第九章 植物花药和花粉培养

是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。
9.2.5 用于遗传转化
不受显隐性影响。
能直接表达外源基因，
图9-4 小麦花药培养一步成苗
与多级成苗相比，一步成苗有以下几个优点：
1） 一步成苗简化了培养程序，降低了培养成本，加
快了成苗速度。
2）一步成苗提高了花药培养效率。（提高绿苗率，
主要通过胚状体成苗）
3）一步成苗中绿苗的质量明显提高。（生长快而健
壮）
4）一步成苗简化了培养过程，减少了愈伤组织形成
过程中的细胞变异，有效降低了白化苗产生频率。
（3）培养过程加倍法 脱分化期培养基中加入低浓度秋水仙素加倍， 加倍效果都不很理想 在继代培养基中加入秋水仙素是加倍处理另 一途径。 （4）注射法 禾谷类作物花培单倍体苗采用分蘖节注射 法可以得到良好的加倍效果。这一加倍方法 的加倍成功率可达到40%以上，最高可达68 ％。 2) 除草剂诱导 （毒性小，引起植株的变异几率小）
诱变育种中的作用 加倍后成为稳定的纯系。 9.2.2 物种进化研究
植株不受显隐性的影
响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，
可探索亲本染色体组
的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二 价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存 在同源染色体。
9.2.3 遗传分析
单倍体植株中基因不受显
隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。 能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基 因的剂量效应分析。 9.2.4 构建连锁图谱 双单倍体（DH）群体
烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株
2)愈伤组织发育
途径
小孢子
水
分裂数次形成愈 伤，再分化形成 花粉植株。此途 径产生的植株会
稻 花 接种在平板上的水稻花药 部分花药产生愈伤组织 药
培
养
出现变异且倍性
复杂。
愈伤组织转接种 到再生培养基
愈伤组织分化形 成再生植株
9.7 单倍体植株鉴定和染色体加倍
供体亲本 AaBb
花培
单倍体 二倍体 AB------ --------------------> AABB aB----------------------------> aaBB Ab----------------------------> AAbb
ab-- --------------------------> aabb
DNA缺失，产生白苗。另外无性系变异也可能
是原因之一。
9.5.2 白化苗的控制
通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分 等因素进行调控。
9.6 花粉植株形态发生方式
1)胚状体发育途径 小孢子经历胚发生
的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。
芸苔属小孢子培养
a) 球形胚
d)
鱼雷形胚
烟草花药培养
烟草部分花药通过胚状体途径形成小植株
低温（接种前3~20℃或接种后6~10℃ ）；γ —射线
和激光；高温预处理 （接种后32~35 ℃ ）；等方法
3）消毒
70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精
浸泡30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-
20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，
无菌水冲洗3-5次。 4）培养 固体、液体与条件培养。
花培 供体植株 小孢子（n） 雄核发育
花粉植 株（n）
自然加倍 人工加倍
纯合植株DH （2n）
一年内获得纯系
（2）提高了目标基因型的选择效率
例子： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代 中选择基因为AAbb的纯合单株 常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不
能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。
具有高度的相关性。
植株形态学鉴定法
单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，
花粉粒小，不结实。
9.7.2 染色体加倍
9.7.2.1 茎段培养
（为什么要进行加倍？）
将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤 组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中
会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍
体细胞，分化出纯合的二倍体植株。
第九章 植物花药和花粉培养
9.1 植物花药和花粉培养的概念
花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的
发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行 分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被 称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。
图9-2 小麦花药小孢子胚胎发生（引自陈耀锋，1998）
花药中（或花粉）小孢子的雄核发育，产生植物
单倍体（haploid），进而可以通过染色体加倍
产生加倍单倍体（double haploid，DH）。
双倍体植株
单倍体胚
单倍体植株
两者的异同点

相同点： 培养目的相同，均获 得小孢子植株。

不同点： （1）花药培养离体操 作技术简单，而且，药 壁组织有时可作为条件 因子促进小孢子的发育。
吊竹花粉粒 辣椒花药
先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚 或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3 周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。
图9-2 小麦花药小孢子胚胎发生（引自陈耀锋，1998）
图9-3 小麦花药愈伤组织（左）及芽、根的分化（右）（引自陈耀锋，2002）
9.2.2 花粉培养
与花药组织培养相比，花粉培养具有以下优点：
花药培养产生的植株并不都是起源于花粉，容易受
药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植 株中会出现不同倍性的个体，所以花药培养在诱导
单倍体方面有一定的局限性，而分离的花粉粒培养
可以克服这一不足。
由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更
好地调节控制雄核发育的各种因子，而且能直接从 单细胞开始观察整个雄核发育的过程。
花粉培养没有药壁组 织干扰；可计数小孢子 产胚率；可观察雄核发 育的全过程；单倍体产 量高。但技术更复杂。

（2）花药培养属于组 织培养；而花粉培养属 于细胞培 养。
辣椒花药
吊竹花粉粒
9.2 花药和花粉培养方法
9.2.1 花药培养
1）取材 宜的花蕾。 2）预处理 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适
看护培养
利用花药或花药愈伤组织释放
出的活性物质促进花粉小孢子发育。
Leabharlann Baidu护培养图解
9.4
花药培养一步成苗
通常花药培养一般是采用脱分化、再分化和生根
壮苗等几个培养程序，称为多级成苗。
一次成苗又称一步成苗或直接成苗，是指离体培
养的花药组织的花粉细胞在一种培养基上同时完 成脱分化和再分化过程，直接分化出完整植株的 培养方法。
的组成上有明显差异。
花粉植株的白化现象是不可逆的，通过改变
营养成分或其它条件都无法使白苗转绿。
9.5.1 白化苗产生的影响因素及机理
1）内因
供体植株基因型（如籼稻比粳稻
白苗率高）、花粉发育时期。
2）外因
预处理、培养基成分、激素水平
与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时
间等。
3）机理 核基因起关键作用，导致质体
9.7.1 倍性鉴定
(1)染色体直接计数法
通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制 片，直接计数染色体数目。 (2)间接鉴定
扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪） 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定 细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。
细胞形态学鉴定法
叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔
数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性
挤压法
在烧杯或研钵中用玻棒等挤压花药，
将花粉挤出后收集培养。
磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液
中的花药， 使花粉游离出来；
超速旋切法
通过搅拌器中的高速旋转刀具
破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来 （此法应用最广）。 4）甘露醇处理法（0.3 mol/L甘露醇中25℃暗培养3～4 d ）
5）小孢子纯化 子。
花粉是真正的单细胞单倍体，花
粉群体的所有小孢子在培养条件 下均能匀质地接受各种化学的、
物理的因子处理，是突变体筛选
及外源基因导入研究的有用材料，
七叶树花粉粒
对育种有很大的意义。
花粉群体大，一个花药中就有成
千上万个小孢子，从花粉培养能
得到更多的花粉植株。
9.2.2.1
花粉的分离与纯化
1）自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在固体或液体培养基上，待花粉 自动散落后，收集培养。 2）机械游离
AB AB aB Ab ab AABB aABB AabB aAbB aB AaBB aaBB AabB aabB Ab AABb aABb AAbb aAbb ab AaBb aaBb Aabb aabb
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代
中选择基因为AAbb的纯合单株
单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。
培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝
固后，在表面加入少量液体培养基。
预培养法
将花药在培养基上先培养3～4 d，再
将花粉分离出来小三角瓶中作薄层培养。
微室培养
利用小的盖玻片和凹穴载玻片
形成微室进行花粉培养
条件培养基培养
利用培养过花药的液体
培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。
花药条件培养基、子房条件培养等。
9.7.2.2 化学试剂诱变
有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。
1) 秋水仙素诱导
（1）浸入法
无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生 小植株、根、茎、生长点或分蘖节进行染色体加 倍的方法。
（2）生长锥处理 双子叶植物多用此种加倍方法，可用涂布、 滴下、带药棉球处理（顶芽或腋芽）法进行加倍。
对上述方法获得的小孢子混
合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢
梯度离心前
（小孢子形态、活力不一致）
30%蔗糖梯度离心后
（获得均一的小孢子群体）
9.3.2.2
花粉培养方式
花粉置琼脂固化培养基上培养。
平板培养 液体培养
花粉悬浮在液体培养基中培养，需
震荡，以利通气。
双层培养
花粉置固体-液体双层培养基上培养。
9.5 白化苗现象
白化苗的重要特性:
生殖生长和雌蕊的发育均不正常，不能完成有
性世代和获得白化苗的种子，无法用这种方法
证明它是否是一种可遗传性状。
在花粉白化苗的细胞中，常发现有微核存在。
白化苗叶肉细胞的细胞质中，无正常发育的
成熟叶绿体，只存在前质体到近乎正常叶绿
体的各种形态的质体。
花粉白化苗和绿苗在蛋白质、RNA和DNA
花药和花粉培养基本流程：
选择合适的供体植株（F1？）
预处理花药（物理或生理逆境）
收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体 胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。
倍性鉴定或染色体加倍
9.2 花药或花粉培养的意义：
9.2.1 作物育种 （1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯 系，而小 孢子培养仅需一年。