微生物检验方法验证PPT课件
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微生物检验相关知识PPT课件
13
血液、骨髓、脑脊液标本
❖ 然后涂片革兰染色镜检，把镜检结果及时电话 通知临床医生，并填写初检结果临床通知单。
❖ 常规培养5天，认为阴性者，报告无菌生长， 正常人的血液、骨髓是无菌的，标本中检出 细菌，都应视作病原菌 ﹝需排除污染﹞
14
血液、骨髓、脑脊液标本
脑脊液： ❖ 涂片查抗酸杆菌：脑脊液
24
尿液、粪便标本
粪便 ❖ 涂片检查：当检查霍乱弧菌以及菌群失调优势
菌时需作直接涂片检查。取新鲜标本涂片革兰 染色镜检：
①有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌； ②各种菌在涂片中所占相对比例、推断主 要优势菌； ③有革兰阳性芽生孢子和假菌丝即报告检 出酵母样菌。真菌也可湿片检查。
25
尿液、粪便标本
❖ 一般培养：直接挑取标本中脓血部分接种SS平 板和血平板严格按照三区划线，保证有单个菌 落的分离，置35℃培养。
（正常人的眼内，中耳及鼻窦内是无菌的。）
30
脓液标本的处理
❖ 涂片检查：脓液标本在培养的同时均须涂片， 涂片的结果一方面为临床提供最初的诊治依据， 另一方面可作为分离培养的质量指标。
❖ 涂片直接做革兰染色，镜下可观察细菌和酵母 样菌。涂片做抗酸染色镜检查抗酸杆菌。
31
脓液标本的处理
❖ 注意：对无菌部位的感染，从分泌、粪便标本
❖真菌培养：将标本接种两个TTC-沙氏平板及血 平板，置25℃-30℃和35℃孵育24-48h。真菌性 腹泻多继发于抗生素治疗后，常见有白色假丝 酵母菌。
27
眼耳鼻喉拭子
❖ 根据这些部位感染细菌的特点，须用血平板和 巧克力平板作分离培养，必要时加选麦康凯， 需分区划线。巧克力平板在CO2 环境中孵育， 利于肺炎链球菌、嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的 生长。
血液、骨髓、脑脊液标本
❖ 然后涂片革兰染色镜检，把镜检结果及时电话 通知临床医生，并填写初检结果临床通知单。
❖ 常规培养5天，认为阴性者，报告无菌生长， 正常人的血液、骨髓是无菌的，标本中检出 细菌，都应视作病原菌 ﹝需排除污染﹞
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血液、骨髓、脑脊液标本
脑脊液： ❖ 涂片查抗酸杆菌：脑脊液
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尿液、粪便标本
粪便 ❖ 涂片检查：当检查霍乱弧菌以及菌群失调优势
菌时需作直接涂片检查。取新鲜标本涂片革兰 染色镜检：
①有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌； ②各种菌在涂片中所占相对比例、推断主 要优势菌； ③有革兰阳性芽生孢子和假菌丝即报告检 出酵母样菌。真菌也可湿片检查。
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尿液、粪便标本
❖ 一般培养：直接挑取标本中脓血部分接种SS平 板和血平板严格按照三区划线，保证有单个菌 落的分离，置35℃培养。
（正常人的眼内，中耳及鼻窦内是无菌的。）
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脓液标本的处理
❖ 涂片检查：脓液标本在培养的同时均须涂片， 涂片的结果一方面为临床提供最初的诊治依据， 另一方面可作为分离培养的质量指标。
❖ 涂片直接做革兰染色，镜下可观察细菌和酵母 样菌。涂片做抗酸染色镜检查抗酸杆菌。
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脓液标本的处理
❖ 注意：对无菌部位的感染，从分泌、粪便标本
❖真菌培养：将标本接种两个TTC-沙氏平板及血 平板，置25℃-30℃和35℃孵育24-48h。真菌性 腹泻多继发于抗生素治疗后，常见有白色假丝 酵母菌。
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眼耳鼻喉拭子
❖ 根据这些部位感染细菌的特点，须用血平板和 巧克力平板作分离培养，必要时加选麦康凯， 需分区划线。巧克力平板在CO2 环境中孵育， 利于肺炎链球菌、嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的 生长。
临床微生物检验的标准化ppt课件
Interpretation / Reporting 结果解释/报告 Use of Laboratory Data 实验室数据使用
Equipment Maintenance & Calibration设备的维 护和校准 Internal Q.C.室内质控
Proficiency Testing 能力验证
5.1 人员
• 5.1.11 应制定员工能力评审的内容和方法 ，每年评审员工的工作能力；
– 对新进员工在最初2个月内应至少进行2次能 力评审（间隔为30天），保存评审记录。
– 当职责变更时，或离岗6个月以上再上岗时， 或政策、程序、技术有变更时，应对员工进 行再培训和再评审。
– 没有通过评审的人员需经再培训和再评审， 合格后才可继续上岗，并记录。
1:4000系列稀释 – 1ul环取10环 EBD原液至10ml蒸馏水, 吸光
度应与1:1000稀释液相符(10ul环-10 EBD100ml DH2O) – 重复4次,平均误差须≦20%.
5.1 人员
5.1.1 有颜色视觉障碍的人员不应从事涉及到辨色的微 生物学检验。
5.1.4 临床微生物学实验室（以下简称“实验室”）负责 人至少应具有以下资格：中级技术职称，医学、医 学检验专业背景，或相关专业背景经过医学检验培 训，3年临床微生物工作经验。 认可的授权签字人应至少具有中级以上专业技术职 称，从事申请认可授权签字领域专业技术工作至少3 年。
• Seeded BC studies • Parallel BC studies
Verification of unmodified FDA-Cleared Tests
• Seeded BC studies
– 至少20株代表菌株 – 使用临床病人分离株
Equipment Maintenance & Calibration设备的维 护和校准 Internal Q.C.室内质控
Proficiency Testing 能力验证
5.1 人员
• 5.1.11 应制定员工能力评审的内容和方法 ，每年评审员工的工作能力；
– 对新进员工在最初2个月内应至少进行2次能 力评审（间隔为30天），保存评审记录。
– 当职责变更时，或离岗6个月以上再上岗时， 或政策、程序、技术有变更时，应对员工进 行再培训和再评审。
– 没有通过评审的人员需经再培训和再评审， 合格后才可继续上岗，并记录。
1:4000系列稀释 – 1ul环取10环 EBD原液至10ml蒸馏水, 吸光
度应与1:1000稀释液相符(10ul环-10 EBD100ml DH2O) – 重复4次,平均误差须≦20%.
5.1 人员
5.1.1 有颜色视觉障碍的人员不应从事涉及到辨色的微 生物学检验。
5.1.4 临床微生物学实验室（以下简称“实验室”）负责 人至少应具有以下资格：中级技术职称，医学、医 学检验专业背景，或相关专业背景经过医学检验培 训，3年临床微生物工作经验。 认可的授权签字人应至少具有中级以上专业技术职 称，从事申请认可授权签字领域专业技术工作至少3 年。
• Seeded BC studies • Parallel BC studies
Verification of unmodified FDA-Cleared Tests
• Seeded BC studies
– 至少20株代表菌株 – 使用临床病人分离株
微生物限度方法学验证PPT课件
菌液制备 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
无菌微生物限度检查及方法验证.ppt
• 非必要品禁止带入实验室，必要资料和记录应消毒后进入并应远离操作 台。
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
05版微生物限度检查法-PPT课件
细菌、霉菌及酵母菌计数
增订 计数方法的验证
对药品进行微生物限度检查法时，首先应进行检 测方法的验证。如细菌、霉菌及酵母菌计数方法的 验证，以确认该计数方法是否科学、准确、客观。 若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检 验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试 液的制备，细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法 及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行 验证。
●供试液的制备 用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制 备供试液或选用适宜的乳化剂、分散剂、中和剂制 备供试液；其用量应验证，在该检验条件无抗菌作 用。供试液制备妥后不得超过1h就加入检验用培养 基。
7类供试品供试液的制备，其中增订：
非水溶性供试品
①供试品5g，司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山 梨酯80
验证方法
①试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养 基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时， 取供试液，过滤、冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中， 过滤后，取出滤膜接入增菌培养基中。
②阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制
菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、 大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄 球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴 性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。
在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母
菌或玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计 霉菌、酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基 中的菌数为计数结果报告。
菌数报告规则
细菌数30~300，霉菌数30~100。 ①当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以 该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数–供试品 对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数 ]×100%
微生物检验ppt课件
微生物检验ppt课件
目 录
• 微生物检验概述 • 微生物检验的基本原理与方法 • 微生物检验的样品采集与处理 • 微生物检验的常用技术与操作 • 微生物检验的质量控制与保证 • 微生物检验的挑战与发展趋势
01
微生物检验概述
微生物检验的定义与重要性
定义
微生物检验是对环境中的微生物进行定性、定量和鉴定的一种技术，通过特定 的方法和技术手段，对微生物的种类、数量、生理生化特性、遗传物质等进行 分析和研究。
。
04
微生物检验的常用技术与操作
显微镜技术
光学显微镜
01
利用可见光和光学透镜成像，可观察细菌、真菌等微生物的形
态和结构。
电子显微镜
02
利用电子束成像，能够观察更细微的结构，如病毒、细菌的超
微结构等。
相差显微镜
03
利用光的相位差原理，可观察无色透明的微生物，如支原体、
衣原体等。
培养基制备技术
01
补体结合试验
利用补体参与抗原抗体反 应，形成复合物并激活补 体系统，用于检测微生物 抗原或抗体。
微生物的分子生物学检测方法
PCR技术
应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩 增微生物特异性基因片段，实现快速 、灵敏的微生物检测。
生物信息学分析
应用生物信息学方法对微生物基因组 数据进行挖掘和分析，揭示微生物种 类、进化关系等信息。
脱羧酶试验等。
酶活性检测
检测微生物产生的特定酶活性 ，如过氧化氢酶试验、氧化酶
试验等。
抗生素敏感性试验
检测微生物对抗生素的敏感性 ，以指导临床用药。
微生物的血清学试验
凝集试验
应用特异性抗体与微生物 抗原结合，形成可见的凝 集现象，用于鉴定微生物 种类。
目 录
• 微生物检验概述 • 微生物检验的基本原理与方法 • 微生物检验的样品采集与处理 • 微生物检验的常用技术与操作 • 微生物检验的质量控制与保证 • 微生物检验的挑战与发展趋势
01
微生物检验概述
微生物检验的定义与重要性
定义
微生物检验是对环境中的微生物进行定性、定量和鉴定的一种技术，通过特定 的方法和技术手段，对微生物的种类、数量、生理生化特性、遗传物质等进行 分析和研究。
。
04
微生物检验的常用技术与操作
显微镜技术
光学显微镜
01
利用可见光和光学透镜成像，可观察细菌、真菌等微生物的形
态和结构。
电子显微镜
02
利用电子束成像，能够观察更细微的结构，如病毒、细菌的超
微结构等。
相差显微镜
03
利用光的相位差原理，可观察无色透明的微生物，如支原体、
衣原体等。
培养基制备技术
01
补体结合试验
利用补体参与抗原抗体反 应，形成复合物并激活补 体系统，用于检测微生物 抗原或抗体。
微生物的分子生物学检测方法
PCR技术
应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩 增微生物特异性基因片段，实现快速 、灵敏的微生物检测。
生物信息学分析
应用生物信息学方法对微生物基因组 数据进行挖掘和分析，揭示微生物种 类、进化关系等信息。
脱羧酶试验等。
酶活性检测
检测微生物产生的特定酶活性 ，如过氧化氢酶试验、氧化酶
试验等。
抗生素敏感性试验
检测微生物对抗生素的敏感性 ，以指导临床用药。
微生物的血清学试验
凝集试验
应用特异性抗体与微生物 抗原结合，形成可见的凝 集现象，用于鉴定微生物 种类。
食品微生物检验的指标PPT课件
食品微生物检验的流程一般包括样品采集、预处理、检测、计数和鉴定等步骤。样品采集应具有代表 性，预处理则包括稀释、过滤等步骤，以去除干扰物质。检测方法的选择应根据微生物种类和检测目 的来确定。最后，根据检测结果进行计数和鉴定，得出结论。
02
食品微生物检验的指标
细菌总数
细菌总数
指在一定条件下，每克或每毫升 食品中生长的细菌菌落的总数， 是评价食品卫生质量的重要指标
质量保证与质量控制
加强质量保证和质量控制，确保检验结果的 准确性和可靠性。
04
食品微生物检验的应用和发展
食品微生物检验的应用领域
食品生产过程控制
01
通过微生物检验，监控食品生产过程中的卫生状况，确保食品
不受微生物污染。
食品安全评估
02
对食品进行微生物检验，评估食品的安全性，确保食品符合国
家食品安全标准。
之一。
检测方法
通常采用倾注培养法或表面涂布法 进行检测，需要经过培养、计数和 报告三个步骤。
参考范围
不同食品的细菌总数参考范围不同， 一般而言，生乳的细菌总数应不超 过100000cfu/mL，饮用水的细菌 总数应不超过100cfu/mL。
大肠菌群
大肠菌群
指一群在37℃培养24小时后能发酵乳 糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。
实验室环境控制
实验室应保持清洁和良 好的微生物学状态，定
期进行环境监测。
人员安全与培训
检验人员应接受相关培 训，了解微生物安全知 识，遵守实验室安全规
定。
检验过程中的注意事项
01
02
03
04
无菌操作
在检验过程中，应遵循无菌操 作原则，避免交叉污染。
02
食品微生物检验的指标
细菌总数
细菌总数
指在一定条件下，每克或每毫升 食品中生长的细菌菌落的总数， 是评价食品卫生质量的重要指标
质量保证与质量控制
加强质量保证和质量控制，确保检验结果的 准确性和可靠性。
04
食品微生物检验的应用和发展
食品微生物检验的应用领域
食品生产过程控制
01
通过微生物检验，监控食品生产过程中的卫生状况，确保食品
不受微生物污染。
食品安全评估
02
对食品进行微生物检验，评估食品的安全性，确保食品符合国
家食品安全标准。
之一。
检测方法
通常采用倾注培养法或表面涂布法 进行检测，需要经过培养、计数和 报告三个步骤。
参考范围
不同食品的细菌总数参考范围不同， 一般而言，生乳的细菌总数应不超 过100000cfu/mL，饮用水的细菌 总数应不超过100cfu/mL。
大肠菌群
大肠菌群
指一群在37℃培养24小时后能发酵乳 糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。
实验室环境控制
实验室应保持清洁和良 好的微生物学状态，定
期进行环境监测。
人员安全与培训
检验人员应接受相关培 训，了解微生物安全知 识，遵守实验室安全规
定。
检验过程中的注意事项
01
02
03
04
无菌操作
在检验过程中，应遵循无菌操 作原则，避免交叉污染。
微生物检验技术培训PPT课件
• 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜， 每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得 超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
21
第21页/共80页
二、无菌检查
2. 直接接种法
• 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试 品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培 养基和胰酪大豆胨液体培养基中。
• 除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支 /瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基 和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。
• 除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供 试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐 流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养 基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量 和高度同方法适用性试验。
24h~48
【10版：改良马丁（琼脂）培养 20~25℃
基】
h 【10版：
上制黑述成曲培每霉养1m物l含用菌pH数7.小0于沙或版无1氏：用菌00葡改适氯c萄良宜化fu糖马方钠的琼丁法-菌蛋脂琼制悬白斜脂成液胨面斜孢。缓培面子冲养 培悬液基养液或基【0】1.90%无2℃菌3 】-氯2化8钠5溶d~液7d
23
第23页/共80页
二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结果判断
• 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生 长。否则，试验无效。
• 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生 长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管 显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定， 除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物 非供试品所含。
20
浮游菌 cfu/m3
沉降菌 （）
21
第21页/共80页
二、无菌检查
2. 直接接种法
• 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试 品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培 养基和胰酪大豆胨液体培养基中。
• 除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支 /瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基 和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。
• 除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供 试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐 流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养 基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量 和高度同方法适用性试验。
24h~48
【10版：改良马丁（琼脂）培养 20~25℃
基】
h 【10版：
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23
第23页/共80页
二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结果判断
• 阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生 长。否则，试验无效。
• 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生 长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管 显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定， 除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物 非供试品所含。
20
浮游菌 cfu/m3
沉降菌 （）
微生物限度检验PPT课件
- 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及 对微生物的生长和存活无影响。
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
13
稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
6
验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
7
验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件
- 供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。
- 供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。 - 供试液的体积：100ml。
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稀释剂（ 中国药典2005版）
（1） 氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 （2） 无菌磷酸盐缓冲液 （3） 无菌磷酸盐缓冲液
中国药典2005版
菌株名称
CMCC编号
大肠埃希氏菌(E. coli)
CMCC(B)44102
金黄色葡萄球菌(Sta. aureus) CMCC(B)26003
枯草芽孢杆菌（Bac. subtilis）
CMCC(B)63501
白色念珠菌(Can. albicans) 黑曲霉菌(Asp. niger)
CMCC(F)98001 CMCC(F)98003
一次检出为准
第一次结果超过规定标准，复 试两次，三次结果平均报告
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
不符合标准规定，取大于25g的 样品复试
一次检出为准
测定结果在规定的限度标准5 倍以内均为合格
6
验证目的
- 在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样 品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采 用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检 出。
过滤
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
菌种组：
5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
过滤
空白样品组：
过滤
计数A 计数B （阴性对照） 计数C （阳性对照） 计数D
- 充分验证样品（药品）本身对微生物生长的影响。
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验证目的
确认一种检验方法。 验证实验 检验条件
微生物检查方法验证PPT文档共35页
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
微生物检查方法验证
•
6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
•
7、心急吃不了热汤圆。
•
8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
•
9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
•
10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
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（八）检定菌应当按照规定的条件贮存，贮存的方式和时 间不应当对检定菌的 生长特性有不利影响。
二、验证目的
为了使微生物学检验方法的结果准确可靠，需要 对每个品种的具体检验方法进行验证。
三、验证概述
微生物学检验方法包括：
1.微生物限度检查
总菌落数检查（回收率）
2.无菌检查
控制菌检查（专属性）
降低抑菌剂的浓度以消除抑菌性。 三、薄膜过滤法
抑菌性产品通过滤膜时，微生物被截留在膜上，检品被过滤掉。 ——微生物检查法准确与否的核心是对抑菌性的有效消除
四、总菌落数检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域
培养基种类：
细菌计数
营养琼脂培养基的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。 试验组的菌数回收率均不低于70%
试验组菌数回收率
试验组平均菌落数 - 供试品对照组的平均菌 菌液组平均菌落数
落数
五、控制菌检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域 培养基和培养基试验： 无菌性 促生长能力——在最短时间内观察到明显生长 抑制能力——在培养的最长时间内不能观察到微生物的生长 指示能力——在规定的时间内必须和以前检验过并已接受的培养基在
微生物检验方法验证
重点议题
一、法规要求 二、验证目的 三、检验概述 四、总菌落数检查方法验证 五、控制菌检查方法验证 六、无菌检查方法验证
一、法规要求
第二百二十六条 试剂、试液、培养基和检定菌的管理应当至少符合以下 要求：
（一） 试剂和培养基应当从可靠的供应商处采购，必要时应当对供应 商进行评估；
3.防腐剂抑菌效力测定
三、验证概述
微生物学检验的影响因素：
1.药品本身的抑菌性 2.药品中防腐剂的抑菌性 3.培养基的促菌生长能力 4.培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧） 5.过滤系统的材质
三、验证概述
消除抑菌性的方法: 一、化学中和法
用化学中和剂中和抑菌剂，消除抑菌作用。 二、稀释法
外观和指示反应都具备可比性。
五、控制菌检查方法验证
方法验证： 按照各品种项下规定检查的控制菌选择验证菌株。 规定量供试液+10~100cfu试验菌+增菌培养基 合格标准：检出试验菌
六、无菌检查方法验证
环境条件：B级下的局部A级的单向流空气区域 培养基： 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基
四、总菌落数检查方法验证
方法验证——对细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：
——进行3次独立的平行试验，分别计算各组回收率。
（1）试验组
最低稀释级供试液1ml +
试验菌50~100cfu
平皿法计数 2个琼脂培养基平皿
薄膜过滤法计数
取规定量的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中 加试验菌50~100cfu，过滤。
一、法规要求
第二百二十六条 （续）
（五）配制的培养基应当进行适用性检查，并有相关记录。 应当有培养基使用记录；
（六）应当有检验所需的各种检定菌，并建立检定菌保存、 传代、使用、销毁的操作规程和相应记录；
（七） 检定菌应当有适当的标识，内容至少包括菌种名称、 编号、代次、传代 日期、传代操作人；
（二） 应当有接收试剂、试液、培养基的记录，必要时，应当在试剂、 试液、 培养基的容器上标注接收日期；
（三）应当按照相关规定或使用说明配制、贮存和使用试剂、试液和 培养基。 特殊情况下，在接收或使用前，还应当对试剂进行鉴别或其 他检验；
（四）试液和已配制的培养基应当标注配制批号、配制日期和配制人 员姓名，并有配制（包括灭菌）记录。不稳定的试剂、试液和培养基 应当标注有效期及特殊贮存条件。标准液、滴定液还应当标注最后一 次标化的日期和校正因子，并有标化记录；
酵母菌计数
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基
四、总菌落数检查方法验证
培养基适用性检查 被检培养基
培养结果
试验菌 50~100cfu
50~100cfu
试验菌
.. .. ..
适
..
宜
.. ..
培
养
条
.. ..
件
..
.. .. ..
被检培养基上的菌落平均数不得小于对照培养基上的菌落平均数的70% 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致
四、总菌落数检查方法验证
（2）菌液组 直接接种试验菌
（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
（4）稀释剂对照组 用相应的稀释剂代替供试品，加入试验菌。
（若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时， 需增加稀释剂对照组。）
四、总菌落数检查方法验证
合格标准： 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率（稀释剂对照
二、验证目的
为了使微生物学检验方法的结果准确可靠，需要 对每个品种的具体检验方法进行验证。
三、验证概述
微生物学检验方法包括：
1.微生物限度检查
总菌落数检查（回收率）
2.无菌检查
控制菌检查（专属性）
降低抑菌剂的浓度以消除抑菌性。 三、薄膜过滤法
抑菌性产品通过滤膜时，微生物被截留在膜上，检品被过滤掉。 ——微生物检查法准确与否的核心是对抑菌性的有效消除
四、总菌落数检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域
培养基种类：
细菌计数
营养琼脂培养基的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。 试验组的菌数回收率均不低于70%
试验组菌数回收率
试验组平均菌落数 - 供试品对照组的平均菌 菌液组平均菌落数
落数
五、控制菌检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域 培养基和培养基试验： 无菌性 促生长能力——在最短时间内观察到明显生长 抑制能力——在培养的最长时间内不能观察到微生物的生长 指示能力——在规定的时间内必须和以前检验过并已接受的培养基在
微生物检验方法验证
重点议题
一、法规要求 二、验证目的 三、检验概述 四、总菌落数检查方法验证 五、控制菌检查方法验证 六、无菌检查方法验证
一、法规要求
第二百二十六条 试剂、试液、培养基和检定菌的管理应当至少符合以下 要求：
（一） 试剂和培养基应当从可靠的供应商处采购，必要时应当对供应 商进行评估；
3.防腐剂抑菌效力测定
三、验证概述
微生物学检验的影响因素：
1.药品本身的抑菌性 2.药品中防腐剂的抑菌性 3.培养基的促菌生长能力 4.培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧） 5.过滤系统的材质
三、验证概述
消除抑菌性的方法: 一、化学中和法
用化学中和剂中和抑菌剂，消除抑菌作用。 二、稀释法
外观和指示反应都具备可比性。
五、控制菌检查方法验证
方法验证： 按照各品种项下规定检查的控制菌选择验证菌株。 规定量供试液+10~100cfu试验菌+增菌培养基 合格标准：检出试验菌
六、无菌检查方法验证
环境条件：B级下的局部A级的单向流空气区域 培养基： 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基
四、总菌落数检查方法验证
方法验证——对细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：
——进行3次独立的平行试验，分别计算各组回收率。
（1）试验组
最低稀释级供试液1ml +
试验菌50~100cfu
平皿法计数 2个琼脂培养基平皿
薄膜过滤法计数
取规定量的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中 加试验菌50~100cfu，过滤。
一、法规要求
第二百二十六条 （续）
（五）配制的培养基应当进行适用性检查，并有相关记录。 应当有培养基使用记录；
（六）应当有检验所需的各种检定菌，并建立检定菌保存、 传代、使用、销毁的操作规程和相应记录；
（七） 检定菌应当有适当的标识，内容至少包括菌种名称、 编号、代次、传代 日期、传代操作人；
（二） 应当有接收试剂、试液、培养基的记录，必要时，应当在试剂、 试液、 培养基的容器上标注接收日期；
（三）应当按照相关规定或使用说明配制、贮存和使用试剂、试液和 培养基。 特殊情况下，在接收或使用前，还应当对试剂进行鉴别或其 他检验；
（四）试液和已配制的培养基应当标注配制批号、配制日期和配制人 员姓名，并有配制（包括灭菌）记录。不稳定的试剂、试液和培养基 应当标注有效期及特殊贮存条件。标准液、滴定液还应当标注最后一 次标化的日期和校正因子，并有标化记录；
酵母菌计数
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基
四、总菌落数检查方法验证
培养基适用性检查 被检培养基
培养结果
试验菌 50~100cfu
50~100cfu
试验菌
.. .. ..
适
..
宜
.. ..
培
养
条
.. ..
件
..
.. .. ..
被检培养基上的菌落平均数不得小于对照培养基上的菌落平均数的70% 菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致
四、总菌落数检查方法验证
（2）菌液组 直接接种试验菌
（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
（4）稀释剂对照组 用相应的稀释剂代替供试品，加入试验菌。
（若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时， 需增加稀释剂对照组。）
四、总菌落数检查方法验证
合格标准： 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率（稀释剂对照