实例图解简并引物设计

（5）实验验证
PCR 扩增采用的 50μ L 反应体系为：10 ×TransTaq HiFi Buffer II 5 μ L，2.5nM dNTPs 4 μ L， 5′端引物（10 μ mol/L）2 μ L，3′端引物（10 μ mol/L）2 μ L，ddH2O 34.75 μ L，TransTaq HiFi Polymerase（5 U/μ L）0.25 μ L，cDNA 2 μ L。 PCR 扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s， 55℃复性30s，72℃延伸1min，共30 个循环，最后一轮 循环后72℃延伸10min。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电 泳检测PCR扩增产物，如下图所示：
（3）BLAST 比对回检
点击“Blast”可以对引物进行BLAST 比对检测，结果显 示，都是PVY CP 基因相关的序列，表明所设计的引物特 异性良好。
（4）两引物互补性检查
• 同 样 方 式 ， 得 到 5' 端 序 列 ： GSAAAYGAYACAATYGATGC ，根据引物设计原则， 需要检测两引物之间是否存在序列互补。 • 打 开 DNAMAN ， 依 次 在 “ Primer ” - “ Load primer ”，粘贴任意一端引物序列，如： 5' 端序列 GSAAAYGAYACAATYGATGC，确定。
M.DNA 分子量标准（100bp）；泳道1-5：PVY 的不同 株系（C、O、N、NTN、N-Wi）；泳道6-7：阴性对照 （健康马铃薯）和空白对照；泳道8-12：PVX、PVM、 PVA、PVS、PLRV
九、延伸阅读
• [1] 吴祖建, 高芳銮, 沈建国. 生物信息学分析实践. 科学 出版社, 2010: 30-60. • [2] 高芳銮, 沈建国, 史凤阳, 方治国, 谢联辉, 詹家绥. 我 国马铃薯Y 病毒的检测及CP 基因的分子变异. 中国农 业科学, 2013, 46: 3125-3133. • [3] 史凤阳, 高芳銮, 常飞, 詹家绥. 马铃薯Y 病毒简并引 物的开发与检测应用. 2013 年中国马铃薯大会会议论 文, 2013, pp: 289.
代码 简 并 碱 基 代 码
碱基
代码
碱基
R
K M B
A, G
G, T A, C G, C, T
Y
S W V
C, T
G, C A, T A, G, C
D
N
A, G, T
A, G, C, T
H
A, C, T
3. 质量评估
• （1）参数评估 将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内， 按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长 度、GC 含量、Tm 值等信息。 • （2）自身互补性（Check Self-Complementarity）
PS ： 是 否 位 于 密 码 子的第3 位，可以通 过 “ Tranlated Protein Sequences ” “ DNA sequences ” 切换查看，如右图， CP 基因的末端3 个 碱基是终止密码子 所在的位置，A 是 第三位密码子。
（2）生成 Seq Logo
选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序列，保留CP 基因3‘端序 列，同样导出为Fasta文件，将序列粘贴入Web Logo3的文本框内或 直接上传序列文件，设置相关参数后点击“Create”生成 Seq Logo 格式的文件CP-3.fas。 参数设置： “Output format”（输出格式）推荐用“PDF”，“Color scheme”（颜色方案）推荐用“Classic (NA)”，设置完毕，点击右下 角“Create Logo“即可得下图的Seq Logo 格式文件。
通 过 Web Logo 生 成 的 多 重 比 对 图 片 可 以 很 直 观 得 到 3' 端 序 列 为 CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG ，查询简并碱基代码表（下图），可 知 C/T/G=B ， G/A=R ， 简 并 度 =3 ×2 =6 ， 整 理 后 3′ 端 序 列 为 CTTGGAGTBAARAACATGTG ， 故 而 需 要 合 成 的 3′ 端 引 物 序 列 ： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与原序列是反向互补关系）。
裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment”导 出CP 基因序列（推荐fasta 格式）。
2. 引物设计
推荐先设计 3′端引物， 至于原因，上面的【特 别注意】中已提到，这 里不再赘述。 （1）选择引物序列 综合考虑引物设计原则 及特别注意，在CP 基因 3' 端位置选取一段合适 的序列（ 784-803bp ）， 804bp 位置为A 且是第 三个密码子位置，所以 弃去末位的 A 碱基。
八、详细图解
1. 序列准备：
• （1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； • （2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对； • （3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：
先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角 "Site" 处直接输入 CP 基因上游分界点位置（8391）后回车。接着点击“Speicaes/Abbrv” 和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1” 那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。
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三、基本原则
设计一对好的引物，归结起来就是 5′端引物、3′端引物之间 以及两者与模板的关系处理得恰到好处：
1. 两引物的序列要与模板的序列紧密互补；
2. 两引物不能在模板的非目的位点发生错配； 3. 两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。 四、延伸原则 1. 引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否 则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应； 2. GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的 GC 含量相差不能过于悬殊； 3. 碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的 GC，GC 富集 区容易导致错误引发反应。
实例图解简并引物设计
一、序言
设计一对合适的引物是 PCR 扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成，却 身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点， 手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下 面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y 病毒CP 基因简并引 物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域 及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、同学批评指正。 二、相关工具 1. MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑； 2. DNAMAN8-检测两引物的互补性； 3. Oligo Calc-评估引物的属性； 4. Web Logo 3-直观显示简并碱基。
五、特别注意
5′端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大； 引物的延伸是从3′端开始的，所以 3′端引物是影响特异性扩增的最 关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考 虑以下几个内容： 1. 不要终止于密码子的第 3 位；
2. 末位碱基避免使用碱基 A； 3. 避免出现3 个以上连续的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG；
接着，在“Primer”-“Two primers Complementarity”“Second Primer From Input”，粘贴入另一端序列，这里 为3'端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG，如下图：
结果显示，两引物间仅有3 个碱基互补，且自由能仅为 1.8 Kcal/mol。
点击“Check Self-Complementarity”，检测引物自身 互补性，主要查看“ Potential hairpin formation ”、 “ 3’ Complementarity ” 、 “ All potential selfannealing sites are marked in red (allowing 1 mismatch)”下方显示内容，如果三项均为“none”，则说 明引物自身不会形成发夹结构且引物自身不会互补，引 物没问题！
4. Δ G 的绝对值不可超过 9；
5. 与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8 个互补碱基 源； 6. 不能进行任何修饰。
六、设计流程
七、示例背景
马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、 烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广 泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特 异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。 但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生， 单一的特异性引物无法适应 PVY 不同株系的检测需求， 需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。