土壤里的根际菌产几丁质酶的定性检测

土壤里的根际菌产几丁质酶的定性检测

1 材料与方法

1.1 供试菌株

土壤中的根际菌。

1.2 培养基和试剂PDA 培养基; 产酶发酵培养基( g/ L ) :NH4NO3 3 g , KH2PO4 2 g , MgSO4 ·7H2O 0.6 g ,FeSO4·7H2O 0.1 g ,胶体几丁质5 g 粉状几丁质制备,pH:5～6 ;胶体几丁质PDA (g/ L) :马铃薯200g ,葡萄糖20 g ,琼脂17 g ,胶体几丁质2 %粉状几丁质制备;

1.3 几丁质酶活性测定

1.3.1 根际菌发酵液的制备将根际菌菌株接种到PDA 培养基平板(直径9 cm) 上,在光照恒温恒湿培养箱25 ℃、60 %湿度培养。按根际菌菌株产酶发酵培养基组分配制液体培养基,以每瓶100 mL分装于250 mL 的摇瓶中,灭菌后备用。把布满根际菌的平板用灭菌水浸泡3～5 min ,用棉签轻轻刮洗下菌体,用脱脂棉或4 层纱布过滤除去菌体,滤液即为孢子悬浮液。根据血球记数板法进行计数,每瓶按6

10mL 孢子量接种5mL ,置于恒温摇床以180 r/ min、27～28 ℃培养一段时间。将发酵液经4 层纱布过滤,滤液再以10 000r/ min 离心30min,弃去沉淀,得到灭菌的发酵上清液。

1.3.2 胶体几丁质PDA 平板透明圈实验胶体几丁质的制备按胶体几丁质PDA 组分制备培养基,并灭菌倒平板备用。在平板的中央用直径0.5 cm 的打孔器打孔,无菌操作。用灭菌枪头吸取40μl 灭菌的

发酵上清液(用孔径为0.20 μm 细菌滤器过滤灭菌) 加到孔中,用密封胶带封口,于恒温箱28 ℃保温,一段时间后开始观察透明圈情况胶体。

1.4 几丁质平板透明圈实验:观察可发现,根际菌发酵上清液在胶体几丁质平板上就可出现清晰的透明圈,透明圈的出现说明发酵液中存在催化分解几丁质的几丁质酶,通过胶体几丁质平板透明圈实验能够检测几丁质酶的存在。