结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究进展

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朱艳伶1,2,万康林2,沈国顺1

近20余年来,由于耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌(MDR-TB)的肆意横行,各国的结核病疫情均呈回升趋势,全球发病率和死亡率不断升高112。我国的耐药情况尤为严重。据统计目前初始耐药率为1816%,获得性耐药率为4615%,全国现有耐药的涂阳肺结核病人约42万;在全球对53个国家的耐药调查中,河南省的原发MDR-TB耐药率位居第2位。因此在WHO最近公布的全球38个国家和地区的结核病耐药监测资料中,中国被列为/特别引起警示的国家和地区0之一122。近年来,各国学者采用分子生物学技术对结核杆菌耐药机制进行深入研究,定位了结核分枝杆菌包括异烟肼在内的耐药基因的位置和基因突变位点,从而促进了第一代快速鉴定耐药突变菌株方法的建立和新型抗结核药物的开发。

异烟肼作为最主要的抗结核药物之一,是多种药物联合化疗治疗结核病的基本组成部分,但也是最易产生耐药性的抗结核药物。已发现结核分枝杆菌对异烟肼耐药涉及多个基因变化:katG,inhA,kasA,ndh,及oxyR-ah pC基因连接区,突变形式多样化,并且突变位点又不确定更加剧了结核病防治的困难。因此,对耐药菌的耐药机制进行深入全面的了解,建立方便快捷经济的检测方法,从而开发新的抗结核药物和开展更有效的化疗是目前亟待解决的问题。

1结核杆菌异烟肼耐药机制

异烟肼(Isoniazid,INH)是1912年由两个捷克生化学家首次合成的,但它强有力的抗生素活性直到1951年才被发现。作为使用了40余年的抗结核一线化疗药物,其作用主要是通过抑制结核杆菌分枝菌酸的生物合成,造成细胞壁破损而杀菌。但是在单药化疗和不适当化疗期间容易产生耐药性。INH 的耐药性与一个或多个基因的各种突变有关,这些基因主要包括编码触酶-过氧化物酶的katG基因,编码烯酰基载体蛋白还原酶的inh A基因,编码烷基-氢过氧化物还原酶的ahpC 基因,编码B-酮酰基载体蛋白合成酶的Kas A基因及调节分枝杆菌氧化-应激的oxyR基因。

111katG

研究表明INH实际上是一个药物前体,需要经结核分枝杆菌触酶-过氧化物酶活化后才发挥抗结核作用,而触酶-过氧化物酶则由katG基因所编码。最新研究认为katG基因的变异(包括突变,缺失,插入等)导致的结核分枝杆菌触酶-过氧化物酶活性降低或缺失可以解释90%以上的INH耐药。20世纪90年代早期,张132等将ka tG基因克隆导入耐INH的耻垢分枝杆菌可恢复INH敏感性。

作者单位:11沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁省沈阳市东陵区120号110161;21中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京昌平流字五号102206

通讯作者:万康林

近年来研究发现INH耐药性结核分枝杆菌中katG基因突变最主要的是点突变。不同地区菌株点突变的位置变化较大,但约40%的变异出现在S315T位置。此位置变异通过对katG 活性位点甲基化阻碍了INH与katG的结合,导致酶失去活化INH的能力。Coll等142对来源于巴塞罗纳的61株异烟肼耐药株进行分析,其中55%分离株被检测到katG基因有所改变,最普遍的变异是发生在第315位密码子(占32%),这些菌株显示了高水平的耐药,但大多数仍保留了相当的触酶-过氧化物酶的活性。ka tG基因其他位置上的变异如D63E,H108Q, T262R,A350S等对于酶的稳定性和催化能力也很重要,可以导致细菌对INH产生不同水平的耐药性和保留不同的触酶-过氧化物酶活性152。KatG第315位点突变率的特点还体现在地区的差异上。如国内的陈曦162等对临床分离的101株耐药菌株进行分析,结果第315位点的突变率占3816%(39/101)。这一结果明显低于南非(64%,80/124)172、俄罗斯西北部地区(93%,191/204)182,而又明显高于芬兰(7%,4/54)、新加坡(26%,41/160)192等地区的报道。

112oxyR-ahpC

Christman1102等在研究大肠杆菌和伤寒沙门菌的基础上推断出在肠菌属和其他的微生物里oxyR调节子控制着一套复杂的氧化调节系统,它在对环境刺激反应时被激活。oxyR作为一个调节蛋白它即是氧压的感应器又是基因转录的活化剂, oxyR控制编码解毒酶基因如触酶-过氧化物酶(katG编码)和烷基氢过氧化物酶(ah p C编码)的表达。研究表明在结核分枝杆菌复合体中的oxyR基因发生大量的移码突变和缺失、失活,使其成为一个假基因。Deretic1112等用这种突变体与携带具有活性的oxyR-ah p C基因的质粒组成一个重组体,结果对异烟肼耐药,表明结核分枝杆菌对异烟肼的敏感性在很大程度上由于oxyR调节子的畸变。

一般研究者发现在异烟肼耐药菌株中oxyR启动子序列的突变常伴随着katG活性的不足。因此一般将ah pC突变作为katG基因损伤的标志1122。另外Dhandayu thapani1132等通过Wes-tern免疫斑点分析得出突变的等位基因能增强转录活性,即某些katG突变的耐异烟肼分离株存在ahpC启动子的突变,以增强ah p C表达来补偿触酶-过氧化物酶的缺乏,从而抵抗宿主巨噬细胞的氧化。Dhandayuthapani又将纯化的ah pC蛋白导入耻垢分枝杆菌,结果它对INH高度敏感,而在此菌中过表达ah p C蛋白引起对INH耐药。AhpC编码基因突变极少,可能与耐异烟肼无关。

113inhA

inh A基因编码的NADH依赖的enoyl-Acp还原酶催化$-不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸的还原反应,分枝杆菌利用该产物合成的超长链A-脂肪酸是其细胞壁的重要成分。INH

进入菌体后,在分枝杆菌触酶)过氧化物酶的作用下氧化脱氢生成亲电子形式,这种形式能与分枝菌酸生化合成途径中的烯酰基还原酶)还原型烟酰胺二核苷酸复合体结合,干扰分枝菌酸合成而发挥抗菌作用。有报道1142inh A基因突变约占异烟肼临床耐药株的10%~35%。目前在MTB耐INH分离株中尚未发现inh A编码基因突变。约12%的分离株在inh A的调节序列上有突变,当发生单碱基插入变异时有可能创造一个强有力的启动,将使inh A蛋白过度表达从而提高对INH活性形式的滴度,引起对INH耐药1152。

114kasA与INH耐药性

kasA,编码B-酮酰基载体蛋白合成酶,参与分枝菌酸生物合成,是INH耐药的另一个相关基因,全长1251bp,编码471个氨基酸,其中最常见的突变是G312S。但是根据ANN S1G1LEE1162的报道,在敏感株中也发现了大约有19%的G312S 突变,由此可以推断该基因在异烟肼耐药中表现为多态性。115n dh与INH耐药性

对katG、inhA、ah pC、oxyR和kasA基因的分析并不能解释所有的异烟肼耐药问题。2001年Lee1172等首次报道了结核分枝杆菌一个影响异烟肼耐药的新型突变基因ndh,即编码NADH脱氢酶基因。n dh基因的突变使NADH脱氢酶活性受到抑制,使NADH/NAD+比率升高,从而产生了对异烟肼的耐药。

2结核分枝杆菌异烟肼耐药基因的分子生物学检测方法研究结核分枝杆菌耐药分子机制的重要目的之一是建立一套快速鉴定结核杆菌耐药基因类型的方法。了解结核病患者的耐药状况,指导临床的化疗和防止耐药菌体的散播。目前结核杆菌耐药性检测仍多采用绝对浓度法,比例法等经典方法。但由于结核分枝杆菌生长缓慢,而耐药结核分枝杆菌生长更为缓慢,其耐药性测定需6~8周甚至更长,不能及时指导临床用药;B AC TET结核培养系统因其价格昂贵等诸多不便限制了其广泛应用。随着分子生物学的发展,尤其是PCR 技术的问世,检测耐药可以直接从基因上入手,这样与传统的结核杆菌药敏试验相比,不仅大大缩短了检测周期,实现了自动化,而且也降低了实验室生物危险性。耐药检测包括PCR扩增基因组内携带耐药性区域,然后扩增产物的突变分析。应用于结核杆菌INH耐药基因突变的技术常见的方法有以下几种:

211直接测序法

对INH耐药的相关基因进行DNA片段扩增,扩增产物纯化后取DNA片段直接测序,与标准敏感株的同一DNA片段比较来分析碱基突变的位置和分布。PC R测序是阐明分枝杆菌耐药遗传机制的主要方法。对于过去认识的和没认识的突变的检测,该方法是最直接和可靠的,但该操作繁琐,费用昂贵限制了它的广泛应用。陈曦162对101株INH耐药株及43株敏感株进行研究,利用DNA直接测序证实共有91株耐INH 菌株发生了与INH耐药相关的突变,包括81株耐药株(8012%)katG存在点突变,缺失和插入;5株(419%)耐药株inh A发生突变;3株(219%)耐药株ah pC发生突变;17株(1618%)耐药株基因kasA发生突变,而敏感株除23株katG第463位点突变外均无变化。进一步证实了MTB耐INH 与katG,inhA,ah pC及kasA基因突变之间的关系,并且提示还有其他机制参与。

212PCR-SSC P法

聚合酶链式反应-单链构象多态性分析即PCR-SSCP是1989年Ori ta等首先报道的一种PCR扩增产物的单链DNA凝胶电泳技术。其原理是单链核酸通过自身互补或分子内的互补作用形成折叠构象,单个核苷酸的突变可造成其构象改变,从而导致其在非变性凝胶电泳上迁移速度的改变。PCR-SSCP 是检测单碱基置换和数碱基缺失或插入的可靠而简便方法,比直接DNA测序容易进行,而广泛用作一种突变筛选方法,但由于受待测DNA片段长度、胶的浓度、缓冲液的离子强度及电泳时的温度等影响,限制了实际应用,同时用SSCP只是初筛,不能确定突变的部位和性质。翁心华1182等应用限制性内切酶HaeÓ改良的PCR-SSCP技术对临床25株INH敏感株及23株耐药株的inhA基因进行分析,结果25株敏感株中未见inh A基因单链构象差异,23株耐药株中inhA基因突变率为2118%。新发现的错义突变有A26E,R27K,V28A, Q32A,L54V和S72T,表明此技术适用于TB临床菌株inh A基因突变的筛选。1997年Telenti1192等用自动化PCR-SSCP对来自MDRTB暴发流行中分离的结核杆菌耐药性进行分析,其灵敏度为87%,katG,inh A,katG-inhA,ah pC,katG-ah p C的突变率为别为3618%,3116%,216%,1312%,和216%。2000年Kiepiela1142等又结合PCR-SSCP与RFLP法对79株INH耐药株突变基因进行检测。结果PCR-SSCP方法检测与INH耐药相关基因katG,in hA和ahpC的突变的敏感性分别为100%,9817%和100%。所有扩增的209bp的katG用MspÑ酶做PCR-RFLP分析,第315位密码子S y T结果均为阳性。此方法有望成为INH耐药检测的快速有用方法。

213反向杂交法

探针杂交法是检测耐药基因突变的另一种快速简便筛选方法。其原理是应用生物素修饰的特异引物扩增DNA,使PCR产物带有生物素标记物,将PCR产物变性后与固定在一张膜上的特异寡核苷酸探针杂交,通过酶免役显色法显示结果。Mokrousov1202等选用来自不同国家的315株临床耐INH分离株,采用反向线性杂交方法对inh A和ahpC前导区的突变进行研究,结果发现其突变率分别为1619%和1312%,与DNA 测序相对照其敏感性为100%。应该提及的是INH耐药基因靶序列的突变分析经常是需要更昂贵的测序而反向线性杂交分析方法呈现出迅速经济的特点,另外这种方法与Spoligotypi ng (间隔寡核苷酸序列分析)需要相同的简单设备,并能同时分析40个样本,此技术首次在同一个分析中结合不同的靶位点来检测抗结核药物的耐药性,在临床上有广阔的应用前景。214基因芯片(gene chip)法

基因芯片是指将大量不同的生物信息分子(如寡核苷酸、DNA或cDNA探针等)以高度密集的方式(通常每平方厘米点阵密度高于400),有序地固定在固相支持物(通常为玻璃)上而形成微阵列。当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子相结合后,用激光共聚焦荧光扫描或电荷耦联摄像机对荧光信号的强度进行检测,从而对杂交结果进行量化分析,所以可一次性对样品大量序列进行检测和分析。由于该方法灵敏、方便,特异性高、信息量大,且成本较低,因而具有广阔的临床应用前景。