁质二糖酶等。
本文采用平板透明圈法和摇瓶发酵相结合的方法从土壤等样品中筛选到一株产几丁质酶的菌株，并用离子色谱法对该菌株酶解产物进行了分析、鉴定。
1 材料与方法1.1 土样采自山东沿海等地区的土样。
1.2 主要试剂胶体几丁质(Colloidal chitin):按 Sun Chul Kang［2］的方法制备，细粉几丁质:济南海得贝公司，DNS试剂:参照文献［3］，磷酸缓冲液:参照文献［4］，其他试剂均为分析纯。
1.3 培养基1.3.1 富集培养基细粉几丁质 2.5 g/l，MgSO4·7H2O 0.5 g/l，K2HPO40.7 g/l，KH2PO40.3 g/l，FeSO4·7H2O 0.01 g/l，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌 20 min。
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定一、实验材料1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等 (菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。
)2.试剂：DNS试剂 :（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。
，搅拌5 s，水浴至45。
然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g 苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。
继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。
用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7 d后可以使用。
)几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。
几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。
（胶体几丁质固体培养基。
g K2HPO4，gKH2PO4， g MgSO4·H2O， g FeSO4·7H2O， gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml 蒸馏水，15 g 琼脂，，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
二、筛选·1.初筛采用平板透明圈法。
用0．1 mL孢子悬液(1×107／mL)滴于几丁质平板的中央(每个样品重复3次)，28℃培养7d，其菌落周围有透明圈出现。
土壤几丁质酶(Soil Chitinase,S-Chitinase)试剂盒使用说明
土壤几丁质酶（Soil Chitinase，S-Chitinase）试剂盒使用说明微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC1935规格：100管/48样产品内容：缓冲液：液体8mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体8mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体4mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体4mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
产品说明：几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中，而几丁质酶(EC3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物，在585nm处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
需自备的仪器和用品：天平、水浴锅、离心机、震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板，甲苯、蒸馏水。
操作步骤：一、样品处理新鲜土样风干，过40目筛。
二、测定操作表对照管测定管土样(g)0.02甲苯（μL）10混匀，25℃静置15min缓冲液（μL）12040试剂一（μL）80混匀，37℃震荡培养1h，8000rpm，4℃，离心10min，取上清100μL 试剂二（μL）4040混匀，沸水浴7min试剂三（μL）4040试剂四（μL）100100混匀，37℃水浴30min，取200μL于微量石英比色皿/96孔板中，蒸馏水调零，测定585nm 处吸光值，记为A对照管和A测定管，ΔA=A测定管-A对照管。
三、计算公式a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=2.3575x-0.0143，R2=0.9989酶活性定义：37℃条件下，每克土壤每天分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
一株产几丁质酶菌株的筛选及其产酶条件的研究_李静
第37卷第3期 2007年6月工业微生物Industrial M icrobiology Vol .37No .3 Jun .2007山东省科技攻关计划项目(NO .031010115)。
作者简介:李静(1982～),女,硕士研究生。
一株产几丁质酶菌株的筛选及其产酶条件的研究＊李 静1, 刘建军2,3, 赵祥颖2(1.青岛农业大学食品科学与工程学院,青岛266109;2.山东省食品发酵工程重点实验室,济南250013;3.山东轻工业学院食品与生物工程学院,济南250100)摘 要 采用平板透明圈法从土壤中分离筛选到一株产几丁质酶放线菌株L 12,用250mL 摇瓶发酵初筛和复筛,酶活力为0.63U m L 。
通过产酶条件实验,初步确定了该菌株较适产酶培养基和摇瓶发酵条件。
条件优化后,30℃、250m L 摇瓶发酵48h ,几丁质酶活力达到1.06U mL 。
关键词:几丁质; 几丁质酶; 筛选; 酶活力 几丁质(Chitin )又称甲壳素、甲壳质,是以β-1,4-N -乙酰氨基葡萄糖为基本单位的直链多聚物,其含量在天然聚合物中仅次于纤维素居第二位[1,2]。
几丁质在医药、化工、食品、化妆品、印染、造纸、农业、环保等方面具有广泛的用途。
几丁质酶(ChitinaseEC3.3.1.14)[3]是一种专一性降解几丁质的酶类,可将几丁质完全水解为几丁单糖或几丁寡糖,直接被人体吸收利用,从而使几丁质用途更加广泛。
本研究从采集的40份土样中,以几丁质为唯一碳、氮源,采用平板透明圈法初筛,共挑取428株产生明显透明圈的菌株。
然后经摇瓶初筛、复筛,最终获得一株产几丁质酶活力较高的菌株放线菌L 12,并对其产酶条件进行了初步研究,本文报道了产酶菌株放线菌L 12的筛选过程和产酶条件研究的结果。
1 材料与方法1.1 土样 采自山东沿海等地区的40份土样。
1.2 试剂 胶体几丁质:按Sun Chul Kang [5]的方法制备;细粉几丁质购于济南海得贝公司。
设计实验方案,从土壤中分离一株产几丁质酶的真菌
几丁质酶产生菌的筛选姓名：郑思炎学号：11101645几丁质又名甲壳素、甲壳质，其有效成分是几丁聚糖（壳聚糖）。
在自然界中，几丁质存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、昆虫的外壳，高等植物的细胞壁等，是除纤维素以外的又一重要多糖。
因几丁质的化学结构和植物纤维素非常相似，故几丁质又称做动物性纤维。
值得一提的是，节肢动物的外壳中有35%的蛋白质、30%的钙和无机盐、剩下的就是35%甲壳质。
在提取几丁质的加工工艺中，需要经过酸液及碱液的处理才能得到几丁质，而后再经脱乙酰化的处理才能得到具有生理活性的几丁聚糖（壳聚糖）。
因此可以说，几丁质脱乙酰化的程度越高，其有效成分的浓度就越高，相对而言对人体的生理功能也就越强。
1 材料与方法1.1 材料沟渠土壤1.2 培养基1.2.1 固体几丁质培养基胶状几丁质15.0g，酵母粉3.0g，（NH4）2SO41.0g，MgSO4·5H2O0.3g，KH2PO41.36g，琼脂15.0g，加水至1000mL。
用NaOH调pH至中性。
1.2.2 PDA培养基土豆200g、蔗糖15g、琼脂15g，H2O1000mL。
1.3 胶状几丁质的制备将5g细粉几丁质溶于88mL浓盐酸中，此几丁质到500mL去离子水中，同时搅拌。
然后通过离心方法将其反复洗至中性，最后加适量去离子水高压灭菌后保存。
1.4 几丁质酶产生菌的筛选产几丁质酶菌株的分离采用平板稀释法［4］。
取土样1g，用无菌水以10倍梯度稀释成10-1~10-6稀释液，取10-4~10-6稀释液0.5mL涂几丁质平板，28࠷培养，挑取周围有透明圈的菌落纯化培养并保存待用。
参考文献：［1］邱立友.微生物几丁质酶与害虫防治［J］.河南农业大学学报，1995，29（2）：184-190.［2］陈红.广谱抗病虫几丁质酶产生菌的筛选与几丁质酶分子生物学研究［D］.2002.4-5.［3］檀建新，陈忠义，张杰，等.产几丁质酶菌的分离鉴定及其抑菌作用的初步研究［J］.植物保护，2001，27（2）：1-3.［4］方中达.植病研究方法（第三版）［M］.北京：中国农业出版社，1996.。
产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究的开题报告
产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究的开题报告标题：产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究一、论文简介：随着人们对生态环境的关注度不断提高，利用微生物降解环境污染物已经成为了一种重要的手段。
几丁质是海洋生物、昆虫等生物体中普遍存在的一种寡聚糖，具有材料的天然，广泛应用于生物材料、食品工业等领域。
几丁质酶是一种能够降解几丁质的酶，是利用几丁质资源的关键。
本文旨在从环境中筛选出一株具有高效几丁质酶产生能力的菌株，并对该酶的酶学性质进行初步研究，为几丁质酶产业化研究提供理论参考。
二、研究目的：1. 通过环境筛选、鉴定和比较，寻找一株优异的几丁质酶产生菌株。
2. 分离、纯化并表征出所筛选的几丁质酶的分子量、催化效能、热稳定性等酶学特性。
三、研究内容与方法：1. 采用实验室分离、培养等方法，从野外样品中筛选出几个具有几丁质酶生产能力的菌株，通过形态学、生理学和生化检测等手段进行鉴定和比较。
2. 对所筛选出菌株的几丁质酶进行分离、纯化、组分鉴定和物化特性等分析，包括所得几丁质酶的分子量、催化效能、pH和温度对催化活性的影响等酶学特性。
3. 对所筛选出菌株产生的几丁质酶进行产酶条件的优化和工艺参数的调整，最终以高活力和低成本的方式实现几丁质酶的产业化生产。
四、研究意义：本文的研究旨在寻求一种高效、环保、经济的几丁质资源化利用方式。
一方面，研究结果能够为工业化生产几丁质酶提供强有力的理论依据；另一方面，研究结果有望为几丁质生物降解技术的推广和应用提供新的途径，有助于缓解环境污染问题。
五、研究展望：几丁质酶作为一种生物酶，其产生机制、分离纯化和活性调整等问题仍然存在许多亟待解决的问题。
今后的研究可以进一步探讨几丁质酶的基因结构和修饰方式，寻求提高几丁质酶催化效率和抗污染能力等优化措施。
同时，也可以借助生化技术和生物工程技术，开创出更多有益的降解技术和应用领域。
几丁质降解酶产生菌的分离及其产酶条件的初步研究
& 结果与分析
7,+ 几丁质降解酶产生菌的筛选及鉴定 土 壤 微 生 物 用 几 丁 质 培 养 基 分 离 !筛 选 !纯
化 后!从 中 选 出 两 株 透 明 圈 大 而 清 晰 的 胞 外 几 丁 质 降 解 酶 产 生 菌!其 形 态 和 生 理 生 化 特 征 见 表 $)
将两菌株分别用肉汤培养基及几丁质培养
基 进 行 液 体 摇 瓶 培 养 :(/A ;!每 隔 一 定 时 间 进 行活菌计数!作生长曲线:图 $!图 &;!发现两培 养 基 中 接 种 的 起 始 菌 浓 度 虽 相 同!但 菌 的 生 长 却 不 太 一 样 )用 肉 汤 培 养 基 培 养 !延 迟 期 和 对 数 期 较 短 !且 稳 定 期 的 菌 数 较 几 丁 质 培 养 基 为 多 ! 而 用 几 丁 质 培 养 基 培 养 时!由 于 几 丁 质 必 须 先 由 几 丁 质 降 解 酶 分 解 后 才 能 被 菌 利 用!因 此 生
图 K 两菌在几丁质培养基中的生长曲线 $%&’L M,-./*01,2+3-4/.-3/,?%@3%@0*%/%@J+A%1J
KNO 几丁质降解酶活力的测定 两菌株在几丁质培养基中的酶活力见图
P" 联 系 菌 的 生 长 曲 线 可 知 !在 对 数 生 长 期 的 末 期 即 短 杆 菌 HH培 养 PQ*左 右!假 单 胞 菌 .. 培养 PR*左右几丁质降解酶的活性达到最高! 此后酶活逐渐降低"
关 键 词&几丁质降解酶e短杆菌e假单胞菌e筛选
几丁质酶产生菌的筛选及其对小麦根腐病菌的抑制作用
在基 础培养 基 中加入 ２０ ． ％细粉几 丁质 。
１２ ． Ｐ ＴＹ培 养 基 ．． ３ Ｇ ２
ｌ 材 料 与方 法
１１ 试验 材料 ．
土豆浸出物 ２０ ，葡萄糖 ２ ｇ 蛋白胨 ２ ， ０ｇ ０， ｇ 酵
母浸膏 ２ ，琼脂 １ ｇ ２ ００ ，调至 ｐ ． ｇ ７ ，ＨＯ１ ０ ｍＬ Ｈ７ 。 ５
１ ． 培 养基 的制备 ．２ ２
１ ． １ 富集培养基的制备 ．２ ２．
小麦叶部根腐病是黑龙江省春小麦的主要病害
之 一 ，它不 仅使小 麦产 量下 降 ，而且 由于形成 大量 籽 粒黑胚 而影 响小 麦加工 品质 和营养 品质 ，所 以每 年 都造 成 巨大 的经 济损 失［ ２ １ 。本研 究 是 以小 麦 叶部
２０ ・ ｉ ２ ｍ ｎ ｒ 振荡培养 ６ 。将培养液以 ４ ０ ｒｎ ｄ ０ｒａ ０ ・ｉ
离 心 １ ｎ ５ｍｉ。取 上 清 液 加 入 固 体 硫 酸 铵 到 ８ ％ ０
饱 和度 ，４℃下静 置 过夜 ，离心 取沉 淀溶 解 于 ０１ ｏ・ 的氯化钠溶液中即得粗酶液。 ． ｔｌ ５ ｏ Ｌ
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农 业
大 学
学
报
第３ 卷 ７
水 ，在 ３ ７℃振荡 培养 ４ｄ ，静 置 １ ｉ，取 １ｍ ０ｍｎ Ｌ 上 清 液加 入 ２ ５ｍＬ富集 培 养基 中， ３ ￣ 在 ７Ｃ振荡 培 养 ６ｄ 。从 第 ３天 起 每天 取 样 ，经适 当稀 释 后涂 几 丁
几丁质酶产生 菌的筛选及其对 小麦根腐病菌 的抑 制作用
郭玉莲 ，魏相峰 ，赵伯 福。 ，郑铁 军 ，李宝英
（． １ 黑龙江省农科院农药应用研究中心，黑龙江 哈尔滨 １０ ８ ：２ 肇东市农技推广中心，黑龙江 肇东 ５０６ ． １ １０ ） ５ １０ １ １０ ： ５ １０
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几丁质酶（Chitinase）是能够催化几丁质中β-1,4糖苷键水解为N-乙酚寡糖和
葡萄糖的酶系，主要存在于甲壳类动物的外壳与软体动物的器官、真菌类的细胞壁、以及受侵染的高等植物中，具有降解真菌细胞壁抵御真菌侵染的作用，同时其降解产物氨基糖寡糖素在调节动植物细胞代谢中起着重要作用。
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根际细菌Serratia
根际细菌Serratia第22卷第1期2007年2月云南农业大学JournalofYunnanAgriculturalUniversityV01.22N'1.1Feb.2007根际细菌SerratiaplymuthicaHRO—C48的生防作用初探牛马迎新,刘晓光一,高克祥,秦乃花,庞延东,时呈奎(山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018)摘要:沙雷氏菌SerratiaplymuthicaHRO—c48分离自油菜根际,是一种产几丁质酶和IAA的植物根际促生细菌.离体抑菌活性测定表明,菌株HRO—CA8具有广谱抗真菌活性.与12种测试的植物病原真菌平板对峙培养,产生大小不同的抑菌圈,说明可能通过产生抗生素抑制真菌生长.温室盆栽试验中,用HRO—c48菌悬液对番茄进行浸种和灌根处理,该菌在番茄植株根际能大量定殖,4周后根表和根际土壤中的菌量仍稳定在1.0×10.efu/g水平.在温室条件下,菌株HRO—CA8可有效防治黄瓜猝倒病,防治效果达49.57;还能诱导番茄叶片对灰霉病的系统抗性,诱抗效果达44.45%.综合以上结果,说明菌株HRO—CA8的生防作用可能依赖于抗生,溶菌,根际竞争,促生和诱导抗性等多种机制的组合.关键词:Serratiaplymuthica;根际定殖;生物防治;诱导系统抗病性;猝倒病;灰霉病中图分类号:S476文献标识码:A文章编号:1004—390X(2007)01—0049—05 PreliminaryStudyonBiocontrolPotentialofRhizobacteriumSerratiaplymuthicaHRO——C48MAYing-xin,LIUXiao—guang,GAOKe—xiang,QINNai—hua,PANGY an—dong,SHICheng—kui (CollegeofPlantProtection,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,China) Abstract:SerratiaplymuthicaHRO—C48withchitinolyticactivitywasisolatedfromtherhizosphereof oilseedrapeinGermanyandpromotedplantgrowthbyproductionofindoleacicacid(IAA).C onfron—tationbioassayofantifungalactivityonPDAplatesshowedthatstrainHRO——C48suppressedabroad?. spectrumofphytopathogeniefungiandformeddifferentsizeofinhibitionzoneindualculture with12fungi.Undergreenhouseexperiments,strainHRO—C48successfullycolonizedtomatorhizosphereand keptastablepopulationatconcentrationof1.0×10efu/gaftersoakingseedsandpouringrootwithHRO—C48suspensionupto4weeks.ThetreatmentwithHRO—C48canreduceddiseaseincidenceofcucumberdamping—off,aswellasinducedsystemicresistancetotomatogreymoldcomparedwithtip waterascontro1.Together,allthesedatarevealedthatcombinationofmultiplemechanisms,s uchasantibiosis,lysis,rhizospherecompetition,aswellasplantgrowth—promotingandinducedsystemicre—sistancemightberesponsibleforbiocontrolactivityofHRO—C48.Keywords:Serratiaplymuthica;rhizospherecolonization;bioeontrol;inducedsystemicres istance;damping—off;greymold收稿日期:2006—06—27基金项目:国家自然科学基金资助项目资助(30370954).通讯作者作者简介:马迎新(1981一),女,山东济南人,硕士,主要从事根际促生细菌生物防治机理的研究.云南农业大学第22卷利用自然界中某些拮抗微生物对植物病原菌的抗生作用,营养和空间竞争,重寄生,以及促进植物生长和诱导植物产生系统抗性等机制保护作物,是植物病害生物防治的一个重要组成部分u.其中研究较深入的是Pseudomonca和Bacillus属的生防菌J.沙雷氏菌(Serratiaspp.)对植物病害生物防治的研究从20世纪8o年代开始,已报道普城沙雷氏菌(5.ply-muthi~)和粘质沙雷氏菌(smⅡ)可防治多种土传和气传病害,并诱导烟草,黄瓜等植物产生对多种真菌,细菌和病毒病害的抗性'.试验所用的SerratiaplymuthicaHRO—C48,分离自油菜根际,是一种产几丁质酶和吲哚乙酸IAA的植物根际促生细菌(plantgrowth-promotingbacte-ria,PGPR).它能促进草莓的生长,并对植物病原真菌V erticiUiumdahliae和Phytophthoracactorum引起的草莓枯萎和根腐病有生防活性,在德国已经注册并商品化Rhizostar⑧¨o1"].植物根际(Rhizo.sphere)是指生物和理化特性受到根影响的紧密环绕植物根的区域.植物根际促生细菌能够促进植物对矿质营养的吸收和利用,或者产生促进植物生长的代谢物,甚至抑制有害微生物,从而起到促进生长,防治病害的作用引.目前有关PGPR研究主要侧重于对土传病害的生物防治,如有效地用于防治小麦全蚀病,马铃薯软腐病,作物青枯病,葫芦科作物苗期猝倒病等¨.随着温室蔬菜种植面积的扩大,蔬菜的各种气传病害的发生也日益严重.传统的化学防治难以有效的控制这些植物病害,而且农药的残留问题和对环境的污染日益严重,PGPR的深入研究和发展为解决这一难题展现了诱人的前景.PGPR能够高密度地在植物根际定殖,兼有抑制植物病原菌,根际有害微生物,以及促进植物生长并增加作物产量的作用,更重要的是有些PGPR能够诱导植物产生系统抗性(inducedsystemicresistance, ISR),从而提高植物整体的抗病能力.本研究在测试了菌株HRO—C48对多种植物病原菌有较强离体抑菌活性的基础上,探讨其在番茄根际的定殖能力,以及对黄瓜猝倒病的直接防病效果和诱导番茄对灰霉病系统抗病性的潜能.1材料与方法1.1材料1.1.1供试植物番茄品种改良毛粉802,黄瓜品种神农春三号. 1.1.2生防菌为沙雷氏菌属Serratiaplymuthica菌株HRO—C48抗利福平的自然突变体,在含有利福平40 mL的IJA或LB培养基(胰蛋白胨10g,酵母浸膏粉5g,NaCI5g,Agar17g,加水至1L)上生长.1.1.3病原菌灰葡萄孢(Botrytiscil~Fea),立枯丝核菌(Rhi—zoctoniasolani),杨树腐烂病菌(V aLsasordida),杨树溃疡病菌(Botryosphaeriadothidea),瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum),苹果腐烂病菌(V alsamali),辣椒炭疽菌(CoUetotrichumcapsici),齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii),小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis),苹果轮纹病菌(Macrophomakawatsukai),小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum),小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis).以上菌种均由山东农业大学植病系资源微生物实验室提供,于PDA斜面上于4c【=冰箱中保存.1.2平板拮抗作用的测定采用平板对峙法.在直径60mm的PDA平板中心接入直径为6mm的活化的待测病原真菌菌饼,同时在距菌饼1.8cm处圆周上等距离接种28cc过夜培养的生防菌HRO—C48,并以不接生防菌的空白为对照;每处理设3个重复,25cc培养,当对照处真菌长至培养皿边缘时测量抑菌圈大小. 1.3番茄根部定殖能力的测定HRO—C48菌悬液的制备:将HRO—C48在含有利福平40|Lg/mL的LA培养基上活化,挑取单菌落移入装有50mLLB培养基的三角瓶中,共4 瓶,28℃振荡培养过夜.10000r/min离心10min去除培养液,将细菌沉淀用自来水重悬,比浊法¨将重悬液配制成1.0×10cfu/mL的浓度备用.番茄种子28℃催芽,用制备好的菌悬液浸种1h后播种到10cm×12cm的营养钵中,每钵浇灌菌悬液20mL.以自来水处理为对照,每处理3个重复,每重复2盆,每盆4粒种子.出苗后第1,2,3,4周取样测定.采用土壤稀释平板法_l,分别取带有根际附着土的番茄根部,称取根际土的重量和根的重量.将根际土和根分别在30mL去离子水中振摇1h,使根际土和根表上的细菌悬浮在水中.菌液梯度稀释后涂抹在含利福平的抗生素选择性培养基上,28cc培养.48h后检查菌落数.以自来水处理的植株为对照.第1期马迎新,等:根际细菌SerratiaplymuthicaHRO—C48的生防作用初探5l 1.4温室中对黄瓜猝倒病的生物防治试验菌悬液的制备及黄瓜的接种处理同1.3.以自来水处理为对照,每处理3个重复,每重复l2盆,每盆3粒种子.黄瓜幼苗长至两叶一心时浇灌HRO—C48菌悬液20mL,3d后,在幼苗根部接种瓜果腐霉.将在PDA平板上新活化的瓜果腐霉打孔(直径10mm),取菌饼贴在黄瓜根部,每株贴3个菌饼,3—4d后统计发病率.发病率(%)=(发病苗数/总苗数)×100防治效果(%)=[(对照组发病率一处理组发病率)/对照组发病率]×1001.5诱导番茄对灰霉病的抗病性试验菌悬液的制备及番茄的浸种处理同1.3.番茄幼苗长至五叶一心时用于HRO—C48强化接种,每钵浇灌菌悬液20mL,以自来水处理为对照.每处理3个重复,每重复l5盆,每盆3粒种子.处理后第3d,挑战接种灰霉菌孢子悬浮液.灰霉病菌孢子悬浮液的制备:灰霉病菌在PDA平板上22℃培养,8—10d后长出大量分生孢子;孢子悬浮液含1×106孢子/mL灰霉病菌孢子,0.005%吐温80,0.01mol/L葡萄糖,6.7mmol/LKH2PO4.将番茄叶片取下,每个小叶片一个接种点,每接种点滴孢子悬浮液6,23~C保湿培养.离体叶片挑战接种2-4d后调查病斑大小,统计发病隋况.分级标准:未发病,l级;病斑面积1～5clTl2,2级;5一l0cm2,3级; l0—15am,4级;>15c,5级.病情指数=∑(病级叶片数×病级代表值)/(调查叶片总数×最重发病级别代表值)诱导抗性效果(%)=[(对照组病情指数一处理组病情指数)/对照组病情指数]×1002结果与分析2.1平板拮抗作用将生防菌SerratiaplymuthicaHRO—C48与l2种常见的病原真菌进行对峙培养,检测其抑菌谱, 结果表明该菌对l2种测试的病原真菌均有不同程度的抑制作用.其中对小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis),苹果腐烂病菌(V alsamal1)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的生长抑制作用最强,抑菌圈直径分别为l9.83mm,19.63mm和l7.99mm;而对小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)和小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis)几乎没有抑制作用,抑菌圈<10mm(表1,图1).表1SerratiaplymuthicaHRO—C48对多种病原菌的拮抗能力Tab.1AntifungalactivityofSerratiaplymuthicaHR0一C48againstphytopathogenicfungi病原真菌phytopathogensfungi抑菌圈直径/mminhibitionzonediameter立枯丝核菌R.solani杨树腐烂病菌sordida杨树溃疡病菌B.dothidea瓜果腐霉Paphanidermatum灰葡萄孢B.cinerea苹果腐烂病菌mali辣椒炭疽菌Ccapsici齐整小核菌S.rolfsii小麦纹枯病菌R.cerealis苹果轮纹病菌M.kawatsukai小麦赤霉病菌graminearum小麦全蚀病菌G.graminisl1.834-0.2915.654-0.28l5.1O4-0.29l1.164-0.29l7.994-0.o219.634-0.32l6.654-0.2812.844-043l9.834-1.0413.744-0.816.404-0.2O8.7O4-0.21注:各数据均为3次重复的平均值.Dataareaverages ofthreereplicates.A:RhizoctoniacerealisB:V alsamall图1平板对峙法测定HRO.C48对病原真菌的抑制作用Fig.1Confrontationbioassayofantifungal activitybyHRO-C48onPDAplates.,0∞由垂×0<皿皤1蛊震蔓01O+根际士rhizospheresoi1+根表rootsurface1234接种时间time/weeks图2HRO.C48在番茄根部定殖Fig.2ColonizationoftomatorhizospherebyHRO-C4852云南农业大学第22卷2.2在番茄根部的定殖能力将HRO—C48菌悬液对番茄进行浸种和灌根处理,出苗后定期取样测生防菌定殖量.在含有利福平的抗生素选择性培养基上,对照处理中未分离到目标菌.在番茄植株上,根表(紧贴在根部)和根际土HRO—C48定殖量的变化是一致的,生防菌数量在第1周达到最大(番茄根表和根际土达7.52×10.cfu/g和5.68×10cfu/g.第2周定殖量下降并在第3,4周趋于稳定,且能维持在1.0×10.cfu/g水平(图2).2.3温室中对黄瓜猝倒病的生防作用用HRO—C48菌悬液对黄瓜进行浸种处理,待黄瓜长成幼苗时再用HRO—C48菌悬液灌根处理,2d后接种瓜果腐霉P.aphanidermatum,3d后调查发病情况.病害调查结果表明,自来水对照与HRO—CA8处理后的黄瓜根腐病发病率分别为59.38%和27.o4%,防治效率达49.57%(图3).经统计分析,差异极显着(P<0.001).旧吕∞,∞喾要CKHR0—?C48处理treatment∞80U=謇60盘40槲20l腔处理treatment图3ItRO.C48对黄瓜猝倒病的防效Fig.3Biocontrolofcucumberdamping-offbyHRO-C48 2.4对番茄灰霉病的诱导抗性HRO—C48浸种和灌根处理后,用灰霉病菌孢子悬浮液挑战接种番茄离体叶片.发病后病害调查结果表明,经过生防菌HRO—C48处理的植株病情指数明显低于自来水作对照的处理(图4),分别为22.22和40.0.番茄植株上离体诱导抗病效果达44.45%.经统计分析,差异极显着(P<0.001).图4HRO.C48诱导离体番茄叶片对灰霉病的抗性Fig.4InducedresistancetogreymoldondetachedtomatoleavesbyHRO-C48…一一CK:tipwaterascontrol;HRO-C48:treatmentwithbacterialsuspension3讨论一般认为,PGPR通过定殖于植物根系,优先占领根际,产生IAA等,直接促进植物生长发育;或是抑制根际的病原菌和根际有害微生物起防病作用,从而促进植物生长发育¨.在PGPR的生防机制中,定殖和诱导抗性作用是很重要的因素.定殖包括两个方面:一是能够在植物根际生存下来,二是细菌能适应植物根际的环境而大量繁殖.根际的定殖与竞争能力和PGPR的生防效率密切相关㈣.植物根际促生细菌可诱导植物产生系统抗病性(ISR).表型上与病原菌诱导的系统抗病性(SAR)相似,对植物的保护作用具非特异性,广谱性和系统性.处于诱导状态的植株体内常会产生可传导的信号,从诱导位点纵向传递.与SAR不同,ISR不产生过敏性坏死反应,主要依赖茉莉酸/乙稀JA/ET信号转导途径,而独立于水杨酸SA信号途径一...本试验中SerratiaplymuthicaHRO—C48能抑制多种病原真菌,具抗生作用.该菌株可在番茄根际成功定殖,灌根后4周,细菌种群仍稳定在1.0×10.cfu/g的水平.PGPR的定殖能力与竞争能力正相关,是优良拮抗菌必须具备的主要特征之一.用HRO—C48的菌悬液对黄瓜进行种子处理和土壤浇灌,有效降低了黄瓜猝倒病的病情指数,第1期马迎新,等:根际细菌SerratiaplymuthicaHRO—C48的生防作用初探53 通过直接与病原菌相互作用,可有效防治土传病害;用相同的方法对番茄进行处理,诱导了对空间上隔离的叶部病害——番茄灰霉病的抗性,说明这种抗性是由根部接种HRO—C48激发的,并可通过信号传导到叶部,对随后挑战接种的灰霉病菌产生系统抗性.以上结果说明根细菌HRO—C48不仅对土传病害有直接的生防效果,还具有诱导系统抗府l生的潜能,可有效防治气传叶部病害.由此说明该菌具有较大的生防潜力和应用前景,可能是多种生防机制,如抗生,竞争,溶菌,以及促生和诱导抗性等协同作用的结果.对于其诱导系统抗病性的机制,有待于进一步研究.[1][2][3][4][5][6][7][8]『9][参考文献]COOKkRJ.Makinggreateruseofintroducedmicroor- ganismsforbiologicalcontrolofplantpathogens[J].Ann.Rev.Phytopathol,1993,31:53—80.HANDELSMANJ.STABBEV.Biocontrolofsoil?borneplantpathogens[J].ThePlantCell,1996,8:1855—1869.KL0EPPERJW,RYUCM,ZHANGS.Inducedsys- temicresistanceandpromotionofplantgrowthbyBacil- lusspp[J].Phytopathology,2004,94(11):1259—1266.HAASD,DEFAGOG.Biologicalcontrolofsoil-borne pathogensbyfluorescentpseudomonads[J].Nature Rev.Microbio1.2005,3:1—13.COMPANTS,DUFFYB,NOW AKJ,eof plantgrowth?promotingbacteriaforbiocontrolofplant diseases:principles,mechanismsofaction,andfuture prospects[J].App1.Envion.Microbio1.,2005,71 (9):4951—4959.魏海雷,张力群.荧光假单胞杆菌2P24中生防相关调控基因gasS的克隆和功能分析[J].微生物, 2005,45(3):368—372.周洪友,魏海雷,刘西莉,等.通过染色体整合抗生素2.4一二乙酰基问苯三酚合成基因提高荧光假单胞菌生防能力[J].科学通报,2005,50(8):766—771. PRESSCM,WILONM,TUZUNS,eta1..Salicylic ell$90—166isnotthe primarydeterminantofinducedsystemicresistancein cucumberortobacoo『J].Mo1.PlantMicrobe.Inter- act.,1997,10:761—768.KAMENSKYM,OVADISM,CHETI,eta1..Chernin. Soil-bornestrainIC14ofSerratiaplymuthicawithmulti? piemechanismsofantifungalactivityprovidesbiocontrol ofBotrytiscinemaandSclerotiniasclerotiorumdiseases[J].SoilBio1.Biochem.,2003,35:323—331.[10]KALBEC,MARTenP,BERGG.Strainsofthegenus Serratiaasbeneficialrhizobacteriaofoilseedrape'with antifungalproperties[J].MicrobiolRes.,1996,151 (4):433—439.[11]KURZES,BAHLH,DAHLOR,eta1..Biological controloffungalstrawberrydiseasesbySerratiapry- muthicaHRO—CA8[J].PlantDis.,2001,85:529—534.[12]SCHIPPERSB,BAKKERAW,BAKKERPAHM.In- teractionsofdeleteriousandbeneficialrhizospheremi- crooganismsandtheeffectofcroppingpractices[J]. Ann.Rev.Phytopathol,1987,25:339—358.[13]WELLERDM.Biologicalcontrolofsoil-borneplant pathogensintherhizospherewithbacteria[J].Ann. Rev.Phytopatho1.,1998,26:397—4o7.[14]方中达.植病研究方法(第三版)[M].北京:中国农业出版社,2004.[15]陈晓斌,张炳欣.植物根围促生细菌(PGPR)作用机制的研究进展[J].微生物学杂志,2000,20(1):38—44.[16]KLOEPPERJW,LEONGJ,TEINTZEM,eta1..En? hancedplantgrowthbysiderophoresproducedbyplant growth-promotingrhizobacteria[J].Nature,1981,286: 885—886..一[17]L YNCHJM.Productsofsoilmicroorganismsinrela? tiontoplantgrowth[J].Critrev.Microbio,1976,(5):67—107.[18]赵健,李弱仁.植物根际非病原细菌介导的系统诱导抗病性[J].江西农业大学,2000,22(3):345—349.[19]AUDENAERTK,PA TFERYT,CORNRLISP,eta1..InductionofsystemicresistancetoBotrytisci~ma intomatobyPseudomonasaeruginosa7NSK2:roleof salicylicacid.pyochelin,andpyocyanin[J].Molecu? larPlant,MicrobeInteractions,2002,15(11):1147一l155.[20]AuDENAERTK,DEMEYERGB,HOFTEMM. Abscisicaciddeterminesbasalsusceptibilityoftomato toBorytiscinemaandsuppressessalicylicacid-depend? entsignalingmechanisms[J].PlantPhysiology,2002, 128(2):491—501.。
桑氏链霉菌产几丁质酶特性及对杨树紫纹病的生防作用
Ｋ Ｈ２ Ｐ Ｏ ０ ． ６ Ｌ ， 初始 ｐ Ｈ值 ７ ． ０， 培养温度 ２ ６℃ ， 培养时间 １ ４ ４ ｈ 。田间试验表 明 ： 优化培养的发酵滤液可降低杨树
紫 纹 羽病 发 生 率 ． 且 防 效 显 著
关键词 杨树 紫纹 羽病 菌： 链霉菌 ； 几 丁质酶 ： 生物防治 分类号 ￥ ７ ６ ３ ． １
１ １ ２ ９ ０ ３ ｗｅ ｒ ｅ ３ ０ ０ ｍＥ ／ Ｌ ｏ ｆ ｃ ｏ ｌ ｌ ｏ ｉ ｄ ａ ｌ ｃ ｈ ｉ ｔ ｉ ｎ，０ ． ４ ％ ｏ ｆ ｐ ｅ ｐ ｔ ｏ ｎ ｅ ，１ ． ０ Ｌ ０ ｆ Ｋ， ＨＰ Ｏ ，０ ． ６ ｇ ／Ｌ ｏ ｆ ＫＨ， Ｐ Ｏ ，７ ． ０ ｏ ｆ ｉ ｎ ｉ ｔ ｉ ａ ｌ
Ｗｉ ｔ ｈ Ｒｈ ｉ ｚ ｏ ｃ ｔ ｏ ｎ ｉ ａ ｖ ｉ ｏ ｌ ａ ｃ ｅ ａ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｃ ｒ ｅ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ．ａ ｎ ｄ ｃ ｈ ｉ ｔ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ — ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ １ １ ２ ９ ０ ３ ｗ ｈ ｉ ｃ ｈ ｈ ａ ｄ ａ ｂ ｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｏ ｎ ｉ ｓ — ｔ ｉ ｅ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｗａ ｓ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｔ ｈ ｅ ｒ ｈ ｉ ｚ ｏ ｓ ｐ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｓ ｏ ｉ ｌ ｏ ｆ ｈ ｅ ａ ｌ ｔ ｈ ｙ ｐ ｏ ｐ ｌ ａ ｒ ｂ ｙ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｒ ｆ ｏ ｎ ｔ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ．Ａｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｒ ． ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ，ｃ ｕ ｈ ｕ ｒ ａ １ ａ ｎ ｄ ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ — ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄ １ ６ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｌｉ ａ ｇ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ． ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ １ １ ２ ９ ０ ３ ｗ ａ ｓ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ａ ｓ Ｓ ｔ ｒ ｅ ｐ ｔ ｏ ｍｙ ｃ ｅ ｓ ｓ ａ ｍｐ ｓ ｏ ｎ ｉ ｉ ．Ｂ ｙ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ａ ｎ ｄ ｏ ｒ ｔ ｈ ｏ ｇ ｏ ｎ ａ ｌ ｔ ｅ ｓ ｔ ，ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｃ ｈ ｉ ｔ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｓ ．ｓ ａ ｍｐ ｓ ｏ ｎ ｉ ｉ
产几丁质酶菌株的筛选、鉴定及其抑制玉米秸秆霉变研究
产几丁质酶菌株的筛选、鉴定及其抑制玉米秸秆霉变研究我国玉米秸秆在逐步实现机械化打捆收储后,因收获时天气多变,水分含量高,混入泥土等原因,秸秆捆内极易滋生霉菌,造成玉米秸秆资源浪费,且对奶牛等反刍动物健康构成极大威胁。
目前常用的丙酸、丙酸盐、氧化钙等化学防霉剂因添加量大、成本高、对工作人员和加工设备具有损伤作用,使其在玉米秸秆这一廉价资源的应用上受到限制。
本试验以产几丁质酶枯草芽孢杆菌BS-1、产酸植物乳杆菌LABP以及玉米秸秆中优势霉菌为研究对象,探究BS-1和LABP对玉米秸秆中霉菌的抑制作用,为提高秸秆利用率,提供理论依据。
本试验利用胶体几丁质培养基从玉米秸秆中筛选出一株产几丁质酶菌株BS-1,同时将秸秆中的优势霉菌进行分离、纯化;通过对BS-1菌株和优势霉菌形态学观察以及16S rDNA或18S r DNA序列测定进行菌种鉴定;利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定BS-1菌株发酵24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h的几丁质酶活力;利用牛津杯琼脂扩散法检测BS-1菌株发酵液对玉米秸秆中优势霉菌的抑制作用;于玉米秸秆培养基中接种BS-1、LABP 及其复合菌剂,验证三组菌株对玉米秸秆的利用情况;采用析因设计,玉米秸秆含水量依次为15%、20%、25%,分别添加BS-1、LABP及其复合菌株处理,以0.5%丙酸为阳性对照,无处理为空白对照,共15个处理组,密闭真空保存30d后开封进行有氧存放,分别于密封前、有氧存放0d、5d、10d、15d取样测定常规养分含量变化、有氧稳定时间、霉菌数量以验证抑菌效果。
得到的主要试验结果如下:(1)玉米秸秆中分离出产几丁质酶菌株BS-1经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);4株优势霉菌经鉴定分别为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)。
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土壤里的根际菌产几丁质酶的定性检测
1 材料与方法
1.1 供试菌株
土壤中的根际菌。
1.2 培养基和试剂PDA 培养基; 产酶发酵培养基( g/ L ) :NH4NO3 3 g , KH2PO4 2 g , MgSO4 ·7H2O 0.6 g ,FeSO4·7H2O 0.1 g ,胶体几丁质5 g 粉状几丁质制备,pH:5～6 ;胶体几丁质PDA (g/ L) :马铃薯200g ,葡萄糖20 g ,琼脂17 g ,胶体几丁质2 %粉状几丁质制备;
1.3 几丁质酶活性测定
1.3.1 根际菌发酵液的制备将根际菌菌株接种到PDA 培养基平板(直径9 cm) 上,在光照恒温恒湿培养箱25 ℃、60 %湿度培养。
按根际菌菌株产酶发酵培养基组分配制液体培养基,以每瓶100 mL分装于250 mL 的摇瓶中,灭菌后备用。
把布满根际菌的平板用灭菌水浸泡3～5 min ,用棉签轻轻刮洗下菌体,用脱脂棉或4 层纱布过滤除去菌体,滤液即为孢子悬浮液。
根据血球记数板法进行计数,每瓶按6
10mL 孢子量接种5mL ,置于恒温摇床以180 r/ min、27～28 ℃培养一段时间。
将发酵液经4 层纱布过滤,滤液再以10 000r/ min 离心30min,弃去沉淀,得到灭菌的发酵上清液。
1.3.2 胶体几丁质PDA 平板透明圈实验胶体几丁质的制备按胶体几丁质PDA 组分制备培养基,并灭菌倒平板备用。
在平板的中央用直径0.5 cm 的打孔器打孔,无菌操作。
用灭菌枪头吸取40μl 灭菌的
发酵上清液(用孔径为0.20 μm 细菌滤器过滤灭菌) 加到孔中,用密封胶带封口,于恒温箱28 ℃保温,一段时间后开始观察透明圈情况胶体。
1.4 几丁质平板透明圈实验:观察可发现,根际菌发酵上清液在胶体几丁质平板上就可出现清晰的透明圈,透明圈的出现说明发酵液中存在催化分解几丁质的几丁质酶,通过胶体几丁质平板透明圈实验能够检测几丁质酶的存在。