实例图解简并引物设计
简并引物的设计范文
简并引物的设计范文简并引物是指通过引入具有多种功能的化合物，使得一个化学过程中需要的多个反应步骤可以通过一步完成。
这种设计可以大大简化合成过程，提高反应的选择性和产率。
以下是两个常见的简并引物设计的例子。
首先是用于不对称催化的简并引物设计。
不对称催化是一种能够高效合成手性化合物的方法。
传统上，需要使用两种不同的手性配体进行催化反应，以实现对手性中心的控制。
然而，通过简并引物的设计，可以将两个不同的手性配体合并为一个引物，从而同时实现两种不同的立体控制。
这种设计的优点是可以减少合成步骤和废弃物的产生，并提高产率和选择性。
例如，1980年代，以散体丁二酮（DIBAL-H）为还原剂，用于从卡尔卡宾和亚胺分子中还原羧酸酯时，通常还需要存在配位剂的金属化合物。
然而，1995年，K. N. Houk等人设计了一种简并引物，可以将金属配位剂和还原剂的功能合并到一个分子中。
这种简并引物被称为IBX（无水碘酸）。
IBX可以同时催化还原和脱水作用，使得还原羧酸酯的反应可以一步完成。
另一个常见的简并引物设计是用于交叉偶联反应的引物设计。
交叉偶联反应是一种能够在简单的起始化合物基础上构建复杂有机分子的方法。
在传统的交叉偶联反应中，需要多个步骤来引入不同的官能团。
然而，通过简并引物的设计，可以将多个不同的官能团合并到一个引物中，并在一个反应步骤中引入。
例如，2002年，N. Katoch等人设计了一种具有多种官能团的引物来实现交叉偶联反应。
这种引物包含一个包含酰胺和酯官能团的混合官能团的分子。
这种引物可以通过选择性激活不同的官能团，实现对不同的化学反应的控制。
通过这种引物，可以实现一步合成多种复杂的有机分子。
总之，简并引物的设计可以大大简化化学合成过程，并提高反应的选择性和产率。
通过合理设计引物的结构，可以将多个不同的反应步骤合并为一个步骤，从而提高合成效率。
如何根据要求自己设计PCR引物
如何根据要求自己设计PCR引物1PCR引物设计课堂笔记○PCR这个名词大家都不陌生，但实际操作时我们常说的引物设计到底是怎么回事呢？今天我就来给大家用实例演示一下哈。
首先，我们要知道引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物设计是PCR的关键，附上PCR的基本流程图：○引物设计的原则：1.引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
2.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。
退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物的3′端：引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰；引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高；引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败6.引物的5′端：引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
下面以实例操作演示一下加酶切位点时如何自己设计引物：2用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1○简单点说，就是现在我们要把Plasmid 2中GFP基因片段添加到Plasmid 1中的NR1基因片段上，但是Plasmid 2中GFP基因片段本身并没有BamHⅠ这个酶切位点，也就说我们要在引物设计中人为地把BamHⅠ这个酶切位点的序列添加给GFP基因片段，这样PCR后得到的GFP基因片段就可以通过BamHⅠ这个酶切位点进入到Plasmid 1中，然后绿色荧光蛋白(GFP)就可以来标记蛋白NR1，达到我们之后实验中来观察蛋白NR1的目的，示意图见下。
实例图解简并引物设计 共25页
碱M
基B
代 码
D N
碱基 代码 A, G Y G, T S A, C W G, C, T V A, G, T H A, G, C, T
碱基 C, T G, C A, T A, G, C A, C, T
3. 质量评估
•（1）参数评估
将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内， 按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长 度、GC 含量、Tm 值等信息。
马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、
烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广 泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特 异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。 但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生， 单一的特异性引物无法适应PVY 不同株系的检测需求， 需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。
八、详细图解
1. 序列准备： •（1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； •（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对； •（3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：
• 先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输 入 CP 基 因 上 游 分 界 点 位 置 （ 8391 ） 后 回 车 。 接 着 点 击 “Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift” 不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除 冗余序列。
• PS ： 是 否 位 于 密
码子的第3 位，可
以
通
过
“ Tranlated
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤详细步骤如下：步骤一：了解引物设计的基本原理引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。
引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。
因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。
步骤二：确定PCR反应的目标序列在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。
这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。
确定目标序列后，我们可以继续设计引物。
步骤三：确定引物的一些基本参数在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。
这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。
引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。
过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。
GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。
在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。
Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。
Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。
避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性以及避免引物形成二聚体。
引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体，从而降低PCR反应的效率和特异性。
步骤四：选择合适的引物设计工具目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。
这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择合适的引物。
此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。
步骤五：进行引物特异性分析设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标序列而不扩增其他非特异性产物。
这可以通过BLAST或其他相似性工具来完成。
特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。
简并引物设计方法与技巧
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二级结构
引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多 碱基互补
发夹结构
– 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则 将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个 碱基与模板DNA均需严格配对，不能进 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密 码子的简并性，引物3’端最后一个碱基 最好不与密码子第三个碱基配对。
引物设计原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
引物长度
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引 物，但最多不超过50个核苷酸。
– 生物软件网下载 – 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generaer 5.0
引物设计
– 一般引物设计 – 5’带酶切位点引物设计 – 巢式PCR引物设计 – 多重PCR引物设计
碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性
简并引物设计过程及原则
简并引物设计过程及原则简并引物常用于从已知蛋白到相关核酸分子的研究及用于一组引物扩增一类分子。
简并引物设计过程（1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。
首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。
随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。
（2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W/X, 也可在线分析。
所有序列的共有部分将会显示出来。
“*”表示保守，“：”表示次保守。
（3）确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。
最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
（4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer 5.0 支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G,Y=C/T,M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/C/T, B=C/G/T,V=A/C/G, D=A/G/T, N=A/C/G/T, 该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt 区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。
引物设计实例分析(多图)
引物设计基本原则引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值（melting temperature）G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）阅读框1. 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对。
3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2度。
如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。
Tm=2（A+T）+4（C+G）4. 引物的GC含量有效引物中（G+C）的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物自身引物间3‘端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白NR1引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变第一步：扩增GFP基本序列第二步：GC比值；Tm值第三步：酶切位点第四步：阅读框第五步保护序列Primer1: 5' GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5' GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCA TGCC记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。
愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。
后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。
PCR的第一步就是引物设计了。
引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。
这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。
手把手教你做PCR引物设计来自小木虫
PCR引物设计的黄金法例1.引物最幸亏模板 cDNA的守旧区内设计。
DNA序列的守旧区是经过物种间相像序列的比较确立的。
在NCBI上搜寻不一样物种的同一基因，经过序列剖析软件（比方DNAman）比对（Alignment ），各基因同样的序列就是该基因的守旧区。
2.引物长度一般在 15~30 碱基之间。
引物长度（ primer length ）常用的是 18-27 bp，但不该大于 38，由于过长会致使其延长温度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反响。
3.引物 GC含量在 40%~60%之间， Tm值最好靠近 72℃。
GC含量（ composition ）过高或过低都不利于引起反响。
上下游引物的 GC含量不可以相差太大。
此外，上下游引物的 Tm值（ melting temperature ）是寡核苷酸的解链温度，即在必定盐浓度条件下， 50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值 5~10℃。
若按公式 Tm= 4（G+C）+2（A+T）预计引物的Tm值，则有效引物的Tm为 55~80℃，其 Tm值最好靠近 72℃以使复性条件最正确。
4.引物 3′端要避开密码子的第 3 位。
如扩增编码地区，引物3′端不要停止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物 3′端不可以选择 A，最好选择 T。
引物 3′端错配时，不一样碱基引起效率存在着很大的差别，当末位的碱基为 A 时，即便在错配的状况下，也能有引起链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引起效率大大降低，G、C错配的引起效率介于A、T 之间，所以 3′端最好选择 T。
6.碱基要随机散布。
引物序列在模板内应当没有相像性较高，特别是3’端相像性较高的序列，不然简单致使错误引起（False priming ）。
降低引物与模板相像性的一种方法是，引物中四种碱基的散布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
《引物设计教程》课件
引物长度：通 常为15-30bp， 过长可能导致 非特异性扩增
引物GC含量： 尽量控制在 40-60%，避
免形成二级结 构
引 物 Tm 值 ： 应接近目标序 列 的 Tm 值 ， 以提高扩增效
率
引物3'端：避 免形成发卡结 构，以免影响
扩增效果
引物特异性： 确保引物与目 标序列具有高 度特异性，避 免非特异性扩
增效率和稳定性
引物3'端：避免3'端 出现连续3个或以上 的碱基，以降低错配
率
引物二级结构：使用 软件预测引物二级结 构，避免形成发卡结 构，提高扩增效率
引物特异性：通过 BLAST比对，确保引 物特异性，避免非特
异性扩增
引物浓度：优化引物 浓度，以提高扩增效
率和稳定性
引物纯度：确保引物 纯度，避免污染和降 解，提高扩增效率和
引物GC含量：尽量保持 50%左右，避免过高或 过低
引 物 Tm 值 ： 确 保 引 物 Tm 值在55-65℃之间，以提 高扩增效率
引物特异性：确保引物与 目标序列具有高度特异性， 避免非特异性扩增
引物错配：避免引物内部 错配，以提高扩增效率和 准确性
引物设计软件：可使用 Primer3、OligoT等软 件辅助设计引物
引物设计不当导 致扩增失败
引物设计不当导 致非特异性扩增
引物设计不当导 致扩增效率低
引物设计不当导 致扩增产物长度 不均一
引物设计软件：选择 合适的引物设计软件， 如Primer3、Primer-
BLAST等
引物长度：确保引物 长度在18-25bp之间， 以提高特异性和扩增
效率
引物GC含量：保持 引物GC含量在4060%之间，以提高扩
PCR和简并引物设计
PCR和简并引物设计PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，它可以通过体外复制DNA片段，从而能够快速、高效地扩增目标DNA序列。
PCR的成功扩增依赖于精确的引物设计，其中简并引物设计是其中一种常用的方法。
本文将对PCR和简并引物设计进行详细的介绍。
PCR的原理和步骤可以概括为三个主要步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，PCR反应体系中的DNA双链被加热，使其变性成单链。
接下来，在退火步骤中，引物与单链DNA互相结合，形成DNA引物-模板DNA 复合物。
最后，在延伸步骤中，通过DNA聚合酶的作用，从引物的3'端开始合成新的DNA链。
PCR反应可以通过反复进行这三个步骤来进行多轮扩增，从而快速地产生大量目标DNA片段。
引物在PCR反应中起着至关重要的作用，引物的设计需要满足以下几个要求。
首先，引物的序列应与目标DNA序列互补，并且引物之间没有序列重复。
其次，引物的长度应适当，通常为18-30个碱基对。
引物的长度过长或过短都会影响扩增效率。
最后，引物的GC含量应在40-60%之间，这样可以提高引物与模板DNA的互补性。
相对于常规引物，简并引物设计是一种更加灵活和高效的方法。
简并引物设计的基本思想是在引物的特定位置上引入简并碱基（简并位点）。
简并碱基是可以用多种碱基取代的碱基，它可以与多种目标序列互补，从而提高引物与目标序列的互补性。
简并引物的设计通常需要考虑以下几个因素。
首先，需要确定哪些位置引入简并位点。
一般来说，简并位点通常选择在引物的3'端或其周围，因为3'端是引物与模板DNA结合的起始点，而简并位点可以提高引物的互补性。
其次，需要确定哪些碱基可以在简并位点上使用。
简并碱基通常是由两个或多个非互补的碱基组成，例如，简并位点可以是R（代表A或G）、Y（代表C或T）或M（代表A或C）等。
选择简并碱基时需要考虑目标DNA序列的GC含量和序列特点，以确保引物与目标序列的互补性。
PCR和简并引物设计
PCR和简并引物设计PCR(聚合酶链反应)是一种在分子生物学和遗传学研究中广泛使用的技术。
它通过扩增DNA特定区域的序列，从而产生大量的DNA复制体。
PCR的核心组成部分是引物（primers），它们是能与待扩增序列的起始点匹配的短DNA片段。
对于PCR的成功与否，引物的设计起到了关键作用。
本文将重点讨论PCR和简并引物设计的原理和方法。
PCR的步骤包括解旋（denaturing）、退火（annealing）和扩增（extension）。
在解旋阶段，样品中的DNA被加热至高温，使其双链结构解开，生成两根单链的DNA模板。
然后在退火阶段，温度被降低，使引物能够与模板上的特定序列进行互补配对，从而定位引物的位置。
最后，在扩增阶段，通过DNA聚合酶的作用，引物延伸成为新的DNA链，产生大量的特定序列。
引物的设计是PCR的关键步骤之一、它们需要满足以下几个条件：合适的长度、特异性、错配最少、避免形成二聚体或自身扩增以及合适的Tm（退火温度）。
首先，引物应该在15-30个碱基长的范围内，通常为18-25个碱基。
太短的引物可能与多个位点杂交，而太长的引物可能会降低特异性和扩增效率。
其次，引物应该是特异性的，即只与待扩增序列的特定区域互补配对。
为了确保特异性，通常需要使用序列比对软件来挑选最好的引物。
比对软件可以帮助我们检查引物是否与其他地方的基因组序列有互补性。
引物的错配最少，也就是引物与待扩增序列最好是完全互补配对。
因为即使有一个碱基错配，也可能导致错误的扩增产物的形成。
可以通过比对引物和目标序列的碱基来评估匹配的情况，以确定引物设计是否合理。
引物应该避免形成二聚体或自身扩增。
二聚体是指引物之间通过互补配对形成的二级结构。
如果引物形成二聚体，它们会被聚合酶识别为模板，导致错误的扩增产物生成。
自身扩增是指引物上的5'端和3'端通过互补配对形成环状结构。
自身扩增也会引起非特异性扩增。
为了避免这些情况的发生，引物的序列应该被合理设计。
PCR引物流程设计详解
PCR引物设计流程详解本文目的：复制出IL-4基因片段一、查找基因序列1、进入NCBI主页，下拉选框选择Nucleotide，在搜索栏输入要查找的目的基因，即IL-4，点击搜索2 、在搜索结果选择灵长类（Homo sapiens）2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列3、查看基因的相关信息外显子区域CDs区域4、点击FASTA格式，并将序列保存到文档二、使用primer premier 5.0设计引物1、建立新文件，将所得的序列复制进输入框内2、点击搜索按钮，搜索引物3、设置引物设计参数（因为在之前查找基因序列的时候获知，外显子区域分别为：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子，PCR产物长度通常为100-150bp，故设定上游引物位置为201-248，下游引物位置为249-425，产物长度为100-150bp）4、确认条件后，显示搜索结果4、双击选中得分最高的引物查看引物情况（上图为上游引物情况，下图为下游引物情况）5、将设计的上下游引物复制出来，保存到文档中三、使用oligo 6.0对设计的引物进行评价1、建立新文件，将从cnki上获得的cDNA复制进输入框，并点击accept接收2、接收后显示出该序列的相关信息3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物，每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收4、同理，录入下游引物5、分析上下游引物二聚体形成情况6、分析上下游引物发卡形成情况7、分析上下游引物GC%8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况9、分析PCR整体情况四、引物特异性检验（primer blast）1、进入NCBI主页，并选择blast2、选择primer blast3、在输入框内输入模板序列和上下游引物，并设定对比数据库，点击getprimer进行对比4、查看blast结果Blast 结果显示，尽管IL-4与其它基因有相似区，但是引物的3’端没有完全互补。
引物设计OLIGO图解
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。
它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。
Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。
“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。
但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
oligo的下载和安装我就不多说了，打开oligo相信也无需多讲。
打开oligo的页面如下：单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口：在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”：选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”：出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”：出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。
该频率高则可增加错误引发的可能性。
因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。
如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了：∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5'端和中间值比较高，而在3'端相对低（如图）。
Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5'到3'的下降形状也有利于引物引发聚合反应。
Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。
选取引物时，宜选用3'端Frq值相对较低的片段：再点击Search再点“Fo'r Primers and probes”或使用快捷键F3：出现以下窗口，点“OK”就OK了。
当然你也可以点击“Prameters”和“SearchRange”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度：出现Search Status窗口，点“OK”：出现Primer pairs窗口，#代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量：点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息：关掉“PCR窗口”和“primerPairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列：至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等：当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PS ： 是 否 位 于 密 码 子的第3 位，可以通 过 “ Tranlated Protein Sequences ” “ DNA sequences ” 切换查看，如右图， CP 基因的末端3 个 碱基是终止密码子 所在的位置，A 是 第三位密码子。
（2）生成 Seq Logo
选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序列，保留CP 基因3‘端序 列，同样导出为Fasta文件，将序列粘贴入Web Logo3的文本框内或 直接上传序列文件，设置相关参数后点击“Create”生成 Seq Logo 格式的文件CP-3.fas。 参数设置： “Output format”（输出格式）推荐用“PDF”，“Color scheme”（颜色方案）推荐用“Classic (NA)”，设置完毕，点击右下 角“Create Logo“即可得下图的Seq Logo 格式文件。
4. Δ G 的绝对值不可超过 9；
5. 与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8 个互补碱基 源； 6. 不能进行任何修饰。
六、设计流程
七、示例背景
马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、 烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广 泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特 异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。 但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生， 单一的特异性引物无法适应 PVY 不同株系的检测需求， 需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。
代码 简 并 碱 基 代 码
碱基
代码
碱基
R
K M B
A, G
G, T A, C G, C, T
Y
S W V
C, T
G, C A, T A, G, C
D
N
A, G, T
A, G, C, T
H
A, C, T
3. 质量评估
• （1）参数评估 将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内， 按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长 度、GC 含量、Tm 值等信息。 • （2）自身互补性（Check Self-Complementarity）
M.DNA 分子量标准（100bp）；泳道1-5：PVY 的不同 株系（C、O、N、NTN、N-Wi）；泳道6-7：阴性对照 （健康马铃薯）和空白对照；泳道8-12：PVX、PVM、 PVA、PVS、PLRV
九、延伸阅读
• [1] 吴祖建, 高芳銮, 沈建国. 生物信息学分析实践. 科学 出版社, 2010: 30-60. • [2] 高芳銮, 沈建国, 史凤阳, 方治国, 谢联辉, 詹家绥. 我 国马铃薯Y 病毒的检测及CP 基因的分子变异. 中国农 业科学, 2013, 46: 3125-3133. • [3] 史凤阳, 高芳銮, 常飞, 詹家绥. 马铃薯Y 病毒简并引 物的开发与检测应用. 2013 年中国马铃薯大会会议论 文, 2013, pp: 289.
三、基本原则
设计一对好的引物，归结起来就是 5′端引物、3′端引物之间 以及两者与模板的关系处理得恰到好处：
1. 两引物的序列要与模板的序列紧密互补；
2. 两引物不能在模板的非目的位点发生错配； 3. 两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。 四、延伸原则 1. 引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否 则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应； 2. GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的 GC 含量相差不能过于悬殊； 3. 碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的 GC，GC 富集 区容易导致错误引发反应。
通 过 Web Logo 生 成 的 多 重 比 对 图 片 可 以 很 直 观 得 到 3' 端 序 列 为 CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG ，查询简并碱基代码表（下图），可 知 C/T/G=B ， G/A=R ， 简 并 度 =3 ×2 =6 ， 整 理 后 3′ 端 序 列 为 CTTGGAGTBAARAACATGTG ， 故 而 需 要 合 成 的 3′ 端 引 物 序 列 ： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与原序列是反向互补关系）。
五、特别注意
5′端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大； 引物的延伸是从3′端开始的，所以 3′端引物是影响特异性扩增的最 关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考 虑以下几个内容： 1. 不要终止于密码子的第 3 位；
2. 末位碱基避免使用碱基 A； 3. 避免出现3 个以上连续的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG；
八、详细图解
1. 序列准备：
• （1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； • （2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对； • （3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：
先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角 "Site" 处直接输入 CP 基因上游分界点位置（8391）后回车。接着点击“Speicaes/Abbrv” 和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1” 那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。
接着，在“Primer”-“Two primers Complementarity”“Second Primer From Input”，粘贴入另一端序列，这里 为3'端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG，如下图：
结果显示，两引物间仅有3 个碱基互补，且自由能仅为 1.8 Kcal/mol。
实例图解简并引物设计
一、序言
设计一对合适的引物是 PCR 扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成，却 身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点， 手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下 面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y 病毒CP 基因简并引 物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域 及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、同学批评指正。 二、相关工具 1. MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑； 2. DNAMAN8-检测两引物的互补性； 3. Oligo Calc-评估引物的属性； 4. Web Logo 3-直观显示简并碱基。
点击“Check Self-Complementarity”，检测引物自身 互补性，主要查看“ Potential hairpin formation ”、 “ 3’ Complementarity ” 、 “ All potential selfannealing sites are mar内容，如果三项均为“none”，则说 明引物自身不会形成发夹结构且引物自身不会互补，引 物没问题！
裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment”导 出CP 基因序列（推荐fasta 格式）。
2. 引物设计
推荐先设计 3′端引物， 至于原因，上面的【特 别注意】中已提到，这 里不再赘述。 （1）选择引物序列 综合考虑引物设计原则 及特别注意，在CP 基因 3' 端位置选取一段合适 的序列（ 784-803bp ）， 804bp 位置为A 且是第 三个密码子位置，所以 弃去末位的 A 碱基。
（5）实验验证
PCR 扩增采用的 50μ L 反应体系为：10 ×TransTaq HiFi Buffer II 5 μ L，2.5nM dNTPs 4 μ L， 5′端引物（10 μ mol/L）2 μ L，3′端引物（10 μ mol/L）2 μ L，ddH2O 34.75 μ L，TransTaq HiFi Polymerase（5 U/μ L）0.25 μ L，cDNA 2 μ L。 PCR 扩增程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s， 55℃复性30s，72℃延伸1min，共30 个循环，最后一轮 循环后72℃延伸10min。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电 泳检测PCR扩增产物，如下图所示：
（3）BLAST 比对回检
点击“Blast”可以对引物进行BLAST 比对检测，结果显 示，都是PVY CP 基因相关的序列，表明所设计的引物特 异性良好。
（4）两引物互补性检查
• 同 样 方 式 ， 得 到 5' 端 序 列 ： GSAAAYGAYACAATYGATGC ，根据引物设计原则， 需要检测两引物之间是否存在序列互补。 • 打 开 DNAMAN ， 依 次 在 “ Primer ” - “ Load primer ”，粘贴任意一端引物序列，如： 5' 端序列 GSAAAYGAYACAATYGATGC，确定。