菌种保藏中的细菌鉴定方法
菌种的管理和保藏
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液体冷冻保藏法
制备方法 1%蛋白胨 、甘油 ,灭菌,接种、培养18-24小时.
保存条件 -80℃可保存数年.
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菌种的传代和使用
工作菌种传代次数不得超过5代。 1代 是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传 代一次。
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基本操作技术
细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物接种到培养基上的一种操作技术。
信息。
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2015版-指导原则
菌种的鉴定
纯菌的分离 微生物的表型 表型微生物鉴定 通过长时间培养对微生物细胞的恢复、增殖是有限的，如有些环境中的微生 物在普通微生物增殖培养基不能恢复。此外，分离出的受损的培养物可能不 能完整表达其表型属性。 基因型微生物鉴定
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菌种的鉴定
微生物分类中使用的表型特征
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菌种的保藏
低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖， 因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。
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菌种的保藏
标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再 次使用。
工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用 作
培养时间( h ) 18～24
2～3天
5～7天，或直到获得 丰富的孢子
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菌液制备用稀释液—2015修定内容
修订前 0.9％氯化钠溶液
修订后 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 0.9%无菌氯化钠溶液。
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菌液贮存—2015修定内容
修订前
修订后
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使 用。
微生物菌种保藏方法及关键技术
目录
01 一、微生物菌种保藏 方法
02
二、微生物菌种保藏 关键技术
03
三、应用实践及注意 问题
04 四、结论
05 参考内容
微生物菌种是生物科学领域中的重要资源，它们具有广泛的工业和医学应用价 值。然而，微生物菌种的保存和保藏是一项充满挑战性的任务，因为微生物细 胞的生命周期短暂，且对环境条件极为敏感。为了更好地利用和保护这些珍贵 的资源，本次演示将详细介绍微生物菌种保藏方法及关键技术。
2、需要根据菌种的特性和应用需求，选择合适的培养基和培养条件，以保证 菌种的活性和稳定性。
3、在使用液氮保藏方法时，需要注意液氮的纯度和保存容器的密封性等问题， 以免影响菌种的存活率和保藏效果。
4、在菌种保藏过程中，需要注意防止杂菌污染和交叉感染等问题，以保证菌 种的纯度和质量。
5、需要注意菌种的定期检测和维护，及时发现并处理衰退和失活的菌种，以 保持菌种种群的健康和稳定。
三、应用实践及注意问题
在实际应用中，不同微生物菌种的保藏方法具有各自的优势和适用范围。一般 来说，对于一些常见的微生物种类，如细菌、酵母和霉菌等，冷冻保藏和液氮 保藏是常用的保藏方法。在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的保藏方 法和操作条件。此外，还需要注意以下问题：
1、在菌种保藏过程中，需要注意菌种的来源和背景信息的记录和整理，以便 更好地了解菌种的特性和进行相应的管理。
2、种子管理
种子管理是微生物菌种保藏的关键环节之一。良好的种子管理包括对菌种的纯 度、质量、稳定性和活性的监控和维护。在菌种保藏过程中，需要定期对菌种 进行纯度检测，确保菌种的纯度和质量。同时，需要根据菌种的生长特性和环 境条件，制定相应的管理措施，包括培养基的选择、培养温度和湿度的控制等， 以维持菌种的稳定性和活性。
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
生物安全实验室病原微生物菌(毒)种和生物样本的保存(保藏)
生物安全实验室病原微生物菌（毒）种和生物样本的保存（保藏）实验室进行实验活动时，经常需要保存病原微生物菌（毒）种及样本。
无论是短期还是长期保存，都应遵循安全、存活、生物学特性不变以及避免差错等原则。
一、保藏管理《条例》规定：“国务院卫生主管部门或者兽医主管部门指定的病原微生物菌（毒）种保藏中心或者专业实验室（以下称保藏机构），承担集中储存病原微生物菌（毒）种和样本的任务。
”保藏机构应当依照国务院卫生主管部门或者兽医主管部门的规定，储存实验室送交的病原微生物菌（毒）种和样本，并向实验室提供病原微生物菌（毒）种和样本。
《传染病防治法实施办法》规定："一、二类病原微生物菌（毒）种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
三类菌（毒）种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
”2009年7月16日，卫生部颁布了《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》（原卫生部令第68号），《办法》规定保藏机构是指由原卫生部指定的，按照规定接收、检定、集中储存与管理病原微生物菌（毒）种或样本，并能向合法从事病原微生物实验活动的单位提供病原微生物菌（毒）种或样本的非营利性机构。
病原微生物菌（毒）种保藏机构应具有符合要求的生物安全实验室，包括既符合生物安全要求，又能够保证所保藏病原微生物菌（毒）种质量的设施、设备、技术操作人员和规章制度。
《浙江省病原微生物实验室生物安全管理办法（试行）》规定实验室设立单位应建立病原微生物菌（毒）种和样本保藏保管制度，落实安全责任部门和专人进行管理。
有关机构按照规定从事临床诊疗、疾病控制、检验检疫、教学和科研等工作，在确保安全的基础上，可以保管其工作中经常使用的病原微生物菌（毒）种或样本，其保管的病原微生物菌（毒）种或样本名单应当报当地卫生主管部门备案。
重点落实对高致病性病原微生物菌（毒）种和样本的安全保卫措施，加强安全管理与控制，设立专库专柜，单独储存，做好病原微生物菌（毒）种和样本进出和储存的记录，建立档案制度。
第一章_微生物的分类与鉴定(2学时)
G菌 gram positives
古细菌 achaca
真核生物 cukarya
紫色硫细菌 purple bacteria 蓝细菌 cyanobacteria 黄杆菌属 flavobacteria themotogales
动物 animal 真菌 甲烷八叠球菌 粘菌类 fungi methanosarcina Slime entanoebae molds 甲烷杆菌属 植物 crenarcaeoya methanobacteria plants 嗜盐菌 halophiles 热变形菌属 甲烷球菌属 thermoproteus methanococcus 纤毛类 ciliates 热球菌属 thermococctus 鞭毛类 热网菌属 flagellates pyrodictum 三分体 korarchaeota trichononds 微担孢体 microsporidia 二分体 diplononods
2、核酸杂交
基本原理：不同菌种的同源序列之间互补结合 形成杂合双链；杂交率越高，其亲缘关系就越 近 具体方法：DNA-DND杂交，DNA-rRNA杂交 ，核酸探针 应用：杂交同源性在20~60%是同属不同种， 在60%以上为同一个种，超过70%为同一个亚 种
3、16SrRNA碱基测序
二、微生物的鉴定
（一）形态学特征测定 （二）生理生化特征测定 （三）血清学试验 （四）核酸的碱基测序与分子杂交 （五）蛋白质的氨基酸序列分析
（五）蛋白质的氨基酸序列分析
氨基酸测序：蛋白质的氨基酸序列直接反映 mRNA顺序，同源蛋白质氨基酸序列相似性越 高，其亲缘关系越近 肽指纹图谱测定：蛋白质的肽质量指纹图谱可 以作为种以下分类和鉴定的依据
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法菌种保藏是一种重要的微生物资源保护方式，对于研究、应用和开发微生物具有重要意义。
以下是几种常见的菌种保藏方法及其操作步骤。
一、低温冷冻保藏法低温冷冻是一种常用的微生物保藏方法，适用于大多数真菌、细菌和酵母菌。
其主要原理是将菌株保存在低温下，使其生理活动缓慢，以延长菌种的保藏时间。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，常用的保存液有甘油、甘露醇等。
4. 菌种保存：将菌株用保鲜膜包裹，放入保存管中，加入保存液，密封保存管。
5. 冷冻保存：将保存管放入低温冰箱或液氮罐中进行冷冻保存。
二、干燥保藏法干燥保藏法是一种简便、经济的保藏方法，适用于真菌、细菌、放线菌等微生物。
其基本原理是将菌种与干燥剂混合，使其水分含量降低，从而实现微生物的休眠状态。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备干燥剂：根据不同菌株的需要，选择合适的干燥剂，如硅胶、氧化钙等。
4. 菌种混合：将菌株与干燥剂按照一定比例混合均匀。
5. 干燥保存：将混合物均匀地散布在无菌培养基上，置于通风干燥的环境中进行保存。
三、冷冻冻干保存法冷冻冻干保存法是一种较为复杂的菌株保藏方法，适用于难保存的微生物，如厌氧菌、放线菌等。
其主要原理是将菌株在低温下冻结干燥，从而保护微生物的活力。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，如甘油、甘露醇等。
4. 冷冻过程：将菌株加入保存液中，放入冷冻机冷冻至低温（通常为-80℃）。
5. 冻干过程：将冷冻的菌株经过真空排气、结冰降温等步骤进行冻干处理。
药品检验用菌种的传代和保藏
标准菌种的保藏形式
我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的 形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这 种容器中，微生物通常与赋形剂共存， 由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈 休眠状态。
4
纯培养
所谓微生物的纯培养是指在一个微 生物的菌落形成单位中，所有的微生物 细胞或孢子都属于生物学的同一个种。 严格地说，纯培养是在培养基上由一个 细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。 在该细胞或孢子的生长过程种，不受其 他微生物的侵犯，不会在培养物中产生 另外微生物种的后代，在整个生长过程 中不发生变异或死亡。
44
大肠埃希菌
该菌为微生物限度检查规定不得检出 的控制菌，有一整套完整的鉴定手段， 也可参考该方法用于判断所保藏的菌种 有无发生变异。 该鉴定方法主要内容即为经典的 IMViC试验，结果为++--。
45
铜绿假单孢菌
确认该菌未发生变异的主要方法为： 1、通过显微鉴别，为单个，成对或呈短链排列 的杆菌，有运动性，革兰氏染色为阴性。 2、营养琼脂斜面上菌苔生长旺盛，薄，白色， 闪光，培养基变为绿色至暗褐色或黑色，发荧 光。 3、生化试验可选做明胶穿刺、吲哚和硝酸盐还 原试验，结果迅速液化明胶，液体呈浅黄绿色 或浅蓝绿色，吲哚试验阴性，硝酸盐还原试验 阳性。
36
菌种管理
1、标准菌种必须从认可的菌种收集途经获得；实验室 必须建立和保存所有菌种的收集、贮藏、保存、确认 试验的记录。 2、实验室应有文件管理标准菌种（从原始菌种到工作 用菌种）。该程序应包括： a:标准菌种必须定期传代，并做确认试验，包括实验室在 所需要关键诊断指标，实验室必须记录并保存。 b：每一子菌种都应以适当标签、标记来表示名称、标准 号、接种日期和传代日期。 C:每一子菌种都应以标记从原始菌种传代到工作用菌种的代数； 记录菌种生长的培养基及培养条件；菌种生存条件等。
一般细菌培养及鉴定结果-概述说明以及解释
一般细菌培养及鉴定结果-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以包括以下内容：细菌是一类微小而重要的生物体，广泛存在于自然界的各个角落中，包括土壤、水体、空气以及生物体等。
它们对于生态系统的正常运行和人类的健康至关重要，具有重要的科学研究和应用价值。
在进行细菌的研究和应用之前，首先需要进行细菌的培养和鉴定。
细菌培养是指将采集到的细菌样本在合适的培养基中提供充足的营养和生长条件，使其繁殖扩增。
而细菌鉴定是指通过对细菌形态、生理生化特性以及基因组等方面进行分析和判断来确定细菌的种类和特性。
本文将重点讨论细菌的一般培养方法和鉴定方法。
在细菌培养方法方面，将介绍不同种类的培养基的配制和使用，以及培养条件的控制因素。
在细菌鉴定方法方面，将介绍常用的鉴定手段，如形态观察、生理生化实验和分子生物学技术等，以及它们的原理和应用范围。
通过对一般细菌培养和鉴定的研究，我们可以更好地认识细菌的生长规律和特性，进一步了解它们在自然界和人类生活中的作用。
同时，这些研究成果也为细菌的应用提供了技术支持，例如在医学、工业、农业等领域中的应用。
通过本文的探讨，希望能够使读者对细菌培养和鉴定有更清晰和全面的认识，为相关领域的研究和应用提供理论和实践的指导。
在继续研究细菌的过程中，我们也要注意遵守实验室的安全操作规范，确保实验的准确性和可重复性。
文章结构部分的内容可以写成如下形式：1.2 文章结构本文按照以下结构进行组织和展示：引言部分主要是对整篇文章进行一个概述和介绍，包括细菌培养和鉴定的基本概念以及研究目的。
通过引言，读者可以对文章的内容和目的有一个初步的了解。
正文部分是本文的核心内容，主要介绍了细菌培养方法和细菌鉴定方法。
在细菌培养方法部分，将会详细介绍细菌培养所需的培养基成分、培养条件和培养技术等方面的内容，帮助读者了解细菌在实验室中的培养过程。
在细菌鉴定方法部分，将会介绍细菌鉴定所需的常用技术和方法，包括形态学观察、生理生化试验、分子生物学方法等，帮助读者了解如何对分离到的细菌进行鉴定。
(完整word版)微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1。
了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3。
学习微生物的保藏及鉴定方法。
4。
熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养,24小时内小套管中有气体形成,并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群,为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2。
平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落,经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1。
水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材：双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1。
第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL,并加入产气管.配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡,约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
菌种保藏中心如何进行细菌鉴定
菌种保藏中心如何进行细菌鉴定细菌鉴定是指将分别培育获得的病原菌,通过纯化培育使其达到不含有其他微生物的纯培育程度,继而进行系统鉴定。
而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培育方可进行复核性的系统鉴定。
系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分别细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种：传统方法常规宏观菌落形态学观看,主要观看菌落在其适合的培育基上的生长状况:细菌在固体培育基上的生长形态、大小、颜色是否匀称全都,菌落个体表面及边缘的生长状况;在液体培育基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况;半固体上穿刺接种后,观看细菌是否沿着接种线生长以及其生长状态是呈毛刷样生长还是匀称生长,上下生长是否全都.在鉴别培育基上培育,观看结果是否跟预期结果相同。
细菌的个体形态学观看,即通过显微镜观看.观看前细菌需要着色,要依据预先确定的观看项目选择与之相对应的染色方法,目前常用的染色方法包括革兰氏染色法、美蓝染色法、ZiehlNeelsen染色法、姬姆萨染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.尽量选择对数生长期的细菌进行染色观看,此时的细菌生特长于幼期,利于观看,由于一些陈旧细菌的染色结果会有变化,如本为革兰氏阳性菌经过长期搁置后染色结果可能为革兰氏阴性.同时细菌培育时要留意培育基的选择,一些细菌的特别结构如荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表达是需要在特定的培育基上才能正常发育,有的细菌如炭疽在一般的培育基上不形成荚膜,只在动物体内形成明显的荚膜,所以需先接种试验动物后用病料进行涂片镜检.在镜检时观看细菌基本形态结构和大小及其排列状态、菌端外形、有无两极染色、有无形成芽胞和荚胞等。
形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义,生化试验是依据细菌培育过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各异,表现出不同的生长特性.通过生物化学的方法来检测这些物质的存在与否,从而能够得到细菌的鉴定结果.如糖(醇)类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验、呼吸酶类试验、毒性酶类试验等。
中国医学微生物菌种保藏管理办法
中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。
第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心:中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。
中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。
中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。
保藏管理中心的任务是:(一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究;(三)组织学术交流和经验交流;(四)办理国内外菌种交换;(五)编制保管的菌种目录。
保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。
专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。
其具体任务是:(一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)承担本专业有关疑难菌种鉴定;(三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用;(四)办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。
生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。
第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。
依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。
一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。
菌种的保藏名词解释
菌种的保藏名词解释菌种的保藏对于微生物学研究非常重要，确保菌种的保存和传播。
本文将解释与菌种保藏相关的几个名词，包括：菌种、保藏、菌种鉴定、冻存和保存条件等。
菌种是指一种细菌、真菌或其他微生物，经过世界各地科研机构和鉴定中心确认后，被正式命名并分配了唯一的编号。
菌种通常由科学家从自然环境中分离和培养得来，通过研究和实验验证后确立其存在和性质。
菌种的命名和编号非常重要，可以确保科学研究的准确性和可靠性。
保藏是指将菌种保存并保持其活性和纯度的过程。
保藏通常通过冻存和保存在冷冻设备中来实现，如液氮罐或超低温冰箱。
通过冻存，菌种可以长期保存，并在需要时重新培养。
保藏的目的是防止菌种的丧失、污染和变异，从而保证后续研究的可重复性。
菌种鉴定是指对菌种进行识别和分类的过程。
菌种鉴定的目的是确认菌株的身份和性质，包括其学名、分类和特性。
鉴定菌种的方法包括形态学观察、生理生化特性分析、生物分子检测等。
菌种鉴定的准确性对于后续的科学研究和应用非常重要，可以避免误用和混淆。
冻存是指将菌种保存在极低温度下以确保其存活和保持活性的过程。
冻存的主要方法是将菌种培养物添加适当的保护剂后，冷冻在低温条件下。
常用的保护剂包括甘露醇、甘油和蔗糖等，它们可以防止细胞水分的蒸发和结冰对细胞造成的伤害。
冻存使菌种可以在无菌条件下长期保存，并在需要时快速恢复培养。
保存条件是指在保存和传播菌种时需要注意的环境和条件。
为了保持菌种的活力和纯度，保存过程中需要严格控制温度、湿度和光照等条件。
一般来说，菌种保存的温度应低于冰点，湿度应保持在相对较低的水平，以减少细菌和真菌的生长。
此外，保存过程中需要定期检查，并确保保存容器的密封和标签的完整性。
总结起来，菌种的保藏是科学研究和应用的基础，通过冻存和合理的保存条件，可以确保菌种的长期保存和可重复使用。
菌种的鉴定和保藏是微生物学研究中不可或缺的环节，为科学家提供了准确和可靠的研究对象。
对菌种保藏名词的了解，有助于更好地理解菌种的重要性和保存工作的必要性。
实验室常用菌种的保存和管理
实验室常用菌种的保存和管理摘要：保藏菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个保存过程中不被杂菌污染。
因此，选择有效且稳定的保藏微生物菌种的方法至关重要。
关键词：菌种；保存；管理医学病原生物学实验室主要承担微生物实验教学任务，日常工作中经常要分离、鉴定细菌、试教演示、保存菌种等。
菌种是微生物实验的基本材料，因涉及到师生的安全，所以要正确保存，妥善管理，逐步实现菌种的保存制度化与科学化。
一、材料与方法1.教学实验常用的菌种保存营养要求不高的菌种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、志贺氏菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌。
营养要求高的菌种：链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌、脑膜炎奈瑟菌。
厌氧芽孢杆菌：产气荚膜杆菌。
需氧芽胞杆菌：枯草芽孢杆菌。
真菌：白色念珠菌、新生隐球菌。
2.菌种的鉴定实验室中保存的菌种都要经过鉴定合格后方可使用，常用的鉴定方法有形态学观察、菌落特征、生化反应及血清学鉴定。
3.菌种的保存（1）定期传代保存法传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低，培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
①液体培养基低温保存法。
将保持营养要求不高的细菌接种于装有营养肉汤的试管中，营养要求高的细菌接种于含15%血清的营养肉汤中，经37℃培养18~14小时后，取出封口，置4℃冰箱保存。
②半固体穿刺保存法。
将细菌穿刺接种于普通半固体培养基内，37℃培养18~24小时后，在无菌条件下加入灭菌液体石蜡，厚度约1厘米，封口后置4℃冰箱保存。
③琼脂斜面保存法。
营养要求不高的菌种用普通琼脂斜面保存法，营养要求高的菌种用血液琼脂斜面保存，将细菌蜿蜒接种于血液琼脂斜面上，置37℃培养18~24h后，石腊封口，放于4℃冰箱保存。
④沙保氏培养基保存法。
《中国药典》菌种的传代与保藏
酵母菌
一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂
4~6℃
一般4~6个月
丝状真 菌
一 般 用 PDA 琼 脂 、 蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等
4~6℃
精品课件
每4个月移植一次 （每于推广；一
般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微 生物都适用。
缺点是——保藏期太短；传代次 数多，易发生变异及污染。
▪ 适用范围：适用于保 藏部分霉菌，酵母菌 和放线菌，对细菌保 藏效果较差。
精品课件
液体石蜡对各类菌种保藏效果
菌
种 菌株数
细菌
87
霉菌
586
酵母菌
400
放线菌
380
保存时间 （年）
5 5 2 4
存活率 （%）
20.9 83.6 88.9 91.3
精品课件
（3）特点： 本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，
若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进 行移种。
精品课件
1.琼脂斜面低温保存法
▪ （1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接 种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上， 按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把 培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养 基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏 管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱 中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保 藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可 保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。
▪ （2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。
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大肠杆菌斜面 斜面
金黄色葡萄球菌
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生孢梭菌 白色念珠菌 需气菌、厌气菌培养基
真菌培养基
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各类菌种保藏条件及时间
菌种测定方法范文
菌种测定方法范文
菌种测定是指通过一系列的检测方法来鉴定和确定一种特定的菌种。
菌种测定的目的是为了研究菌种的特性、分类和分类以及开展相关研究。
传统方法主要包括以下几个方面：
1.菌落形态观察：通过培养菌种在琼脂平板上，观察其菌落的形态、
颜色、大小、边缘等特点，从而初步鉴定菌种。
2.细胞形态观察：通过高倍显微镜观察菌种的细胞形态、大小、形状等，如细胞是否为球形、梭形、杆状等，是否具有芽孢、菌丝等结构。
3.胞外酶活性检测：通过观察菌种在含有特定基质的琼脂培养基上的
酶活性，如淀粉酶、蛋白酶等，来鉴定菌种。
4.生化物质代谢产物检测：通过观察菌种在特定培养条件下产生的代
谢产物，如氨基酸、酶、激素和抗生素等，来鉴定菌种。
分子生物学方法主要包括以下几个方面：
1.PCR扩增：利用PCR技术扩增菌种的特定基因段，如16SrRNA基因，然后通过凝胶电泳分离扩增产物，比较其片段大小和序列信息，从而鉴定
菌种。
2.DNA测序：通过对PCR扩增产物进行测序，可以得到菌种的特定基
因序列信息，进而与已知菌种的基因序列数据库进行比对，从而鉴定菌种。
3.蛋白质电泳：通过将菌种的蛋白质提取后，利用凝胶电泳进行分离，然后观察或比较菌种蛋白质的迁移模式，从而鉴定菌种。
除了上述方法之外，还可以通过生长特性、呼吸特性和耐受性测试等进行菌种测定。
此外，近年来随着高通量测序技术的发展，菌种测定越来越多地使用分子生物学方法进行。
总之，菌种测定是一项重要的研究工作，通过传统方法和分子生物学方法的组合应用，可以更准确、更快速地鉴定和确定特定的菌种。
中国医学微生物菌种保藏管理办法
病原微生物菌（毒）种和样本的重要性段丽莉. 菌种保管应有专人负责，保存于冰箱中，房门专人加锁，确保菌种安全。
保管人员变动时，必须严格交接手续。
2、菌种应有严格的登记，包括形态，分离日期，鉴定日期，签发者，主要鉴定性能（包括形态、染色、抗原结构、动物致病力等），并注明使用、转移、销毁情况及原因。
3、各种菌种应按规定时间接种，一般在接种三次后作一次全面的鉴定，注意菌种有无污染及变异，如发现变异时，应及时更换。
4、菌种保存范围及向外单位转移，应按国家卫生部规定执行。
5、所有存在菌种应具备清单。
编写：审核：批准：批准日期：主要内容病原微生物菌（毒）种和样本是国家重要生物资源，是保障生物安全和国家经济安全与稳定的重要战略资源。
是人类传染病预防、诊断和治疗以及医学科研和教学事业的基础和重要支撑条件，也是保障食品安全、生物安全以及抵御生物恐怖袭击的前提条件。
病原微生物菌（毒）种和样本病原微生物菌（毒）种和样本由于其本身所具有的特殊性，在其采集、携带、运输、保藏管理和使用过程中必须强调生物安全，必须符合国家传染病防治、医学微生物菌（毒）种管理有关法规的规定。
其管理不仅强调在硬件设备上要符合微生物安全防护的要求，更重要的是强调所有管理人员、工作人员在日常工作中要有常备不懈的防护意识和守法观念。
菌（毒）种分类按照微生物结构、组成分为三大类：原核细胞型微生物：细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体和放线菌。
真核细胞型微生物：真菌非细胞型微生物：病毒中国医学微生物菌种保藏管理办法第二条菌种的分类菌（毒）种的分类根据其危险性决定的对实验室感染的可能性；人体感染后发病的可能性；发病后症状轻重及愈后情况；有无致命危险及有效的防止实验室感染方法；用一般的微生物操作方法能否防止实验室污染；我国有否此种菌种及曾否引起流行人群免疫力等情况。
依其危险程度的大小，我国的菌(毒)种分为四类。
中国医学微生物菌种保藏管理办法第二条菌种的分类一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌（毒）种。
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菌种保藏中的细菌鉴定方法
作为科研生产中最重要的基础性资源—菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段.2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作.国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动.作为该项8的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作.本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题.经分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差.
细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定.而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定.系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种:
1、传统方法
常规宏观菌落形态学观察,主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况:细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致,菌落个体表面及边缘的生长状况;在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况;半固体上穿刺接种后,观察细菌是否沿着接种线生长以及其生长状态是呈毛刷样生长还是均匀生长,上下生长是否一致.在鉴别培养基上培养,观察结果是否跟预期结果相同.
细菌的个体形态学观察,即通过显微镜观察.观察前细菌需要着色,要根据预先确定的观
察项目选择与之相对应的染色方法,目前常用的染色方法包括革兰氏染色法、美蓝染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆萨染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.尽量挑选对数生长期的细菌进行染色观察,此时的细菌生长处于幼期,利于观察,因为一些陈旧细菌的染色结果会有变化,如本为革兰氏阳性菌经过长期搁置后染色结果可能为革兰氏阴性.同时细菌培养时要注意培养基的挑选,一些细菌的特殊结构如荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表达是需要在特定的培养基上才能正常发育,有的细菌如炭疽在一般的培养基上不形成荚膜,只在动物体内形成明显的荚膜,所以需先接种实验动物后用病料进行涂片镜检.在镜检时观察细菌基本形态结构和大小及其排列状态、菌端形状、有无两极染色、有无形成芽胞和荚胞等.
形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义,生化试验是根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各异,表现出不同的生长特性.通过生物化学的方法来检测这些物质的存在与否,从而能够得到细菌的鉴定结果.如糖(醇)类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验、呼吸酶类试验、毒性酶类试验等.
血清型鉴定是根据细菌具有相对特异性的抗原结构这个特点进行微生物鉴定的特异方法.抗原的特异性程度又存在于属间细菌所共有的共同抗原,这种抗原的存在,能表明其属性.另一类特异性抗原只存在于特定的种、型,是确定细菌种、型的重要依据.通过专门的分型血清即可对这些细菌的血清型进行鉴定.
细菌毒力的测定,病原菌侵入机体能否引起疾病与其本身的毒力、侵入机体的数量和侵入部位有关.不同的病原菌或同种细菌不同的型或株,毒力常不一致.常用LD50或ID50表示毒力,即在一定时间内,能使一定条件的某种动物半数死亡或感染需要的最小细菌数或毒素量.毒力测定在菌种鉴定过程中可用于鉴别一些有代表性的菌株.LD50可用Reed—Muench公式进行计算.
2、仪器自动化鉴定
随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用,微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观
察和人工生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段.近20年来,一系列商品化自动鉴定系统相继推出,并在应用中取得理想效果,如VITEK系统、MIDl系统、BIOLOG系统、 SENSITl．TRE系统、AUTOSCEPTOR系统以及MICROSCAN系统等.下面以BIOLOG 微生物鉴定系统为例,简述微生物自动鉴定系统的工作原理:BIOLOG微生物自动分析系统是美国Biolog公司从1989年开始推出的一套微生物鉴定系统,该系统主要根据细菌对糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95种碳源的利用情况进行鉴定.细菌利用碳源进行呼吸时,会将四哇类氧化还原染色剂(TV)从无色还原成紫色,从而在鉴定微平板(96孔板)上形成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”,通过纤维光学读取设备——读数仪来读取颜色变化(分为“自动”和“人工”两种读取方式),由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或“指纹图谱”与数据库相比较,可以在瞬间得到鉴定结果,确定所分析的菌株的属名或种名.以BIOLOG系统6．01版数据库为例,包含了革兰氏阴性好氧菌524种、革兰氏阳性好气菌341种、厌氧菌361种、酵母菌267种、丝状真菌(含部分酵母菌)619种以及几种特殊的致病菌,目前这个数据库已进行更新.利用微生物快速系统进行细菌鉴定,能节省时间,但由于其在数据比对过程中记入一些非特异性的阳性反应孔,会造成偶然误差,从而引起个别鉴定结果不稳定,另外此类仪器本身及其耗材价格均较高.
3、分子生物学鉴定
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核酸检测技术,包括基因测序、指纹图谱技术、基因探针技术、聚合酶链反应(PCR)、GC含量测定等.PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成比较经典的核酸检测技术,目前这两者已经得到了较大范围的推广和应用.
下面将简单介绍几种核酸检测技术的原理:
DNA的G+C含量测定法
此法是根据细菌的DNA中G+C含量的特异性来进行细菌鉴定,通过熔解温度(Tm)法或浮力密度法测定细菌DNA中G+C的含量,通过对比来鉴定细菌.
扩增片段长度多态性(AFLP)分析
此法是一种测定基因组限制性片段的DNA指纹技术,通过PCR选择性地扩增整个基因组DNA的内切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝胶上电泳,产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图谱.与其他DNA指纹技术相比有其独特的优点:可用于各种大小不同的基因组的指纹分析,为研究细菌属乃至株间的亲缘关系提供一个有效手段;具有一定的灵活性,可通过特异性PCR引物的设计和内切酶组合的选择,调整AFLP图谱中限制性片段的适宜数目;由于适用了严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝胶电泳,因而重复性好,分辨率高;AFLP不仅仅是简单的指纹技术,而且可作为连接遗传图谱与物理图谱间的桥梁而用于基因组的研究. 限制性片段长度多态性(RFLP)分析
其原理是用限制性内切酶将细菌基因组DNA进行切割,之后在琼脂糖凝胶上电泳分离,以显示不同种群基因组DNA的限制性片段长度多态性.RFLP产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定.
随机扩增DNA多态性(RAPD)分析,又称为随意引物PCR(AP—PCR)
它是一种DNA指纹多态性分析技术,其理论依据是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同,因而用一组人为设计的核苷酸作为引物,通过PCR随机扩增可产生物种特异性的DNA带谱.
16S rRNA鉴定
细菌的核糖体RNA(rRNA)基因高度保守且进化速度缓慢,在漫长的进化过程中保留了rRNA基因结构和功能的同源性,在微生物染色体上可存在多个拷贝,以rRNA基因片段为探针可检出含有rRNA基因的DNA片段.分析杂交后得到的rRNA指纹图,为菌种定型和近缘菌株的鉴定提供了一种新技术.针对rRNA基因的核糖体分型可成功地区分多个菌种的相关菌株,因此该技术也被广泛称作核糖体分型技术.原核生物含有23S、16S和5S三种 rRNA,其大小分别约为3000、1500和120个碱基.其中作为小亚单位核糖体RNA的16S rRNA的大小最适合于核糖体分型.一般完成l6S rRNA序列测定后,在GenBank中与已知的序列进行BLAST分析,从而
得出鉴定结果.
4、小结
一般来说,对于微生物的检测或鉴定应当至少使用三种指标同时进行验证.传统的分类鉴定需要测定的项目众多,工作程序繁琐,耗时长.在某些时候可以配合分子生物学的方法进行鉴定,如在进行菌株的血清型鉴定时,对于某些国内资源稀缺的菌株定型血清,而进口定型血清价格昂贵,国内可以开发分子生物学分型方法完成菌株的血清分型工作.而在利用分子生物学方法鉴定菌株血清型时,经常会遇到有一些菌株的血清型种类繁多,目前还无法通过简单的核酸测定完成血清定型工作,如大肠杆菌,仅O抗原就有上百种血清型,对于这种情况在使用血清进行定型的同时,还需要继续深入研究其分型技术.目前市场上的微生物自动鉴定系统虽然基本上都通过了相关权威组织的认可,在细菌快速鉴定或初步鉴定中起到了一定的作用,但如前所述,其稳定性尚存在一定问题,同样需要配合其他方法来相互印证,从而完成细菌鉴定工作.
总而言之,更多地使用传统与现代相结合以及不断发掘新的鉴定方法才能更好地完善菌种保藏过程中的细菌鉴定工作.。