结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究进展
结核分枝杆菌耐异烟肼分子机制的研究进展
药性 的产 生牵涉到一系列 基 因的突变 ， 其分 子细节 尚未完 全
阐明 ， 本文通过对 已知分 子机制 的综 述为 Ｔ Ｂ耐 Ｉ Ｈ的早 期 Ｎ
快速分子诊 断及耐药菌株的有效控制提供理论参考 。
Ｉ 的代谢及 相关基因 ＮＨ Ｉ Ｈ的分子结构十分简 单 ， 为一 个酰 肼基 连接 于一个 Ｎ 仅
临床肺科杂志 ２ １ 年 １ 月 第 １ 卷第 １ ０１ ０ ６ ０期
ｌ８ ５５
结核 分 枝杆 菌耐 异 烟肼 分 子 机 制 的研 究进 展
贾子冬
虽然近几年结核病 的增 长速度 逐步 降低 ， 由于耐多药 但 结核 （ ｌｄｕ． ｓ ｔｎ Ｔ ｍｕ ｉｒｇｒ ｉ ａｔ Ｂ，Ｍ Ｒ Ｔ 的持续威 胁 ， ｔ ｅｓ Ｄ —Ｂ） 以及泛耐
列 自由基 ， 这些 自由基攻 击细 胞 内的诸多 目标 ， 响 ＭＴ 影 Ｂ的 正常代谢 。当过氧化 氢酶－ Ｊ 过氧 化物 酶 的过氧化 氢酶 活性 缺失时 ， ａｐ 由 ｈ Ｃ基 因编码 的烃基 氢化过氧化物还原酶可能作
为 ｋｔ ａＧ基 因功能缺失 的补充 机制 而过表达 Ｊ Ｎ 。Ｉ Ｈ活 化所 产生的 自由基最为人们 所认 可的攻 击 目标 是 Ｍ Ｂ细胞 被膜 Ｔ
定作用 。与 ＩＨ抗性相关 的突变类 型有错 义突变 ， Ｎ 无义 突变 和移码 突变 ， 还有较大片段 的缺失和插入 ， 其中最常见的还 但 是单碱基 的错义 突变 Ｊ 。
一
Ｔ Ｂ耐药性 的产生主要是 因为抗 结核 药物 的长 期和 不恰 当使 用 ， 耐 药 菌 株 的传 播 则 造 成 耐 药 性 结 核 的持 续 威 而
突变发生 ， 这表 明还有其他 突变在 Ｉ Ｈ抗性 的产生 中发挥作 Ｎ
用 。
耐药结核病的治疗及其进展(2022)
耐药结核病的治疗及其进展耐药结核病指病原体对抗结核药物产生耐受性的疾病状态，已成为当前全球重要公共卫生问题。
根据当前流行性病学分析，全球结核病总耐药率高达20%，耐多药率达到5%。
2018-2019年全国对治疗结核病药物产生耐药性的调查结果表明，我国肺结核患者对多种药物产生耐药性的概率已经＞8%。
故研究耐药结核病的治疗具有非常重要的意义。
耐药结核病治疗新药速递1.PretomanidPretomanid 是一种口服硝基咪唑类药物，具有体外和体内抗结核分枝杆菌（MTB）活性。
它通过抑制分枝菌酸生物合成杀死活性MTB，阻断细胞壁的产生。
近期，《临床微生物学与感染》发表的一篇纳入8项有关pretomanid治疗利福平耐药结核病的Meta分析研究数据表明，Pretomanid在0-14天、0-2天、0-7天均有良好的早期杀菌活性（表1）。
表1含Pretomanid方案对结核分枝杆菌的早期杀菌活性2.DelpazolidDelpazolid是一种新型恶唑烷酮类药物，已在疗效和毒性的方面进行了非临床研究以及1期临床研究。
Delpazolid对革兰氏阳性菌（包括结核分枝杆菌）具有体外活性。
近期，《抗菌物和化学疗法》发表的一篇研究评估了Delpazolid在结核病患者中的杀菌活性、安全性和药代动力学。
79名年龄在19~79间的受试者被随机分配至各治疗组，应用delpazolid 800 mg QD，400 mg BID，800 mg BID，1200 mg QD和异烟肼，利福平，吡嗪酰胺和乙胺丁醇（HRZE）方案以及利奈唑胺600mg BID进行活性对照。
结果表明应用delpazolid 800mg QD, 400mg BID, 800mg BID，和1,200mg QD 后菌落形成单位（log-CFU）平均每天下降值分别为0.044±0.016，0.053±0.017，0.043±0.016和0.019±0.017：而应用HRZE和利奈唑胺（600mg BID）后1og-CFU平均每天下降值分别为0.192±0.028和0.154±0.023（表2）。
结核分枝杆菌耐药机制研究进展
菌丧 失毒 力 ）磷 脂 （ 、 能促使 单 核细胞 增生 ， 并使 炎症
灶 中 的 巨 噬 细 胞 转 变 为 类 上 皮 细 胞 ， 而 形 成 结 核 从 结 节 ） 蜡 质 Ｄ（ 种 肽 糖 脂 和 分 枝 菌 酸 的 复 合 物 ， 、 一 可
化 物 酶 的 基 因 是 ｋ ｔ 因 此 ｋ ｔ 基 因 的 完 全 缺 失 ａＧ， ａＧ
右 。类脂 质是 一 类 复 杂 的 复 合 物 ， 赋 予 ＭＴＢ表 它
面疏 水性 ， 有分 枝菌 酸 （ ＭＴ 含 是 Ｂ和棒 状 杆 菌 属独
有 的结构 ， 要 由 ２ ～ ２ 主 ２ ４碳 短 链 和 ４ ～ ６ ０ ４长 链 分
壁 和其 他细 菌有 着 很 大 的差 别 ， 中类 脂 质 含 量超 其 过 ６ ， 革 兰 阴 性 细 菌 类 脂 质 含 量 仅 占 ２ 左 ０ 而 Ｏ
自由基 攻击 ＭＴＢ的 多个 靶 点 ， 主要 为 细 胞 壁 中的 分枝 菌 酸 ， 可能 包括 Ｄ 也 ＮＡ、 脂类 等 ， 抑制 了分 枝 故 菌 酸的合 成 ， 坏 细菌 的细胞 壁 ， 其 因丧失 耐酸性 破 使 和疏 水 性 而 死 亡 。在 ＭＴＢ中 编 码 过 氧 化 氢一 氧 过
ｏｘ ｙＲ 、 ｓ 、 ｈ、 ｍ ｂ ｋａ Ａ ｎｄ ｅ Ｃ ｅ ｂＡ 、 ｍ ｂ ａ ｒ ｍ ｅ Ｂ、 ｌＡ ｇａ Ａ ｄ
１ 细 胞 壁 结 构 与 组 成 变 化 ， 细 胞 壁 通 透 性 使
改 变 Ｅ－］ ２４
１ １ 分 枝 杆 菌 细 胞 壁 的 组 成 分 枝 杆 菌 细 胞 壁 上 ． 有 选 择 性 阳 离 子 的 孑 蛋 白 ， 有 效 控 制 或 阻 滞 亲 水 Ｌ 能
结核病的多重耐药机制与治疗新进展
结核病的多重耐药机制与治疗新进展结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，严重威胁人类健康。
尽管结核病的防控工作取得了显著进展，但多重耐药结核病(MDR-TB)依然是全球健康领域面临的主要挑战之一。
本文将详细介绍多重耐药结核病的抵抗机制以及目前治疗该疾病的一些新进展。
一、多重耐药机制1.基因突变引起的抵抗结核分枝杆菌通过突变关键基因使其对常用抗结核药物产生耐药性。
最为典型的是对异烟肼和利福平发生突变导致各自作用靶标出现变异从而产生耐药性。
2.表达外排泵导致耐药外排泵系统可以诱导抗微生物药物或毒素从细胞内快速排出，这种机制在抵抗伊索尼亚酰肼等前线抗结核药物中起着重要作用。
3.生物被膜保护机制结核分枝杆菌通过产生类脂质物质覆盖细胞表面，形成生物被膜，从而减少药物进入细胞的数量，起到一定的耐药作用。
二、多重耐药结核病治疗的新进展1.基于耐药机制的定向治疗了解不同株型结核分枝杆菌的突变情况，有助于为患者选择更加有效的抗结核治疗方案。
近年来，通过检测相关基因突变并基于这些突变设计对应的治疗方案已取得了显著效果，提高了治疗成功率。
2.联合用药策略多个抗结核药物同时使用可以降低耐药菌株形成以及增加细菌杀灭率。
新的联合用药方案如修饰利福平、妥布霉素和依替尼韦等，有望改善对多重耐药结核病的治疗效果。
此外，联合使用传统抗结核药物和新型化合物也是提高治疗效果的手段。
3.免疫治疗结核分枝杆菌感染后，机体的免疫系统受到激活。
对患者进行免疫治疗，可以增强机体对结核分枝杆菌的清除能力。
一些新型的免疫治疗方法如重组人干扰素γ和肺泡灌洗液注射等已在临床试验中显示出一定的抗菌活性。
4.微生物合成酶作为药物靶标微生物细胞壁合成酶，在药物开发方面具有巨大潜力。
已有的某些化合物可以选择性地抑制结核菌细胞壁相关合成酶，从而起到杀灭细菌的效果。
5.快速诊断技术传统上，结核病诊断需要耗费较长时间。
如今，DNA 池测序技术和其他分子检测技术已经出现，并被用于减少诊断时间和增加准确性。
结核分枝杆菌异烟肼耐药基因与耐药机制研究进展
地方 。 。因此 ， 为 联 合 化疗 中 常 用 的成 分 ，ＮＨ 作 Ｉ
面临着更 为严 重的耐药 问题 。在 分 子水平 上 ， ＭＴＢ
基 因完 全缺失 ， 不产生该 基 因的 Ｐ Ｒ扩增 带 。用 分 Ｃ
析 Ｐ Ｒ产 物 的单 链 构 象 多 态 性 方 法 （ Ｃ —ｉｇｅ Ｃ Ｐ Ｒ ｓ ｌ ｎ —
ｓ ｒ ｎｄ ｃ ｎｆ ｒ ｔｏｎ ｌ ｔａ ｏ ｏ ｍａ ｉ ａ ｐｏ ｙ ｒ ｓ ， ｌ ｍｏ ｐｈｉｍ ＰＣＲ— ＣＰ） ＳＳ
对Ｉ ＮＨ 形成耐药 的遗 传学机制 十分复 杂 ， 本文 仅就
此方 面的研究 现状作一 综述 。 １ ｋ ｔ 基 因 ａＧ Ｉ ＮＨ 结 构 简 单 ， 以被 动 扩 散 方 式 进 入 增 长 期 细
现 ， 结 核 的 一 线 药 物 异 烟 肼 （ ｏ ｉｚ ，ＮＨ） 果 抗 ｉ ｎａｉ Ｉ ｓ ｄ 如
１２ 基 因部分 突变 ．
在 临床分离 的 Ｉ 耐药 菌株 ＮＨ
中 ，ａＧ基 因完 全 缺失 的发 生率 并 不 高 ， ｋｔ 大部 分 对 Ｉ ＮＨ 耐药 的 ＭＴＢ仍存有 ｋ ｔ 基因 ， ａＧ 只是部分 基 因 发生 突 变 。应 用 Ｐ Ｒ 技 术 对 ３ Ｃ Ｏ株 Ｉ ＮＨ 耐 药 的 ＭＴＢ进 行 分 析 ， 有 ２株 出 现 ｋ ｔ 基 因 完 全 缺 仅 ａＧ
陈 亮 ， 宝福 凯
中图 分 类 号 ： ３ ８４ 文 献标 识 码 ： Ｒ ７ ． Ａ
因耐 药甚 至耐 多药 的结 核分 枝杆 菌 （ ｃｂ ｃ Ｍｙｏ ａ—
研究证 实 ， 高度耐药 的 ＭＴ 在 Ｂ中发 现有 ｋ ｔ ａＧ基 因 完 全 缺 失 ， 时其 编 码 的 过 氧 化 氢一 氧 化 物 酶 阴 同 过 性 。如 果 将 ｋ ｔ 基 因 克 隆 导 入 耐 Ｉ ㈣ ａＧ ＮＨ 的
结核分枝杆菌(MTB)异质性耐药研究进展
ＭＴ Ｂ ） 主要 通过 药物结 合位 点 或药 物 活化 基 因 等特 定 基 因组 区域 的 突 变 获得 可 稳 定 遗 传 的耐 药 基 因
测 发现 利福平 耐药 菌株 中 ｒ ｐ ｏ Ｂ耐药 异 质性 达 ３ ４
（ ２ ２ ／ ６ ４ ） ， 异 烟 肼 耐 药 菌 中 异 质 性 耐 药 更 高 达
耐 药 向 全 部 耐 药 转 变 的 中间 过 程 ， 耐 药 性 的 定 义 也 取
素先后产 生了 ４种 不 同的耐药相关 突变 （ 编码 ３ （ ） ｓ核
糖体 蛋 白的基 因 ｒ 儿 的Ｋ ８ ７ Ｒ和 Ｋ ４ ２ Ｒ突变 ， １ ６ Ｓ核 糖体 Ｒ Ｎ Ａ ｒ ｒ ｓ Ａ ５ １ ３ Ｃ和 Ａ １ ４ ｏ （ ） Ｇ 突变 ） ， 但 在 治 疗 后 期
６ ５ ． ７ （ ２ ３ ／ ３ ５ ） 。此 外 ， 二 线 抗 结 核 药 物 的 耐 药 菌
型 。例 如 ， 利 福 平 耐 药 性是 由 于 Ｒ ＮＡ 聚 合 酶 ｐ亚
基编 码基 因（ ｒ ｐ ｏ Ｂ ） 耐 药 决 定 区 的点 突变 引起 ］ ， 异 烟肼 耐药性 主要 由过 氧 化 氢一 过氧 化 物 酶 编 码 基 因 （ ｋ ａ ｔ Ｇ） 的 突 变 导 致 ］ 。通 过 检 测 这 些 基 因 的 耐 药 相 关 突变 ， 可 以预 测 ＭＴ Ｂ 的 耐 药 情 况 。 在 检 测 临 床 分 离 培 养 的样 本 时 ， 经 常 会 发 现 敏 感 菌 株 和 耐 药 菌 株 共 存 的现 象 ， 即异 质性 耐 药 ｌ ＿ ５ ］ 。异 质 性 耐 药 因 为
影 响 药敏结果 以及治疗 方案 的正 确判 断和评 估而 逐 渐受 到人们 的重 视 。本 文将 对 目前 结核 分枝 杆菌 异 质性 耐药 的产 生及其对 临床 的影 响进行 综述 。
耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变及其分子流行病学调查研究
４ ）ｆｉ ｎａｉ ｓ ｔ ｔ ｔ ｉｓ ｏ ｖｌｓｎ ｚｄｒｓｓ ｎ ｔ ｉｓ（ ｇ Ｌ ａ ｉ ｅ ｔｔ ｎｆ ｑｅｃ ｔ ｏｉｏ ｈ ｉ ５ ｏ ｏ ｉ ｄｒ ｉａ ｒ ｎ．Ｌｗ ｌ ｅ ｉ ｉ ｉ ｅ ｉ ａｔ ｒ ｎ １ｍ ／ ）ｈｄｈｇ ｒ ａｏ ｒ ｕ ｎｙａ ｓｉｎ３ ５ｔａ ｈｇ ｓ ｚ ｅ ｓｎ ｓａ ｅ ｏ ａ ｔ ｓａ ｈ ｍｕ ｉ ｅ ｐ ｔ １ ｎ ｈ
ａ ｔｃ ｉ ｉａ ｓ ｌｔ ｓｏ ｃ ｂ ｃｅ ｉ ｍ ｕ ｅ ｃ ｌ ｓｓ ｎ ｌ ｃ ｌｉｏ ａｅ ｆ ｎ Ｍｙ ｏ ａ ｔｒｕ ｔ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ Ａ ｏ ａ ｆ ３ ｓｒ ｉ ｓｏ ｃ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ ｕ ｅ ｃ ｌｓｓｗｅ ｎ ｙ ｅ ｙ Ｐ ｔｏ ｓ ｔｔ ｏ ２ ｔ ｎ ｆＭｙ ｏ ａ ｔｒｕ ｔ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ｒ ａ ａ ｚ ｄ ｂ ＣＲ－ ｌ １ ａ ｅ ｌ Ｓ Ｃ ｄ ＤＲ－ ａ ｅ ｐ ｌｇ ｔ ｐ ｎ ＳＰａ ｎ ｂ ｓ ｄ Ｓ ｏ ｉｏｙ ｉ ｇ ＤＮＡ ｎ ｅ ｐ ｎ ｉ ｇ ｉ ｆ ｇ ｒ ｒ ｔｎ ．Ｒｅ ｕｌ Ｐ ｉ ｔｍｕ ａ ｉｎ ｔｐ ｓｔｏ １ ｒ ｏ ｎ ｎ ｔ ｅ ｇ ｎ ｍｅ ｆ ｏ ｉ ｓ ｔ ｓ ｏ ｎ ｔｔ ｓａ ｏ ｉｉｎ ３ ５ ｗｅ ｆｕ ｄ ｉ ｈ ｅ ｏ ｓｏ ６ ％ ｆ ７ ｏ ｅ ２／
结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性形成机制及药物敏感性检测技术研究进展
急剧恶 化 ］ 。 。可见 ， 结核 病仍 然是 严重 威胁 人 民生命 和健 康 的重要 公共 卫生问题 。快速准确检测结 核分枝 杆菌 的耐 药性 ， 即药物 敏感性检测 技术 ， 指导 临床 合理 用药 、 效控 制结 核 对 有 病 流行具有重要 意义。近年来 ， 随着 结核分枝 杆菌分 子遗传学
１ 结核分枝杆 菌耐药性形成机制
结核分枝杆菌对 临床 常用 的抗结 核一 线药 物包 括异 烟肼
（ ｏｉ ｉ， Ｈ 、 福 平 （ｉｍ ｉ， ） 吡 嗪 酰 胺 （ｙ ｚ ａ ｉ ， ｉ ｎａ ｄＩ ） 利 ｓ ｚ Ｎ ｒａ ｐ 肿 、 ｆ ｎ ｐｒ ｉ ｍｄ ａｎ ｅ
ＶＡ 、 Ｚ ）链霉 素（ｔ ｐ ｍ ｃ ， Ｍ） ｓｅｔ ｙｉ Ｓ 和乙胺 丁醇 （ｔ ｍ ｕ ｌＥ ） ｒ ｏ ｎ ｅ ａ ｂｔ ，ＭＢ 等 ｈ ｏ 均存在耐药现象 ， 至是 对多 种药 物 同时产 生耐 药的情 况 ， 甚 即 出现 Ｍ ＲＴ ， Ｄ －Ｂ是指结核病患 者排 出的结核分枝杆 菌对 Ｄ －Ｂ Ｍ Ｒ Ｔ 至少包括 ＩＨ和 Ｒ Ｐ在 内的 ２种 或 以上药 物产 生耐 药 。随 Ｎ Ｆ 着对结核分枝杆菌全基 因序列 的揭示 ， 以及 其耐药 性分子机 制 的深入研究 ， 目前对 Ｉ Ｈ、 Ｆ 、Ｍ、 Ｍ Ｎ Ｒ Ｐ Ｓ Ｅ Ｂ和 Ｐ Ａ的耐 药机 制已经 Ｚ
．
氢过氧化物还原酶 的 ａｐ ｈ Ｃ基 因（ｈＣ基 因涉及细菌 对氧化 压 ａｐ
力的反应 ）编码 ｐ酮酰基 载体 蛋 白合成 酶的 Ｋ ｓ ， ａＡ基 因及调 节 分枝 杆菌氧 化一 激反应 的 ｏｙ 应 ｘＲ基 因Ｅ 。ｋｔ ４ ａ ］ Ｇ基 因的变异 （ 包 括突变 、 缺失 、 插入等 ） 导致 的结 核 分枝 杆菌 触 酶． 氧 化物 酶 过 活性 降低或缺失 ， 可以解释 ９ ％以上 的 Ｉ Ｈ耐药 。ｉ Ａ基 因编 ０ Ｎ ｎ ｈ 码还 原型 烟酰胺 二核 苷酸 （ Ａ Ｈ） 赖 的 ｅｏｌ ｃ ＮＤ 依 ｎｙ ａｐ还原 酶 ， — 该 酶催化 △不饱 和脂肪 酸转化为饱和脂肪 酸的还 原反应 ， ＿ 参与分
结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因及其突变的研究进展
结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因及其突变的研究进展摘要】本文就报道的结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、OxyR-ahpC、mabA-inhA、furA-katG、fabG-inhA、efpA、ini (A,B,C)及其突变位点进行综述。
【关键词】结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的慢性传染病。
随着耐药结核病，尤其是耐多药和广泛耐药结核病的出现，给结核病的防控工作带来了严峻挑战。
异烟肼是治疗结核病主要药物之一，但MTB耐异烟肼率已达17.6%，其耐药机制尚不明确，大多认为与MTB相关基因突变有关[1]。
本文综述目前国内外报道的MTB耐异烟肼相关基因及其常见突变位点，以进一步了解MTB耐异烟肼的发生机制。
1 katG基因异烟肼经MTB katG基因编码的过氧化氢-过氧化物酶活化后产生杀菌作用，katG突变使过氧化氢-过氧化物酶失活，导致MTB对异烟肼耐药。
KatG最常见突变位点是Ser315Thr。
Khadka JB等研究尼泊尔地区107例耐异烟肼菌株中，Ser315Thr及Ser315Ile突变率分别为77.6%及17.1%。
陈玲等研究显示Ser315Thr突变频率为66.7%[2]。
315位点还有Ser→Asn、Ser→Thr、Ser→Arg和Ser→Gly突变形式。
此外，还存在Val230Met、Pro232Gln、Gly237Glu、Gly309Cys、Asp304Glu、Asp357His、Asp357Asn、Arg463Leu、His276Met、Gln295His、Glu454Arg等突变[2-5]。
2 inhA基因inhA基因编码NADH依赖的enoyl-Acp还原酶，该酶催化α-不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸，产生的长链脂肪酸是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分。
异烟肼与分枝菌酸合成途径中的NADH依赖的enoyl-Acp复合体结合，阻断90%以上长链脂肪酸合成，从而抑制MTB生长。
结核分枝杆菌(MTB)异质性耐药研究进展
结核分枝杆菌(MTB)异质性耐药研究进展柳清云;孙刚;高谦【摘要】异质性耐药,是指在同一样本中同时存在耐药菌和敏感菌的现象,这体现了细菌群体从部分耐药向完全耐药转变的过程.研究异质性耐药对于认识耐药结核病的发展过程,以及评估治疗方案和指导临床用药具有重要的意义.本文对结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)异质性耐药的产生及其对临床的影响进行了综述.%Hetero-resistance is the coexistence of both sensitive and resistant bacteria in the same specimen,which indicates the transition from partially resistant to fully resistant bacterium population. Studying hetero-resistance is of great significance in understanding the genesis of drug-resistant tuberculosis,accessing the treatment schedule,and guiding the prescription of drugs. In this article,we summarized recent progresses on hereto-resistance of Mycobacterium tuberculosis (MTB).【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2013(040)001【总页数】4页(P1-4)【关键词】结核分枝杆菌(MTB);异质性耐药;耐药结核病【作者】柳清云;孙刚;高谦【作者单位】复旦大学上海医学院生物医学研究院-医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室上海200032;复旦大学上海医学院生物医学研究院-医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室上海200032;复旦大学上海医学院生物医学研究院-医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室上海200032【正文语种】中文【中图分类】R378.91+120世纪40年代以来，链霉素、异烟肼、利福平等抗结核药物的广泛使用，使结核病的发病率和死亡率一度大幅下降［1］。
结核分枝杆菌耐药基因突变特征及与耐药水平关系的研究
㊃论著㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2023.15.001结核分枝杆菌耐药基因突变特征及与耐药水平关系的研究*蒋燕成,张建明ә,陈紫萱,张志珊福建医科大学附属泉州第一医院检验科,福建泉州362000摘 要:目的 分析抗结核一线药物利福平㊁异烟肼耐药基因r po B ㊁k a t G ㊁i h n A 的突变特征,以及基因突变位点与药物最低抑菌浓度(M I C )的相关性,以了解结核分枝杆菌(MT B )的耐药机制,指导临床用药㊂方法 收集泉州市第一医院2019年6月至2021年6月分离的耐利福平㊁异烟肼的MT B 51株作为研究对象,通过将菌种进行复苏,采用D N A 微阵列芯片技术,快速检测MT B 的耐药性㊂分析基因突变类型与抗结核药物M I C 的关系㊂对药敏结果和基因芯片结果不相符合的标本进行测序,分析是否有新的耐药位点㊂结果 51株耐药MT B 中有1株耐利福平的单耐药MT B ,2株耐异烟肼的单耐药MT B ,48株耐利福平㊁异烟肼的耐多药MT B ㊂将48株MT B 通过D N A 微阵列芯片法进行基因型检测,发现r po B 中最常见的突变类型是531(CңT ),异烟肼中最常见的是k a t G 315(GңC ),其次是i n h A-15(C ңT )㊂将其中的23株MT B 菌株进行M I C 药敏试验,结果发现88.9%的531(C ңT )突变菌株M I C >16μg /m L ,5.6%的531(C ңT )突变菌株M I C =16μg/m L ,5.6%的531(C ңT )突变菌株M I C =2μg /m L ;4株526(C ңT )突变型和1株516(AңT )突变型菌株的M I C 均>16μg /m L ㊂结论 泉州地区利福平最常见的突变类型是r po B 531(CңT )突变型,异烟肼中最常见的是k a t G 315(GңC )突变型,r p o B 密码子531㊁526㊁516突变类型对利福平产生高耐药水平;k a t G 对异烟肼产生高耐药水平,i n h A 对异烟肼产生低耐药水平㊂关键词:结核分枝杆菌; 耐药基因; 最小抑菌浓度中图法分类号:R 52文献标志码:A文章编号:1672-9455(2023)15-2145-04S t u d y o n c h a r a c t e r i s t i c s o f d r u g r e s i s t a n c e g e n e m u t a t i o n i n M yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s a nd i t s c o r re l a t i o n w i t h d r u g re s i s t a n c e l e v e l *J I A N G Y a n c h e n g ,Z HA N G J i a n m i n g ә,C H E N Z i x u a n ,Z HA N G Z h i s h a n D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,Q u a n z h o u F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f F u ji a n M e d i c a l U n i v e r s i t y ,Q u a n z h o u ,F u ji a n 362000,C h i n a A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o a n a l y z e t h e m u t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f r p o B ,k a t G a n d i h n A o f t h e f i r s t -l i n e a n t i -t u b e r c u l o s i s d r u g s r i f a m p i c i n a n d i s o n i a z i d r e s i s t a n c e g e n e s a n d g e n e m u t a t i o n s i t e s a n d d r u g MI C ,s o a s t o c l a r i f y t h e m e c h a n i s m o f d r u g r e s i s t a n c e a n d g u i d e m e d i c a t i o n .M e t h o d s F i f t y -o n e s t r a i n s o f r i f a m pi c i n -a n d i -s o n i a z i d -r e s i s t a n t MT B w e r e c o l l e c t e d f r o m J u n e 2019t o J u n e 2021i n Q u a n z h o u F i r s t H o s p i t a l a s t h e s t u d yo b j e c t s ,a n d MT B r e s i s t a n c e w a s r a p i d l y d e t e c t e d b y r e s u s c i t a t i n g t h e s t r a i n s a n d u s i n g D N A m i c r o a r r a y c h i pt e c h n o l o g y .T o a n a l y z e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n g e n e m u t a t i o n t y p e a n d a n t i -t u b e r c u l o s i s d r u g mi n i m a l i n h i b i -t o r y c o n c e n t r a t i o n (M I C ).S a m p l e s w i t h i n c o n s i s t e n t s u s c e p t i b i l i t y a n d m i c r o a r r a y r e s u l t s w e r e s e qu e n c e d t o a n a l y z e f o r n e w r e s i s t a n c e s i t e s .R e s u l t s A m o n g t h e 51s t r a i n s o f d r u g-r e s i s t a n t MT B ,1s t r a i n w a s o f r i f a m -p i c i n -r e s i s t a n t MT B ,2s t r a i n s w e r e o f i s o n i a z i d -r e s i s t a n t MT B ,a n d 48s t r a i n s w e r e o f r i f a m pi c i n -a n d i s o n i a z i d -r e s i s t a n t m u l t i d r u g MT B .T h e g e n o t y p e d e t e c t i o n o f 48s t r a i n s o f MT B b y D N A m i c r o a r r a y me t h o df o u n d t h a t t h e m o s t c o mm o n m u t a t i o n t y p e i n r po B w a s 531(C ңT ),t h e m o s t c o mm o n o f i s o n i a z i d e w a s k a t G 315(GңC ),f o l l o w e d b y i n h A -15(C ңT ).23s t r a i n s o f MT B w e r e s u b j e c t e d t o M I C v a l u e s u s c e p t i b i l i t yt e s t s ,t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 88.9%o f t h e 531(C ңT )m u t a n t s t r a i n s h a d M I C >16μg /m L ,5.6%h a d M I C =16μg/m L ,5.6%h a d M I C =2μg/m L .1s t r a i n o f MT B w i t h 526(C ңT )m u t a n t a n d 1s t r a i n w i t h 516(AңT )m u -t a n t s t r a i n s h a d M I C v a l u e s >16μg /m L .C o n c l u s i o n T h e m o s t c o mm o n m u t a t i o n t y p e o f r i f a m p i c i n i n Q u a n z h o u a r e a i s r p o B 531(C ңT )m u t a n t ,t h e m o s t c o mm o n t y pe of i s o n i a z i d i s k a t G 315(GңC )m u t a n t ,a n d r p o B c o d o n 531,526a n d 516m u t a t i o n t y p e s h a v e h igh r e si s t a n c e l e v e l s t o r i f a m p i c i n .k a t G d e v e l o p s h i gh r e -s i s t a n c e l e v e l s t o i s o n i a z i d a n d i n h A d e v e l o p lo w l e v e l s o f r e s i s t a n c e t o i s o n i a z i d .K e y wo r d s :m y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s ; d r u g r e s i s t a n c e g e n e ; m i n i m a l i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n ㊃5412㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n ,A u gu s t 2023,V o l .20,N o .15*基金项目:福建省卫生健康委员会中青年骨干人才培养项目(2020G G A 075);福建省泉州市科技计划项目(2018N 066S)㊂ 作者简介:蒋燕成,男,副主任技师,主要从事分子生物学方向的研究㊂ ә 通信作者,E -m a i l :0591350004@163.c o m ㊂Copyright ©博看网. All Rights Reserved.结核病仍然是世界最致命的传染病杀手之一㊂每天约有4100人死于结核病,有近2.8万人感染这种可预防且可治愈的疾病㊂自2000年以来,全球结核病的防治工作已经挽救了约6600万人的生命㊂然而,前几年新型冠状病毒感染(C O V I D-19)大流行使多年来在终止结核病方面取得的进展出现了倒退㊂2020年,因结核病死亡的人数10年来第一次出现了增加㊂我国2020年估算的结核病新发患者数为84.2万(2019年为83.3万),估算结核病发病率为59/10万(2019年为58/10万),在30个结核病高负担国家中我国估算结核病发病数排第2位(8.5%)[1]㊂耐多药结核病(M D R-T B)的出现及持续蔓延,已经成为有效控制结核病的严重威胁,因此控制M D R-T B是一个迫切需要关注的问题㊂M D R-T B的出现和传播主要是由于D O T S策略实施不当㊁抗结核药物短缺或质量差㊁患者对处方方案治疗依从性差[2]㊂世界卫生组织建议对所有疑似结核病患者进行标准治疗前都应进行结核药敏试验,以避免获得性耐药的进一步产生[3]㊂本研究对结核分枝杆菌(MT B)的耐药基因变特征,以及其突变特征与耐药水平相关性来进行分析,以了解MT B的耐药机制,尽早尽快地为临床感染患者治疗提供基础㊂1资料与方法1.1一般资料选取2019年6月至2021年6月在泉州市第一医院检验科经结核药敏试验鉴定为耐利福平㊁异烟肼的MT B51株作为研究对象㊂1.2仪器与和试剂 E x t r a c t o r36核酸快速提取仪,晶芯 S l i d e W a s h e r T M洗干仪,晶芯 微阵列芯片扫描仪及MT B耐药基因检测试剂盒均购自北京博奥晶典生物科技有限公司㊂P C R仪和S e n s i t i t r e 结核药敏板购自美国赛默飞世尔科技有限公司㊂MG I T7m L 培养管㊁B A C T E C MG I T960系统㊁MG I T960S I R E 药敏试剂盒均购自美国B D公司㊂1.3方法1.3.1 D N A微阵列芯片法(1)D N A提取:向核酸提取管中加入50μL核酸提取液,取混匀的菌液标本(以1个麦氏浊度为宜)20μL加到核酸提取液中㊂将核酸提取管置于核酸快速提取仪中,最大转速振荡5 m i n㊂将核酸提取管置于95ħ水浴锅或金属浴中,加热5m i m㊂1000r/m i n离心1m i n,备用㊂(2)P C R扩增:根据被测样品准备200μL离心管,并预先标记样品编号㊂从试剂盒中取出P C R扩增试剂使其充分融化,轻摇混匀㊂将P C R扩增试剂按每管18μL分装于200μL离心管中,盖好管盖㊂在标本制备区内加入模板D N A㊂模板D N A包括被测样品D N A(核酸提取管中的上清液)㊁阳性对照品或阴性对照品㊂对于1个样品,向3管中分别加入同一模板D N A各20μL㊂扩增条件设定:37ħ600s,94ħ600s,94ħ30 s,60ħ30s,72ħ40s,共35个循环;94ħ30s,72ħ60s,共10个循环;72ħ420s㊂(3)芯片杂交:将扩增好的产物置于扩增仪中95ħ变性5m i n,冰浴5 m i n,取出杂交缓冲液按9μL杂交缓冲液,相应向每管中分别加入同一样品的P C R产物1和P C R产物2各3μL,P C R产物1和P C R产物3各3μL㊂在基因微阵列芯片杂交盒的底部加入200μL蒸馏水㊂经盖片的加样孔加入13.5μL杂交反应混合物,迅速盖上杂交盒并密封㊂立即将密封好的杂交盒水平加入50ħ预热的恒温水浴锅中,待杂交盒全部放入后计时120m i n㊂杂交反应结束后,将杂交盒水平取出并将芯片取出,再进行芯片的洗涤,洗液Ⅰ洗1次,30ħ, 120s;洗液Ⅱ洗2次,30ħ,60s㊂然后离心机中离心5m i n,甩干㊂打开T B M D R T e s t软件预热10m i n,将芯片放置扫描仪芯片卡槽中,开始扫描芯片,进行结果的判读㊂1.3.2最低抑菌浓度(M I C)药敏试验法使用S e n-s i t i t r e MY C O T B I M I C法进行M I C测定试验㊂每个测试批次中均包含作为对照的MT B H37R v菌株(A T C C27294)㊂分别依据1.0μg/m L和0.5μg/ m L的临界水平对MT B的耐药性进行判读,其中M I Cȡ4μg/m L为高耐药,M I C<4μg/m L为低耐药㊂1.3.3比例法采用药敏试验对痰标本进行4% N a O H/N a C l前处理后接种至液体培养管中,随后置于M G I T960培养仪中培养㊂药敏试验严格按照美国B D 公司M G I T960系统的操作步骤对其进行异烟肼㊁利福平㊁链霉素㊁乙胺丁醇4种一线抗结核药物检测,培养管内药物终水平分别为0.1㊁1.0㊁1.0㊁5.0μg/m L㊂1.4统计学处理采用E x c e l2007进行数据录入整理,使用S P S S22.0统计软件进行数据分析㊂计数资料以例数或百分比表示,组间比较采用χ2检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1表型检测和M I C测定结果51株耐药MT B菌株中,有1株耐利福平单耐药MT B,2株耐异烟肼单耐药MT B,48株耐利福平㊁异烟肼耐多药MT B㊂通过对23株耐多药MT B菌株进行M I C药敏试验发现:对利福平而言,M I C>16μg/m L有21株(91.30%),M I C=16μg/m L有1株(4.35%), M I C=2μg/m L有1株(4.35%),不同M I C耐多药MT B菌株对利福平耐药的构成比比较,差异有统计学意义(χ2=52.17,P<0.05);对异烟肼而言,M I C> 4μg/m L有10株(43.48%),M I C=4μg/m L有7株(30.43%),M I C=2μg/m L有1株(4.35%),M I C= 1μg/m L有2株(8.70%),M I C=0.25μg/m L有2株(8.70%),M I C=0.12μg/m L有1株(4.35%),不同M I C耐多药MT B菌株对异烟肼耐药的构成比比较,差异有统计学意义(χ2=6.72,P<0.05)㊂2.2 D N A微阵列基因芯片法结果通过D N A微阵㊃6412㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.列芯片法对48株耐多药MT B 进行基因型检测,结果显示:对利福平r po B 基因而言,有6株为野生型(12.5%),点突变以531(C ңT )突变型为主,有30株(62.5%),其余分别为516(A ңT )突变型4株(8.3%)㊁526(C ңT )突变型3株(6.3%)㊁526(C ңG )突变型3株(6.3%)㊁533(TңC )和516(AңT )双突变1株(2.1%),有1株出现了样本异常,利福平r p o B 基因不同突变型菌株的构成比比较,差异有统计学意义(χ2=52.84,P <0.05);对异烟肼k a t G ㊁i n h A 基因而言,有14株野生型(29.2%),点突变以315(GңC )突变型为主,有25株(52.1%),其余分别为315(GңA )突变型3株(6.3%)㊁-15(CңT )突变型5株(10.4%)㊁315(GңC )和-15(CңT )双突变型1株(2.1%),异烟肼k a t G ㊁i n h A 基因不同突变型菌株的构成比比较,差异有统计学意义(χ2=34.12,P <0.05)㊂2.3 不同检测法方法对M D R -T B 检测结果的比较 通过比例法㊁M I C 法㊁基因芯片法对23例耐多药MT B 进行耐药情况检测显示,3种方法检测出的耐药菌株均以耐利福平㊁异烟肼同时耐药为主,但3种方法耐利福平㊁异烟肼菌株检出率比较,差异无统计学意义(χ2=4.13,P >0.05)㊂见表1㊂表1 比例法㊁M I C 法㊁基因芯片法对M D R -T B 检测结果比较[n (%)]方法耐利福平耐异烟肼耐利福平㊁异烟肼比例法0(0.0)0(0.0)23(100.0)M I C 法1(4.3)0(0.0)22(95.7)基因芯片法3(13.0)0(0.0)20(87.0)2.4 利福平耐药基因突变类型在不同M I C 的分布情况 88.9%的531(CңT )突变菌株M I C>16μg/m L ,5.6%的菌株M I C=16μg/m L ,5.6%的菌株M I C =2μg/m L ;4株526(CңT )突变型和1株516(AңT )突变型菌株的M I C 均>16μg/m L ㊂见表2㊂表2 利福平耐药基因突变类型与M I C 的关系[n (%)]突变类型nM I C (μg /m L )216>16531(C ңT )181(5.6)1(5.6)16(88.9)526(C ңT )40(0.0)0(0.0)4(100.0)516(AңT )10(0.0)0(0.0)1(100.0)合计231(4.3)1(4.3)21(91.4)2.5 异烟肼耐药基因突变类型在不同M I C 的分布情况 66.7%的野生型突变菌株M I C>4μg /m L ,33.3%的野生型突变菌株M I C=0.12μg/m L ;2株315(GңA )突变型菌株M I C=0.25μg/m L ,M I C=1μg /m L 和M I C >4μg /m L 的315(GңA )突变型菌株各1株;M I Cȡ4μg/m L 的315(GңC )突变菌株12株,1株315(GңC )突变菌株的M I C =1μg/m L ;1株-15(C ңT )突变型菌株M I C =2μg/m L ,1株-15(C ңT )突变型菌株M I C >4μg/m L ;1株315(GңC )和-15(C ңT )双突变型菌株M I C =4μg/m L ㊂见表3㊂表3 异烟肼耐药基因突变类型与M I C 的关系[n (%)]突变类型nM I C (μg /m L )0.120.25124>4野生型31(33.3)0(0.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)2(66.7)315(G ңA )40(0.0)2(50.0)1(25.0)0(0.0)0(0.0)1(25.0)315(G ңC )130(0.0)0(0.0)1(7.8)0(0.0)6(46.1)6(46.1)-15(C ңT )20(0.0)0(0.0)0(0.0)1(50.0)0(0.0)1(50.0)315(G ңC )-15(C ңT)10(0.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)1(100.0)0(0.0)合计231(4.3)2(8.7)2(8.7)1(4.3)7(30.4)10(43.6)3 讨 论目前对于MT B 耐药的检测主要有2种方法,其中一种为表型检测,另外一种为基因型检测㊂对MT B 来说,抗生素的临界水平或 断点 指的是能够抑制95%尚未接触过任何抗菌药物( 野生型 )的菌株的最低水平,通常代表最高的M I C ,或者是用尚未接触过药物的野生型菌株所获得的抑制生物体生长所需的抗生素的浓度㊂由于发现耐多药MT B 对相应的药物有着不同的耐药程度[4],笔者将收集到的耐多药MT B 进行M I C 测定,其目的是分析耐多药MT B的不同基因突变特征,以及M I C 的变化情况㊂基因芯片技术由于其灵敏度和效率高,可作为传统药敏试验的一种补充手段,尤其是对利福平和异烟肼耐药菌株的检测,从而有助于在临床上如何制订㊁实施有针对性的个体化治疗和用药方案[5]㊂比例法是目前大多医院在使用的检测MT B 耐药性的主要方法,但其检验周期较长,得到较纯的培养物后还需要4周的时间才能得到结果,并且其较多的影响因素,烦琐的操作步骤,易受干扰[6]㊂本研究采用S e n s i t i t r e MY C O T B I M I C 法和D N A 微阵列基因芯片法与比例法进行比对,结果显示M I C 法与比例法的符合率为95.7%,这与R I C H -T E R A 等[6]关于M I C 法的研究一致㊂M I C 法能较准确检测出一线㊁二线抗结核药物真实的M I C ,且检测周期较比例法短,有利于尽早为临床医生提供耐药情况以便临床治疗㊂比例法和基因芯片法的符合率为87.0%,这与李丹等[7]关于基因芯片技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药性分析中应用的研究一致㊂D N A 微阵列基因芯片法检验周期短,高速,可靠,有利于耐药结核分枝杆菌的早期检测㊂本研究结果表明,88.9%的531(C ңT )耐利福平突变菌株中M I C >16μg/m L ,5.6%的531(C ңT )耐利福平突变菌株M I C=16μg/m L ,5.6%的531(Cң㊃7412㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n ,A u gu s t 2023,V o l .20,N o .15Copyright ©博看网. All Rights Reserved.T)耐利福平突变菌株M I C=2μg/m L,4株526(CңT)突变型和1株516(AңT)突变型均M I C>16,但由于所收集到的菌株数不足,未能发现密码子511和533相关的M I C㊂有研究表明,密码子531㊁516㊁526是可能导致MT B对利福平产生高耐药水平的常见突变类型,511和533密码子有可能会产生对利福平的低耐药水平[8]㊂对代谢活跃的MT B,利福平具有显著的杀菌作用㊂利福平是靶向D N A依赖性R N A聚合酶并抑制该菌转录的药物,细菌R N A聚合酶基因的81碱基对区域中的突变r p o B(密码子507~533)编码酶的活性位点,其对所有利福平耐药菌株的比例>95%[9]㊂本研究结果发现,对利福平r p o B基因而言,最常见的突变类型是531(CңT)突变型,其次是516(AңT)㊁526(CңT)㊁526(CңG)突变型㊂有研究显示,在墨西哥常见的531(CңT)突变型是在R R D R中观察到的最常见的突变[10]㊂Z AW等[11]的研究中指出,r p o B531(CңT)是最常见的单核苷酸多态性(S N P),而密码子526的突变是第2常见的S N P,即使在同一个国家,与耐利福平相关的r p o B基因突变也有很大差异㊂耐多药MT B中在D N A微阵列基因芯片中对关于异烟肼耐药的k a t G和i n h A基因中检测,k a t G具有2223b p的长度并且合成参与霉菌酸合成的过氧化氢酶,k a t G基因中最普遍的突变是在密码子315 (S e r315ңT h r;S315T)处的取代,发现其在40%~ 90%的耐异烟肼临床MT B分离株中发生,因此被认为是可靠的检测标记[12]㊂而i n h A是F A S-Ⅱ系统的烯酰基-酰基载体蛋白(A C P)还原酶,其催化在与A C P相关的生长脂肪酸链的第二位双键N A D H依赖性还原,由于异烟肼在治疗结核病患者方面的成功, i n h A是临床验证的目标[13],试验结果发现其主要的突变类型是315(GңC)突变型,然后是-15(CңT)突变型,其次是315(GңA)突变型,还有部分的315 (GңC)和-15(CңT)双突变型㊂50%~95%的耐异烟肼株中存在k a t G基因位点的第315密码子突变, 20%和35%的耐异烟肼株中存在着i n h A调控区的突变㊂最常见的i n h A突变发生在C15T位点,是在其的启动子区,这一般与耐药的单抗有关㊂i n h A编码区突变的菌株通常表现为对异烟肼的低水平耐药㊂本研究结果显示,密码子531㊁516㊁526可能是导致MT B对利福平产生高耐药性的常见突变类型㊂k a t G315与异烟肼的高耐药性相关,而i n h A则较多与异烟肼的低耐药性相关㊂利福平r p o B中最常见的突变类型是531(CңT)突变型,异烟肼中最常见的是k a t G315(GңC),其次是i n h A-15(CңT)㊂本研究通过分析耐药基因突变位点在不同药物M I C的分布情况,快速获得耐药水平,有助于制订治疗方案和阐明耐药机制,指导临床用药㊂参考文献[1]W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n.G l o b a l t u b e r c u l o s i s r e p o r t2021[R].G e n v e a:WHO,2021.[2]MU T HU K R I S HN A N L.M u l t i d r u g r e s i s t a n t t u b e r c u l o s i s -d i a g n o s t i c c h a l l e n g e s a n d i t s c o n q u e r i n g b y n a n o t e c h n o l-o g y a p p r o a c h-a n o v e r v i e w[J].C h e m B i o l I n t e r a c t,2021, 337:109397.[3]W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n.WH O t r e a t m e n t g u i d e l i n e s f o rd r u g-re s i s t a n t t u b e r c u l o s i s2020[R].G e n v e a:WH O,2020.[4]C AM I N E R O L J A,PÉR E Z M G,R O D RÍG U E Z D C F.M u l t i-d r u g r e s i s t a n t t u b e r c u l o s i s,t e n y e a r s l a t e r[J].M e dC l i n(B a r c),2021,156(8):393-401.[5]尤丽娟,张冬青,赵娇,等.基因芯片和高分辨率熔解曲线在结核分枝杆菌检测中的应用分析[J].检验医学与临床,2022,19(12):1716-1718.[6]R I C H T E R A S S,K A R I C HU A J,O T I S O J,e t a l.E v a l u a-t i o n o f s e n s i t i t r e b r o t h m i c r o d i l u t i o n p l a t e f o r d e t e r m i n i n g t h e s u s c e p t i b i l i t y o f c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e t o p o l y m y x i n s[J].D i a g n M i c r o b i o l I n f e c tD i s,2018,91(1):89-92.[7]李丹,杜德兵,吴文燕,等.基因芯片技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药性分析中的应用[J].检验医学,2019,34(2): 165-168.[8]X I A H,S O N G Y,Z H E N G Y,e t a l.D e t e c t i o n o f m y c o-b ac t e r i u m t u b e r c u l o s i s r i f a m p i c i n r e s i s t a n c e c o n f e r r ed b y b o r de r l i n e r p o B m u t a t i o n s:X p e r t M T B/R I F i s s u p e r i o r t o p h e n o t y p i c d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g[J].I nf e c t D r ug R e-s i s t,2022,15:1345-1352.[9]Z A R E I Z,E M A M I A,M O G H A D A M I M,e t a l.M o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o n o f I s o n i a z id a n d R i f a m p i c i n t a r ge t g e n e s i nm u l t i-d r u g r e s i s t a n t M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i s o l a t e sf r o m s o u t h w e s t o f I r a n[J].G e n e R e p,2017,6:19-25.[10]C U E V A S R J,CÓR D O B A B C,C R I V E L L I A P,e t a l. r p o B,k a t G a n d i n h A m u t a t i o n s i n m u l t i-d r u g r e s i s t a n t s t r a i n s o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c l i n i c a l i s o l a t e s f r o m s o u t h e a s t M e x i c o[J].E n f e r m I n f e c c M i c r o b i o l C l i n(E n g l E d),2019,37(5):307-313.[11]Z A W M T,E M R A N N A,L I N Z,e t a l.M u t a t i o n s i n s i d e r i f-a m p i c i n-r e s i s t a n c e d e t e r m i n i n g r e g i o n o f r p o B g e n e a s s o c i a t e dw i t h r i f a m p i c i n-r e s i s t a n c e i n M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s[J]. J I n f e c t P u b l i c H e a l t h,2018,11(5):605-610.[12]U N I S S A A N,D O S S C G P,K UMA R T,e t a l.S i g n i f i-c a n c e o f c a t a l a s e-p e r o x id a s e(K a t G)m u t a t i o n s i n me d i a-t i n g i s o n i a z i d r e s i s t a n c e i n c l i n i c a l s t r a i n s of M y c o b a c t e r i-u m t u b e r c u l o s i s[J].J G l o b A n t i m i c r o b R e s i s t,2018,15: 110-120.[13]A L MA T A R M,MA K K Y E A,V A R I,e t a l.N o v e l c o m-p o u n d s t a r g e t i n g I n h A f o r T B t h e r a p y[J].P h a r m a c o l R e p,2018,70(2):217-226.(收稿日期:2022-11-06修回日期:2023-05-05)㊃8412㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.。
一线抗结核分枝杆菌药物耐药分子机制的研究进展
酶 ｐ 基 的基 因 上 （ ３ ３ ｂ 亚 含 ５ ４ ｐ的 ＯＲ 编 码 １ ７ 个 氨基 Ｆ， １８
现， 结核病疫情 回升 ， 为亟待解决 的全球 性公共卫生 问 成
题 。现 就 国 内外 学 者 对 一 线 抗 结 核 分 枝 杆 菌 药 物 耐 药性
的分 子 机 制 研 究 现状 综述 如下 。 １ 异 烟 肼 耐 药 的 分 子 机 制 异 烟 肼 通 过 在 菌 体 内 被 过 氧化 氢 酶一 氧 化 物 酶 激 活 ［ ， 生 一 系列 的 活 性 氧 过 １产 ］
和活 性 有 机 自 由基 ， 击 结 核 分 枝 杆 菌 的 多 个 靶 点 ， 成 攻 造
一
些 蛋 白靶 点 某 些 基 团 的 氧 化 或 酰 化 ， 致 菌 体 一 些 生 导
理 功 能 的 丧 失 。活 化 后 的异 烟 肼 作 用 于 细 胞 壁 分 枝 菌 酸 合 成 途 径 中的 酶 系 包 括 ： 酯 酰 ＡＣ 烯 Ｐ还 原 酶 （ｎ 、 ＩｈＡ）酰 基 携 带 蛋 白 （ ｐＭ） 口 酯 酰 ＡＣ Ａｃ 及 酮 Ｐ合 成 酶 （ ａ 的 Ｋ ｓＡ）
一
２ 世 纪 ５ 年 代 ， 报 道 使 用 异 烟 肼 不 久 出现 耐 药菌 Ｏ Ｏ 有 株， 实是 过氧 化 氢酶一 氧 化 物酶 失活 所 致。１９ 证 过 ９ ２年 Ｚ ａ ｇ等 ［发 现 在 ３株 ＭＩ ＞ ５ｐ ／ 的 高 浓 度 耐 药 株 ｈｎ １ Ｃ ０ ｇ ｍｌ 中 ， ２ 完 全 缺 失 ｋ ｔ 基 因 ， 为 由此 导 致 菌 株 耐 药 。 有 株 ａ Ｇ 认 目前 ， 已经 在 ４ ％ 的 耐 异 烟 肼 菌 株 中发 现 第 ３ ５ 丝 氨 Ｏ １位 酸 一 苏 氨 酸 （ ｅ－ Ｔ ｒ ＡＧ －Ａ Ｃ） 变 。使 得 过 氧 化 Ｓ ｒ￣ ｈ ， Ｃ－ Ｃ 突 － ￣
结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分子机制研究进展
结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分子机制研究进展杨寿慧;刘惟优【摘要】结核病是由结核分枝杆菌引起的一种威胁全球健康的传染性疾病.异烟肼是结核病治疗应用最广泛的药物之一.前体异烟肼通过过氧化氢-过氧化物酶(KatG)激活,活化的异烟肼可抑制靶蛋白InhA.异烟肼耐药的分子机制涉及多个基因,其中katG基因突变是异烟肼耐药主要的原因,另外还有inhA、kasA、oxyR基因等.外排泵系统在异烟肼耐药方面也起着重要作用.了解异烟肼抗结核分枝杆菌作用机制及结核分枝杆菌耐异烟肼的分子机制将有助于异烟肼耐药结核病的诊治.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2018(031)010【总页数】5页(P1086-1090)【关键词】结核分枝杆菌;异烟肼;耐药机制【作者】杨寿慧;刘惟优【作者单位】341000 赣州,赣南医学院第一附属医院呼吸科;341000 赣州,赣南医学院第一附属医院呼吸科【正文语种】中文【中图分类】R5160 引言结核病是由结核分枝杆菌引起的长期以来威胁人类健康的传染性疾病。
据世界卫生组织估计2015年全世界约有1040万新发结核病例，我国新发肺结核人数仅次于印度和印度尼西亚位高居全球第3位[1]。
作为一种典型的持留菌，体内潜伏感染的结核分枝杆菌难以清除并且有很强的耐药突变潜力[2]。
目前结核病治疗上应用最广泛的一线抗结核药物是异胭肼，但随着异烟肼耐药结核菌的增加，使得患者不得不更换昂贵且副作用大的二线抗结核药物。
结核病治疗方案的选择常常需要依据药敏结果，但传统药敏培养时间一般长达4～8周。
值得关注的是近年来分子生物学在结核菌耐药检测方面取得一些重要的进展，为结核分枝杆菌耐药检测提供了新思路。
1 异烟肼及其对结核分枝杆菌的作用机制结核分枝杆菌的细胞壁由长链分枝菌酸、高支链的阿拉伯多糖、肽聚糖组成的交叉连接网3个主要的组成成分。
异烟肼是作用于结核分枝杆菌细胞壁分枝菌酸合成的窄谱抗生素。
从1952年开始异烟肼作为抗结核药物应用于临床，其结构仅一个吡啶环连接一个酰肼基。
结核分枝杆菌对二线药物耐药性及机制研究进展
地减 少该 操作对 患者所 造成 的影 响和损害 ，需要 护理工 作者 不断的 ＥＰ Ｂ ，努力钻研 业务 ，提高护理质 量 ，更好 的服务 于患者 ，促进护理
事业的发展。
参考 文献 ［】 冯 先琼 ， 冀 娟 ． 证 护理 ： 理 发展 新 动 向【Ｊ 用 护理 杂 志 ， １ 成 循 护 Ｊ＿ 实
播模 式研 究” （ 病分子流行病学研 究） （０８Ｘ０／ ３ ００ ０） 结核 ２０Ｚ ｌ ０— １－ ２ ． ０
通讯作 者 ：Ｅ ｍ ｉ ａ ａｇ ＠ｉ ｃｃ － ａ：ｗ ｎ ｎｌ ｃ ． ｌ ｋ ｉ ｄ ｎ ｎ
管 ，血液就会 自动充满针栓或乳头 ，操 作者 即可抽取所需的血量 ，避 免盲 目抽取，成功率高，疼痛减轻，患者能接受和理解。 ２ ． ４评价指标
【 关键 词】 结核 分枝 杆 茵；药物耐 药；机制 ；研 究进展
中 图分 类号 ：Ｒ７ ．１１ ３８９
文 １４ （０ １ ５ ０４— ４ ６ １ ８ ２ １ ）０— ０４ ０ ９
结核病耐药性 的产生和传播 已成为全球公共卫生工作 的焦点。世
２ ０ 年 南非发现首例 广泛耐药结 核病 （ ｔ ｓ ｅ ｒｇｒｓ ｔ ｔ ０５ ｅ ｅ ｉ ｌ ｄｕ － ｉ ａ ｘ ｎｖｙ ｅｓ ｎ
一
两组 患者 在一次性穿刺成 功率 、疼痛的程度及患者 的感 受程度差
异有统计学意义 。实践证明 ，循证护理具有科学性 、实用性 ，可在有
限的医疗资源发挥最大 的作 用。循证护理为护理工作提供 了一 种新 的 模 式 ，它把期刊 、教科 书、网络等获得的信息与临床经验结合 起来 ， 找 出最佳 的有效的依据 ，提 高老年肺源性心脏病患者 的在动脉 采集血 标本 中的成功率 、减轻疼痛 或减少到最低限度 、找 出一条适合 老年 患
异烟肼诱导致单耐异烟肼结核分枝杆菌假定药物外排泵基因表达量变
异烟肼诱导致单耐异烟肼结核分枝杆菌假定药物外排泵基因表达量变化的初步研究目的观察异烟肼诱导致单耐异烟肼结核分枝杆菌假定药物外排泵基因表达情况，并探讨导致该基因高表达的原因。
方法选取30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离株、20株全敏结核分支杆菌分离株和H37Rv（标准对照），对不同菌株进行无异烟肼与亚抑菌异烟肼的诱导培养，采用Real-time PCR技术检测27个假定外排泵基因表达量的变化，并且依据2-ΔΔCT进行计算假定药物外排泵基因的表达差异倍数。
结果30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离基因均可能导致结核分枝杆菌对异烟肼的假定药物外排泵基因表达，且异烟肼会导致其外排泵基因的高表达。
[Abstract] Objective To observe the expression of isoniazid induced to single resistance to isonicotinic acid hydrazide （INH）mycobacterium tuberculosis，and to discuss the possible cause of the high expression. Methods A total of 30 strains of single isoniazid resistant mycobacterium tuberculosis isolates，20 strains of mycobacterium tuberculosis isolates and sensitivity of H37Rv （standard），the different strains were cultured as hydrazine and sub inhibitory INH，and 27 putative efflux pump gene expression changes were detected by real-time PCR reverse transcription，and assuming multiple expression of drug efflux pump disease were calculated on the basis of 2-ΔΔCT. Results 30 strains of single INH resistant Myco bacterium tuberculosis isolates 18 strains of MIC was 2.0 μg/mL （14 strains katG 315 AGC-ACC mutations，4 strains of non-mutant），8 strains of MIC was 1.0 μg/mL [4 strains katG 315 AGC-ACC mutations，4 strains of inhA （-15）C-T mutation]，4 strains of MIC was 4.0 μg/mL [3 strains of katG 315 AGC-ACC，1 strain of ahpC （-88）G-A mutation]，20 strains of Mycobacterium tuberculosis isolates sensitive without mutation. 27 putative drug discharge pump genes in the 11 genes showed high expression，mainly for Rv1258c，Rv2265，Rv0849，Rv0191，Rv1819c，Rv3239c，Rv2209，Rv2936，Rv2937，Rv1146，Rv2938c，and they were 5，4，4，3，3，3，2，2，2，1，1 strains/strain respectively. Conclusion In clinical，Rv1258c，Rv0849 and Rv2265 genes could lead to drugs on the assumption of ionized in mycobacterium tuberculosis efflux pump gene，and isoniazid can lead to high expression of discharge pump gene.[Key words] Isoniazid；Mycobacterium tuberculosis；Efflux pump gene；Expression结核病是临床中常见疾病之一，在该病的控制过程中依然面临着众多问题，常见的有耐药问题和人类免疫缺陷病毒与肺结核病毒的双重感染以及流动人口等[1]。
结核分枝杆菌耐异烟肼突变基因及分子检测方法研究进展
结核分枝杆菌耐异烟肼突变基因及分子检测方法研究进展李芊璘;冯福民;戴二黑【摘要】结核病是一种慢性感染性疾病.我国作为结核病的高负担国家,其高发率已成为严峻的公共卫生问题.异烟肼作为治疗结核病的重要一线药物之一,由于其治疗管理不规范等原因导致临床患者耐药日益严重.目前已知异烟肼最主要的耐药机制是基因突变,如何准确有效地检出耐药基因,是控制结核病的关键.本文从分子角度分别阐述了异烟肼常见耐药基因katG、inhA、ndh、ahpC、oxyR,以及罕见突变基因kasA、sigI、furA、mabA、iniABC、efpA,并针对其检测方法作了概述.%Tuberculosis is a chronic infection caused by Mycobacterium tuberculosis. The high financial burden and high incidence rate of tuberculosis have become a critical public health problem in China. Isoniazid, as one of the important first-line drugs in the treatment of clinical patients, drug resistance is becoming increasingly serious because of the lack of standard treatment. At present, the main mechanism of isoniazid resistance is known as gene mutation. How to detect drug resistance gene effectively and accurately is the key to control tuberculosis. In this article, we analyzed the frequent genes (katG, inhA, ndh, ahpC and oxyR) and novel genes (kasA, sigI, furA, mabA, iniABC and efpA) from the perspective of molecular biology, and summarized their diagnostic methods.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2017(045)012【总页数】4页(P1341-1344)【关键词】分枝杆菌,结核;异烟肼;耐药基因;分子检测;综述【作者】李芊璘;冯福民;戴二黑【作者单位】华北理工大学公共卫生学院 063210;华北理工大学公共卫生学院063210;华北理工大学附属石家庄市第五医院【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一种具有潜在致命性的慢性传染病，其中以肺结核最为常见。
耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的研究
中 国抗 生素 杂 志 ２ １ 年 １ 月第 ３ 卷 第 １期 ００ ０ ５ ０
文 章 编 号 ： １０ —６ ９２ １ ）００ ８ —５ ０ １８８ （０ ０１—Байду номын сангаас ８０
耐 异 烟 肼 结核 分 枝 杆 菌 及其ｋ ｔ ａＧ与ｉｈ ｎ Ａ基 因突 变 的研 究
陈杨 陈玲 张泓ｚ王建华 李娜娜 李开伦 甘辛１ ， 张建勇・
（ Ｄｅａｔ ｎ ｆ ｅｐｒｔｒ ｄｃｎ ， ｕ ｙ ＭｅｉａＣ ｌ ｇ， ｕ ｙ ６ ３ ０ ； ・ ｉ ｅ ｃＲ ｃ ｖｌ ０ ４ ） １ ｐｒ ｍｅ ｔ ｓｉ ｏｙＭｅｉ ｅ Ｚ ｎ ｉ ｄｃｌ ｏｌ ｅＺ ｎ ｉ ５０ ３ ２ ｚ Ｂｏ ｄＩ ， ｏｋ ｉｅ２ ８ ７ ｏＲ ａ ｉ ｅ Ｍ ｎ ｌ
ｉ Ａ ｎＭ ｙｃ ｂ ｃｅ ｉ ｎｈ ｉ ｏ ａ ｔｒｕｍ ｕｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ｓ ｌ ｔ ｓ ｔ ｅ ｃ ｌ ｓｓｉｏ ａ ｅ
Ｃｈｅ ｎ Ｃｈｅ ｎ Ｚｈ ｎｇ Ｈｏ ｇ ， ａ ｇ Ｊａ － ｕａ ， — ａ ， ｉｌ ｎ ， ｎＸｉ ａ ａ ｇＪ ａ ｙ ｎ ｎ Ｙａ ｇ ， ｎ Ｌｉ ｇ ， ａ ｎ Ｗ ｎ ｉ ｎ ｈ Ｌｉ Ｎａ ｎ 。 ＬｉＫａ －ｕ Ｇａ ｎ ｎｄＺｈ ｎ ｉｎ－ ｏ ｇ ，
株出现ｋｔ ￣（ ｉｈ 基因突变。在突变株 中，９５ ％） 为ｋｔ ａＧ 或） Ａ ｎ （Ｏ 株 ａＧ单基 因突变 ，５２ ．％） 为ｉｈ 单基 因突变， （２ ％） 为ｋｔ 和 （７８ 株 ｎＡ ４２ ． 株 ２ ａＧ ｉｈ 双基 因联合突变。两个新突变位点（ａ ３ Ｍｅ 和 Ｐｏ ３ Ｇｎ为首次发现 ，已被美 国，欧洲和 日本的基 因库收录 。结论 该 ｎＡ Ｖｔ ０ ｔ ２ ｒ２ ２ ｌ） 研究证实结核分枝杆菌ｋｔ ｎＡ 因突变与耐异烟肼相关 ，为进 一步研究异烟肼的抗菌机制奠定了基础 。 ａＧ和ｉｈ 基 关键词：耐异烟肼 ；结核分枝杆 菌；聚合酶链式反应 ；序列分析 ；基因突变
结核分枝杆菌耐药性的研究
结核分枝杆菌耐药性的研究结核病是一种由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 引起的慢性传染病。
该病在全球范围内广泛存在，尤其在发展中国家中尤为常见。
然而，随着时间的推移，病原体逐渐进化并发生耐药性。
毒菌学家们最近对结核分枝杆菌的耐药性进行了研究，以了解这种病原体的新的抗药性机制。
结核分枝杆菌的耐药性结核分枝杆菌是一种革兰阳性的细菌，存在于气溶胶中，并通过呼吸道被人体吸入。
这种细菌可以耐受抗结核药物，使得病人复发或出现难治的病例。
结核分枝杆菌的耐药性主要分为以下几种类型：1.单药耐药：结核分枝杆菌对一种抗结核药物产生耐药性。
2.多药耐药：结核分枝杆菌对异烟肼和利福平两种药物产生耐药性。
3.极耐药性：结核分枝杆菌对异烟肼、利福平和其中至少一种次级药物产生耐药性。
该病原体的耐药行为是由许多基因突变引起的。
耐药突变可以降低药物与细菌的相互作用，导致药渗透减少或抗菌药物代谢增加等现象。
因此，治疗复杂、费用高昂，对全球公共卫生构成威胁。
结核分枝杆菌的基因组学研究随着基因组学技术的迅速发展，科学家们能够更好地理解结核分枝杆菌获得耐药性的基因机制。
研究现有的截至2010年的稳定基因组序列后，毒菌学家们发现结核分枝杆菌的比较基因组学和基因功能分析有助于了解该菌的新的耐药性机制。
一个主要的发现是，在结核分枝杆菌的基因组中，有一个名为WhiB7的调节因子，它可以在细胞内激活多个下游基因，从而促进细菌对异烟肼的耐药性。
此外，已经证明，哺乳动物宿主中具有抗击结核分枝杆菌的免疫路径（包括干扰素致死和内体消化等）。
结核分枝杆菌的药物治疗研究药物治疗是治疗结核病的主要方法。
第一线药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等。
但是，由于其慢生长率，结核分枝杆菌需要治疗长达6到9个月，而治疗代价昂贵，并且表现出不可预测的耐药性问题。
一些研究表明，与传统药物相比，新开发的抗结核药物更具潜力。
这些药物包括间位卡那霉素（一种耳鼻喉科常用药物）、利福霉素和赛拉奥星等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
=综述>结核分枝杆菌异烟肼耐药性研究进展朱艳伶1,2,万康林2,沈国顺1近20余年来,由于耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌(MDR-TB)的肆意横行,各国的结核病疫情均呈回升趋势,全球发病率和死亡率不断升高112。
我国的耐药情况尤为严重。
据统计目前初始耐药率为1816%,获得性耐药率为4615%,全国现有耐药的涂阳肺结核病人约42万;在全球对53个国家的耐药调查中,河南省的原发MDR-TB耐药率位居第2位。
因此在WHO最近公布的全球38个国家和地区的结核病耐药监测资料中,中国被列为/特别引起警示的国家和地区0之一122。
近年来,各国学者采用分子生物学技术对结核杆菌耐药机制进行深入研究,定位了结核分枝杆菌包括异烟肼在内的耐药基因的位置和基因突变位点,从而促进了第一代快速鉴定耐药突变菌株方法的建立和新型抗结核药物的开发。
异烟肼作为最主要的抗结核药物之一,是多种药物联合化疗治疗结核病的基本组成部分,但也是最易产生耐药性的抗结核药物。
已发现结核分枝杆菌对异烟肼耐药涉及多个基因变化:katG,inhA,kasA,ndh,及oxyR-ah pC基因连接区,突变形式多样化,并且突变位点又不确定更加剧了结核病防治的困难。
因此,对耐药菌的耐药机制进行深入全面的了解,建立方便快捷经济的检测方法,从而开发新的抗结核药物和开展更有效的化疗是目前亟待解决的问题。
1结核杆菌异烟肼耐药机制异烟肼(Isoniazid,INH)是1912年由两个捷克生化学家首次合成的,但它强有力的抗生素活性直到1951年才被发现。
作为使用了40余年的抗结核一线化疗药物,其作用主要是通过抑制结核杆菌分枝菌酸的生物合成,造成细胞壁破损而杀菌。
但是在单药化疗和不适当化疗期间容易产生耐药性。
INH 的耐药性与一个或多个基因的各种突变有关,这些基因主要包括编码触酶-过氧化物酶的katG基因,编码烯酰基载体蛋白还原酶的inh A基因,编码烷基-氢过氧化物还原酶的ahpC 基因,编码B-酮酰基载体蛋白合成酶的Kas A基因及调节分枝杆菌氧化-应激的oxyR基因。
111katG研究表明INH实际上是一个药物前体,需要经结核分枝杆菌触酶-过氧化物酶活化后才发挥抗结核作用,而触酶-过氧化物酶则由katG基因所编码。
最新研究认为katG基因的变异(包括突变,缺失,插入等)导致的结核分枝杆菌触酶-过氧化物酶活性降低或缺失可以解释90%以上的INH耐药。
20世纪90年代早期,张132等将ka tG基因克隆导入耐INH的耻垢分枝杆菌可恢复INH敏感性。
作者单位:11沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁省沈阳市东陵区120号110161;21中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京昌平流字五号102206通讯作者:万康林近年来研究发现INH耐药性结核分枝杆菌中katG基因突变最主要的是点突变。
不同地区菌株点突变的位置变化较大,但约40%的变异出现在S315T位置。
此位置变异通过对katG 活性位点甲基化阻碍了INH与katG的结合,导致酶失去活化INH的能力。
Coll等142对来源于巴塞罗纳的61株异烟肼耐药株进行分析,其中55%分离株被检测到katG基因有所改变,最普遍的变异是发生在第315位密码子(占32%),这些菌株显示了高水平的耐药,但大多数仍保留了相当的触酶-过氧化物酶的活性。
ka tG基因其他位置上的变异如D63E,H108Q, T262R,A350S等对于酶的稳定性和催化能力也很重要,可以导致细菌对INH产生不同水平的耐药性和保留不同的触酶-过氧化物酶活性152。
KatG第315位点突变率的特点还体现在地区的差异上。
如国内的陈曦162等对临床分离的101株耐药菌株进行分析,结果第315位点的突变率占3816%(39/101)。
这一结果明显低于南非(64%,80/124)172、俄罗斯西北部地区(93%,191/204)182,而又明显高于芬兰(7%,4/54)、新加坡(26%,41/160)192等地区的报道。
112oxyR-ahpCChristman1102等在研究大肠杆菌和伤寒沙门菌的基础上推断出在肠菌属和其他的微生物里oxyR调节子控制着一套复杂的氧化调节系统,它在对环境刺激反应时被激活。
oxyR作为一个调节蛋白它即是氧压的感应器又是基因转录的活化剂, oxyR控制编码解毒酶基因如触酶-过氧化物酶(katG编码)和烷基氢过氧化物酶(ah p C编码)的表达。
研究表明在结核分枝杆菌复合体中的oxyR基因发生大量的移码突变和缺失、失活,使其成为一个假基因。
Deretic1112等用这种突变体与携带具有活性的oxyR-ah p C基因的质粒组成一个重组体,结果对异烟肼耐药,表明结核分枝杆菌对异烟肼的敏感性在很大程度上由于oxyR调节子的畸变。
一般研究者发现在异烟肼耐药菌株中oxyR启动子序列的突变常伴随着katG活性的不足。
因此一般将ah pC突变作为katG基因损伤的标志1122。
另外Dhandayu thapani1132等通过Wes-tern免疫斑点分析得出突变的等位基因能增强转录活性,即某些katG突变的耐异烟肼分离株存在ahpC启动子的突变,以增强ah p C表达来补偿触酶-过氧化物酶的缺乏,从而抵抗宿主巨噬细胞的氧化。
Dhandayuthapani又将纯化的ah pC蛋白导入耻垢分枝杆菌,结果它对INH高度敏感,而在此菌中过表达ah p C蛋白引起对INH耐药。
AhpC编码基因突变极少,可能与耐异烟肼无关。
113inhAinh A基因编码的NADH依赖的enoyl-Acp还原酶催化$-不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸的还原反应,分枝杆菌利用该产物合成的超长链A-脂肪酸是其细胞壁的重要成分。
INH进入菌体后,在分枝杆菌触酶)过氧化物酶的作用下氧化脱氢生成亲电子形式,这种形式能与分枝菌酸生化合成途径中的烯酰基还原酶)还原型烟酰胺二核苷酸复合体结合,干扰分枝菌酸合成而发挥抗菌作用。
有报道1142inh A基因突变约占异烟肼临床耐药株的10%~35%。
目前在MTB耐INH分离株中尚未发现inh A编码基因突变。
约12%的分离株在inh A的调节序列上有突变,当发生单碱基插入变异时有可能创造一个强有力的启动,将使inh A蛋白过度表达从而提高对INH活性形式的滴度,引起对INH耐药1152。
114kasA与INH耐药性kasA,编码B-酮酰基载体蛋白合成酶,参与分枝菌酸生物合成,是INH耐药的另一个相关基因,全长1251bp,编码471个氨基酸,其中最常见的突变是G312S。
但是根据ANN S1G1LEE1162的报道,在敏感株中也发现了大约有19%的G312S 突变,由此可以推断该基因在异烟肼耐药中表现为多态性。
115n dh与INH耐药性对katG、inhA、ah pC、oxyR和kasA基因的分析并不能解释所有的异烟肼耐药问题。
2001年Lee1172等首次报道了结核分枝杆菌一个影响异烟肼耐药的新型突变基因ndh,即编码NADH脱氢酶基因。
n dh基因的突变使NADH脱氢酶活性受到抑制,使NADH/NAD+比率升高,从而产生了对异烟肼的耐药。
2结核分枝杆菌异烟肼耐药基因的分子生物学检测方法研究结核分枝杆菌耐药分子机制的重要目的之一是建立一套快速鉴定结核杆菌耐药基因类型的方法。
了解结核病患者的耐药状况,指导临床的化疗和防止耐药菌体的散播。
目前结核杆菌耐药性检测仍多采用绝对浓度法,比例法等经典方法。
但由于结核分枝杆菌生长缓慢,而耐药结核分枝杆菌生长更为缓慢,其耐药性测定需6~8周甚至更长,不能及时指导临床用药;B AC TET结核培养系统因其价格昂贵等诸多不便限制了其广泛应用。
随着分子生物学的发展,尤其是PCR 技术的问世,检测耐药可以直接从基因上入手,这样与传统的结核杆菌药敏试验相比,不仅大大缩短了检测周期,实现了自动化,而且也降低了实验室生物危险性。
耐药检测包括PCR扩增基因组内携带耐药性区域,然后扩增产物的突变分析。
应用于结核杆菌INH耐药基因突变的技术常见的方法有以下几种:211直接测序法对INH耐药的相关基因进行DNA片段扩增,扩增产物纯化后取DNA片段直接测序,与标准敏感株的同一DNA片段比较来分析碱基突变的位置和分布。
PC R测序是阐明分枝杆菌耐药遗传机制的主要方法。
对于过去认识的和没认识的突变的检测,该方法是最直接和可靠的,但该操作繁琐,费用昂贵限制了它的广泛应用。
陈曦162对101株INH耐药株及43株敏感株进行研究,利用DNA直接测序证实共有91株耐INH 菌株发生了与INH耐药相关的突变,包括81株耐药株(8012%)katG存在点突变,缺失和插入;5株(419%)耐药株inh A发生突变;3株(219%)耐药株ah pC发生突变;17株(1618%)耐药株基因kasA发生突变,而敏感株除23株katG第463位点突变外均无变化。
进一步证实了MTB耐INH 与katG,inhA,ah pC及kasA基因突变之间的关系,并且提示还有其他机制参与。
212PCR-SSC P法聚合酶链式反应-单链构象多态性分析即PCR-SSCP是1989年Ori ta等首先报道的一种PCR扩增产物的单链DNA凝胶电泳技术。
其原理是单链核酸通过自身互补或分子内的互补作用形成折叠构象,单个核苷酸的突变可造成其构象改变,从而导致其在非变性凝胶电泳上迁移速度的改变。
PCR-SSCP 是检测单碱基置换和数碱基缺失或插入的可靠而简便方法,比直接DNA测序容易进行,而广泛用作一种突变筛选方法,但由于受待测DNA片段长度、胶的浓度、缓冲液的离子强度及电泳时的温度等影响,限制了实际应用,同时用SSCP只是初筛,不能确定突变的部位和性质。
翁心华1182等应用限制性内切酶HaeÓ改良的PCR-SSCP技术对临床25株INH敏感株及23株耐药株的inhA基因进行分析,结果25株敏感株中未见inh A基因单链构象差异,23株耐药株中inhA基因突变率为2118%。
新发现的错义突变有A26E,R27K,V28A, Q32A,L54V和S72T,表明此技术适用于TB临床菌株inh A基因突变的筛选。
1997年Telenti1192等用自动化PCR-SSCP对来自MDRTB暴发流行中分离的结核杆菌耐药性进行分析,其灵敏度为87%,katG,inh A,katG-inhA,ah pC,katG-ah p C的突变率为别为3618%,3116%,216%,1312%,和216%。
2000年Kiepiela1142等又结合PCR-SSCP与RFLP法对79株INH耐药株突变基因进行检测。
结果PCR-SSCP方法检测与INH耐药相关基因katG,in hA和ahpC的突变的敏感性分别为100%,9817%和100%。