氨基酸发酵机制及过程

由于谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶比其它微生 物强大得多，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧 化中间物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式积累 起来。 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈 阻遏。若铵离子进一步过剩供给时，发酵液偏酸性， pH在5.5～6.5，谷氨酸会进一步生成谷氨酰胺。
⑤在谷氨酸产生菌中，α–酮戊二酸脱氢酶先天 性缺失或微弱，对导向谷氨酸形成具有重要意 义，这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征。
4．CO2固定反应的调节
CO2固定反应主要通过以下途径完成：
C02的固定反应的作用：补充草酰乙酸； 在谷氨酸合成过程中，糖的分解代谢途径与C02固定 的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的关键问题。
5．NH4+的调节
谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化脱氨反应，脱 氨过程以NAD+作为辅酶，该酶催化的反应虽然偏向 氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的NADH被氧 化成NAD+，同时产生的NH3很容易被除去。 脱氨反应被NH4+和α–酮戊二酸所抑制，这对于谷 氨酸的积累也起到了很好的作用。
6-磷酸葡萄糖 6-磷酸葡萄糖酸
EMP途径 HMP途径
3-磷酸甘油醛
5-磷酸核酮糖
丙酮酸
2.戊糖磷酸途径（HMP途径） 可以生成酵解途径的中间产物6-磷酸果糖和 3-磷酸甘油醛。
肌肉中的葡萄糖代谢情况
3.三羧酸循环（TCA循环）
丙酮酸
+CO2
乙酰CoA
草酰乙酸 柠檬酸 苹果酸 顺乌头酸 延胡索酸 乙醛酸 异柠檬酸 琥珀酸 α -酮戊二酸
能荷逐渐升高时，即细胞内的能量水平逐渐升高， 这一过程中AMP、ADP转变成ATP。 ATP的增加会抑制糖分解代谢，抑制如柠檬酸合 成酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性，并激活糖类合 成的酶，加速糖原的合成。
糖酵解主要受三个酶调节：磷酸果糖激酶、己糖激酶、 丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶是限速酶，己糖激酶控制 酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；三羧酸循环的调控由 三个酶调控，即柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和ā-酮戊 二酸脱氢酶。两者都与能荷的控制调节相关。
中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质 等物质。
在工业上，通过对微生物代谢途径的控制来满足 生产的需要，提高生产效益。 所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。
1．糖代谢(EMP途径和HMP途径)的调节
糖代谢可分为分解与合成两方面。 糖分解代谢包括酵解与三羧酸循环；（提供能量） 合成代谢包括糖的异生、糖原与结构多糖的合成 等，中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。 （消耗能量）
④沿着由柠檬酸至α–酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产 生菌有两种NADP专性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶和L谷氨酸脱氢酶。 在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脱氢酶和异柠檬 酸脱氢酶在铵离子存在下，两者非常密切地偶联起 来，形成强固的氧化还原共轭体系，不与NADPH2 的末端氧化系相连接，使α–酮戊二酸还原氨基化生 成谷氨酸。
葡萄糖和琥珀酸等对异柠檬酸裂解酶起着阻遏作用。
(1)以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对 DCA循环的影响
在生物素亚适量条件下，琥珀酸氧化力降低， 积累的琥珀酸会反馈抑制异柠檬酸裂解酶活性，并 阻遏该酶的生成，DCA循环基本处于封闭状态， 异柠檬酸高效率地转化为α–酮戊二酸，再生成谷 氨酸。 在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性 增大，通过DCA循环提供能量，进行蛋白质的合 成，不仅异柠檬酸转化生成谷氨酸的反应减弱使得 谷氨酸减少，而且生成的谷氨酸在转氨酶的催化作 用下又转成其它氨基酸，也不利于谷氨酸积累。
一、谷氨酸生物合成途径
生物体内合成谷氨酸的前体物质是a-酮戊二酸， 是三羧酸循环(TCA循环)的中间产物，由糖质原料 生物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径(EMP途径)、 三羧酸循环、乙醛酸循环、CO2的固定反应(伍德一 沃克曼反应)等。
（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循环 和乙醛酸循环 葡萄糖
1.糖酵解途径（EMP途径） 将一分子葡萄糖分解成 两分子丙酮酸,并且发生 氧化(脱氢)和生成少量 ATP。
谷氨酸发酵机制
第一节 谷氨酸发酵机制
1.谷氨酸的作用：谷氨酸(g1utamate，Glu， C5H9O4N)是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神 经递质，主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状 体，在学习、记忆、神经元可塑性及大脑发育等方 面均起重要作用。此外，谷氨酸对心肌能量代谢和 心肌保护起着重要作用。
4. 在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，封闭 乙醛酸循环，积累α -酮戊二酸，就能够大量生 成、积累谷氨酸。 因此在谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条 件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。
5. 由葡萄糖生 物合成谷氨酸的 代谢途径
6.葡萄糖对谷氨酸的转化率
（1）在谷氨酸生成期，假如四碳二羧酸是100 ％通过C02固定反应供给，在生长期之后，理 想的发酵按如下反应进行：
当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细 胞内ATP分解生成ADP或AMP，ATP减少，能荷降低， 就会激活某些催化糖类分解的酶(糖原磷酸化酶、磷酸 果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等)或解除 ATP对这些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶(NN合成 酶、果糖-1，6～二磷酸酯酶等)，从而加速酵解、 TCA循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。
在谷氨酸发酵生产中，生物素缺陷型菌在 NH4+存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率 高； NH4+不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生 成物是α–酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨 酸。
四、细胞膜通透性的调节
对谷氨酸发酵的重要性： 当细胞膜转变为有利于谷 氨酸向膜外渗透的方式， 谷氨酸才能不断地排出细 胞外，这样既有利于细胞 内谷氨酸合成反应的优先 性、连续性，也有利于谷 氨酸在胞外的积累。
7.醋酸或正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径 在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时，却只能 经乙醛酸循环供给四碳二羧酸，四碳二羧酸经草酰 乙酸又转化为柠檬酸。
二、谷氨酸生物合成的代谢调节机制
分解代谢： 从环境中摄取营养物质，把它们转 微生物 的代谢
化为自身物质，以此来提供能源和 小分子中间体；
合成代谢：合成代谢将分解代谢产生的能量和
①磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑 制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。 ②柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能 荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反 馈抑制。
反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点 产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。
反馈抑制与反馈阻遏的区别在于：反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢， 反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催 化一系反应的多个酶，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。
原因：碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的许多反应都需要生 物素。 生物素的主要功能是在脱羧-羧化反应和脱氨反应中起辅酶 作用，并和碳水化合物与蛋白质的互变、碳水化合物以及蛋白 质向脂肪的转化有关。 在碳水化合物代谢中，生物素酶能催化脱羧和羧化反应。 碳水化合物代谢中依赖生物素的特异反应有：丙酮酸转化生成 草酰乙酸；苹果酸转化为丙酮酸；琥珀酸与丙酮酸的互变；草 酰琥珀酸转化为α-酮戊二酸。
谷氨酸产生菌的α–酮戊二酸氧化力微弱，尤其 在生物素缺乏的条件下，三羧酸循环到达α–酮 戊二酸时即受到阻挡，这有利于α–酮戊二酸的 积累，然后生成谷氨酸。
3．乙醛酸循环(DCA循环)的调节
乙醛酸循环中的关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸 酶。通过乙醛酸循环异柠檬酸裂解酶的催化作用使 琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补足，其反应 如下：
α -酮戊二酸脱氢酶 NH4 异柠檬酸脱氢酶 乙醛酸循环中的两个关键 酶——异柠檬酸裂解酶和 苹果酸合成酶。
谷氨酸 （胞内）
转移到胞外
（二）谷氨酸合成的理想途径
生物素充足菌EMP所占比例约为62％； 在发酵产酸期，EMP所占比例更大，约为74％。
（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径
1.谷氨酸生产菌株为缺陷型，生产过程分为菌体生 长期和谷氨酸积累期。 2.此代谢途径至少有16步酶促反应。 3.在谷氨酸发酵的菌体生长期，由于三羧酸循环中 的缺陷(丧失a-酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力 微弱)，谷氨酸产生菌采用乙醛酸循环途径进行代谢， 提wenku.baidu.com四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。
6乙酰CoA +2NH3+3O 2谷氨酸 +2CO2+6H2O 2
3mol葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，谷氨 酸对葡萄糖的质量理论转化率为：
(3)实际转化率：处于二者之间，即54.4%～ 81.7%。 CO2固定反应、乙醛酸循环的比率等对转化率影 响较大。 乙醛酸循环活性越高，谷氨酸越不易生成与积累。
(2)以醋酸为原料的谷氨酸发酵对DCA循环的影响
以醋酸为原料发酵谷氨酸时，醋酸浓度要低，高浓度 的醋酸易被完全氧化。 当菌体内的有机酸浓度低到一定程度，DCA循环启 动，此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内 的草酰乙酸共同抑制异柠檬酸脱氢酶，TCA循环转为 DCA循环，不利于谷氨酸生成与积累； 当DCA循环运转使得TCA循环包含的某些有机酸过剩 时，异柠檬酸裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除 对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转。
③异柠檬酸脱氢酶活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不 能太强，这就有利于谷氨酸前体物α-酮戊二酸的生成， 满足合成谷氨酸的需要。 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成α– 酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的α-酮戊二酸还 原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应， 细胞内α–酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡， 当α–酮戊二酸过量时，对异柠檬脱氢酶发生反馈抑制 作用，停止合成α–酮戊二酸。
细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有 弹性的半渗透性膜，磷脂双分子层为其基本结构， 在双分子层中镶嵌蛋白质。
根据细胞膜的结构特性，控制细胞膜 通透性的方法主要有两种： 一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂 合成的控制，使得细胞不能形成完整的细胞膜； 一种是通过干扰细菌细胞壁的形成，使得细胞不能 形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。 在膜内外渗透压差等因素影响下，细胞膜物理性损 伤，增大膜的通透性。
2．三羧酸循环(TCA循环)的调节
谷氨酸产生菌在代谢途径中，三羧酸循环的调节主要 是通过5种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢 酶和α-酮戊二酸脱氢酶。
草酰乙酸+谷氨酸
谷氨酸转氨酶
天冬氨酸+α -酮戊二酸
谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后， 谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶 的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。
(1)能荷的调节 腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸)， 简称为ATP。 其结构简式是：A—P～ P～P，其相邻的两个磷 酸基之间的化学键非常活 跃，水解时可释放约 30.54kJ/mol的能量， 因此称为高能磷酸键。
Atkinson提出了能荷的概念。 认为能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量， 能荷大小可以说明生物体中ATP—ADP—AMP系统的 能量状态。能荷的大小决定于ATP和ADP的多少。 能荷调节是通过ATP、ADP和AMP分子对某些酶 分子进行变构调节来实现的。
(2)生物素对糖代谢速率的调节
生物素对糖代谢的调 节与能荷的调节是不同的， 能荷是对糖代谢流的调节， 而生物素能够促进糖的 EMP、HMP途径、TCA 循环。
谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型。许多研究表 明，生物素对从糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的 比例并没有显著的影响，主要作用是对糖降解速率的 调节。
1mol葡萄糖可以生成1mol的谷氨酸，谷氨酸对葡萄 糖的质量理论转化率为：
（2）在谷氨酸生成期，若 CO2固定反应完全不起作用， 丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催 化作用下，脱氢脱羧全部氧 化成乙酰CoA，通过乙醛酸 循环供给四碳二羧酸。反应 如下： 3C6H12O6 乙醛酸循环： 4乙酰CoA +4H2O 2琥珀酸+4CoASH 6丙酮酸 6乙酰CoA