混合培养中晶体磷酸铁的异化还原能力

微生物介导的铁还原对厌氧环境中磷素的地球生物化学循环过程有着显著的影响。研究表明， 南方酸性和中性水稻土磷的释放与铁的氧化还原密切相关[1~3]。稻田土壤磷的有效性在很大程度上受 铁形态转化的制约，淹水过程能使氧化铁还原，导致土壤中磷素有效性的明显提高及无机磷形态的 变化[4]。章永松[5]提出，淹水过程可导致结晶度差的铁氧化物的增多，引起土壤对磷的吸附量显著增 加。而曹宁等[4]的研究表明，无定型铁氧化物的还原无疑导致了吸附态磷的释放。在土壤的无机磷
用能力的差异。结果表明，3 种来源于水稻土的微生物均能够利用葡萄糖、乙酸盐以及丙酮酸盐作为唯一电子供体，
使晶体磷酸铁发生异化生物代谢，产生Fe(II)并释放磷酸盐，并且Fe(II)产生量与磷酸盐释放具有极显著的相关关
系；晶体磷酸铁的还原速率及铁还原量明显低于无定型氧化铁，导致这一现象的原因可能与形成蓝铁矿有关；体系
[收稿日期] [基金项目] [作者简介] [通讯作者]
教育部博士学科点专项科研基金（20020712009）；国家自然科学基金（40271067） 孙宏飞，女，河南周口人，在读硕士，主要从事环境化学方向的研究。 曲东（1960-），男，河南陕县人，教授，博士，主要从事土壤环境化学方向的研究。E-mail: dongqu@nwsuaf.edu.cn。
0 0
SC JL JX
10
20
30
40
50
培 养 时 间 /d
Incubation time
图 1 不同来源的微生物对磷酸铁的异化还原
图 2 不同来源的微生物对无定型铁的异化还原
Fig.1 Dissimilatory reduction of Ferric phosphate by different resources of microbe
2.2 磷酸铁生物还原过程中磷素的累积
Fig.2 Dissimilatory reduction of Phosphorus by different resources of microbe
接种不同微生物的磷酸铁还原过程中磷酸盐的释放情况由图 3 所示。由于体系中加入了一定数
量的磷酸盐缓冲液，所以图中的数值为测定的磷酸盐量减去加入量所得的结果。
物还原的铁可占土壤总铁量的 20%左右，占游离氧化铁的 60%～75%，而且无定型氧化铁仅占微生 物还原铁的 50%~65%，说明其中晶体态铁的还原同样具有重要地位。所以，探明这些晶体铁的还原，
对于深入认识土壤中微生物铁还原机理具有重要的理论意义。目前，针对微生物铁还原的研究多都 是以水稻土或沉积物为研究模式来进行的[8，9]。这虽然比较真实的反映了这一过程的自然特征，但由 于水稻土中影响因素复杂，背景干扰大，数据分析比较困难。因此，本研究采用混合培养方法，以 晶体磷酸铁为铁源，通过接种不同来源的土壤微生物，以期探讨厌氧培养条件下晶体磷酸铁的生物 还原能力及在不同碳源条件下还原能力的差异。
试验按铁源分为晶体磷酸铁和无定形氧化铁处理；按碳源种类分为葡萄糖、乙酸盐和丙酮酸盐 处理；按接种液的来源分为 3 种，即SC、JL和JX；磷源设置添加磷酸缓冲液及不添加磷酸缓冲液的 处理（用 1ml无菌水补充），以比较磷酸盐对磷酸铁还原的影响。在研究晶体磷酸铁微生物还原能力 的处理中，选用葡萄糖作为碳源，并加入氮源和磷源，同时设置相同碳、氮、磷源条件下以无定形 氧化铁为铁源的处理作为对照；在研究不同碳源条件下磷酸铁还原能力的处理中，选用葡萄糖、乙 酸盐和丙酮酸盐作为碳源，加入氮源，但不添加磷源，以上各处理中分别接种 3 种不同来源的接种 液。培养试验中采用 10ml的血清瓶，分别加入铁源、碳源、氮源、磷源及接种液各 1ml。培养试验 所用的磷酸铁悬液、Fe(OH)3悬液、磷酸缓冲液及NH4Cl直接采用高压灭菌，葡萄糖、乙酸盐和丙酮 酸盐等碳源采用细菌滤器（<0.22μm）过滤除菌。充氮除氧后于 30℃下避光恒温培养。采样及测定 方法见参考文献[9]。
2 结果与分析
2.1 晶型磷酸铁的微生物还原 磷酸铁悬液中接种 3 种水稻土微生物后Fe(II)产生量的变化由图 1 所示。在混合培养中不同处
理都表现为随培养时间的延长Fe(II)产生量不断增大，说明来源于 3 种水稻土的厌氧微生物都能以 葡萄糖作为电子供体还原磷酸铁，证明晶体FePO4具有一定的生物还原能力。异化Fe(III)还原是微生 物介导的生物学过程，与微生物的生长密切相关，所以可用表征微生物生长动力学的Logistic方程描 述。Logistic方程的表达式为：Y=a/[1+b·exp(-cx)]。用Logistic方程拟合的晶体FePO4还原过程的参数 见表 1。利用参数a可得出Fe(III)还原的最大潜势，即最大Fe(II)累积量；参数c表示速率常数；用参数 a和c可求出最大反应速率Vmax，其数值等于 0.25ac；最大Fe(II)累积量和加入氧化铁量的比值可以得 出Fe(III)的还原率；r和s分别表示相关系数和偏差。
Fe(III)还原率(%) Reaction rate
Vmax
mg/(L·d)
a
b
c
r
s
SC
325.3 15.37 0.181 0.994 16.04
67.60
14.68
JL
395.7 19.87 0.073 0.989 13.37
82.23
7.172
JX
403.2 20.73 0.090 0.996 11.03
中可溶性磷酸盐数量对利用葡萄糖为碳源的铁还原反应有显著的影响，在缺乏可溶性磷酸盐的环境下，可能通过抑
制发酵微生物生长，阻断了葡萄糖发酵生成有机酸和H2的过程，从而使磷酸铁的异化还原不能发生。
[关键词] 晶体磷酸铁；异化 Fe(III)还原；不同碳源利用；水稻土
[中图分类号]
[文献标识码] A
[文章编码]
Fe（II） 浓度 /m -g1L Fe（II） concentration
Fe（II） 浓度 /m -g1L Fe（II） concentration
400
SC
JL
JX
300
200
100
0 0
10
20
30
40
50
培 养 时 间 /d
Incubation time
700 600 500 400 300 200 100
表 1 用 Logistic 方程拟合的磷酸铁还原参数
Table 1 The Logistic model fits of dissimilatory Ferric phosphate reduction in different treatments
处理 Treatments
wk.baidu.comLogistic 方程参数 Logistic model parameters
2
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为 67.60%。 不同来源微生物对无定型氧化铁的还原情况如图 2 所示。SC处理在厌氧培养 3d后其铁还原反
应就达到平衡，Fe(II)累积量达到了最大值，还原率为 95.3%。JL和JX处理的铁还原在 21d后才快速 增加，Fe(II)的产生量在 32d后达到最大值，其Fe(III)还原率分别为 92.1% 和 96.3%。这一结果一 方面说明 3 种水稻土中的微生物均能使Fe(III)还原为Fe(II)，另一方面也表明无定型氧化铁比晶型 磷酸铁更易被微生物还原。比较图 1 和图 2 发现，从两种形态的铁还原速率来看，在培养前期都是 SC处理进行得最快，其次为JX处理，最后是JL处理。晶型磷酸铁的微生物还原速率整体上小于无定 型铁。Fe(III)被微生物还原后产生的Fe(II)主要以菱铁矿（FeCO3）、磁铁矿（Fe3O4）或蓝铁矿 [Fe3(PO4)2·8H2O]等形式存在。在微生物利用无定型氧化铁的还原试验中，产生的菱铁矿是主要产物， 其可以被 0.5mol·L-1的HCl溶解，产生的Fe2+可以用比色法测定。在反应温度较高时中会有很少量的 黑色磁铁矿出现，可通过磁性法检测。磁铁矿不能被稀HCl浸提，同时结合的Fe(III)也难以被微生 物还原[6]，这可能是无定型铁的还原率未达到 100%的主要原因之一。在晶型磷酸铁的还原过程中， 由于还原反应同时产生大量的磷酸盐，将会显著增加形成蓝铁矿的数量。同样，蓝铁矿中的Fe(II) 也不易被稀HCl浸提，所以导致测定出的最终Fe(III)还原量及计算出的铁还原率比无定型氧化铁处 理显著偏低。
1 材料和方法
1.1 供试土壤及接种液制备 供试的水稻土样品分别采自吉林省吉林市丰满区前二道乡、四川省邛崃市迥龙镇、江西省安福
县竹江乡店上村。先后于 2000 年 2~9 月采集 0~20cm 耕层土壤，自然风干，磨细，过 1mm 筛。土 样的基本性质参见文献[9]。将风干过 1 mm 筛的供试水稻土以 m（水稻土）∶v（去离子水）= 1∶ 9 的比例在 30 ℃下淹水 1 周。将培养后的土样置离心机中，于 700 r/min 离心 10 min，取上清液用 作微生物接种液。来源于 3 种水稻土的接种液分别用“SC”（由四川水稻土样品中提取的微生物）、 “JL”（由吉林水稻土样品中提取的微生物）和“JX”（由江西水稻土样品中提取的微生物）表示。
释放的 磷 浓度 /m-1gL Released P concentration
250
SC
JL
200
JX
150
100
50
0 0
10
20
30
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1.2 供试铁源 试验采用晶体磷酸铁为铁源，将其配制成含铁量为 581.2mg/L的悬液，用超声波分散。为了比较
磷酸铁的还原程度，试验中以人工合成的无定形氧化铁[ferrihydrite，用Fe(OH)3表示]作为对比。无 定 形 氧 化 铁 按 照 Schwertmann 的 方 法 合 成 [10] 。 制 备 的 Fe(OH)3 悬 液 用 AAS 法 测 定 的 铁 含 量 为 576.6mg/L。 1.3 微生物营养来源
83.79
9.112
由表 1 看出，不同来源的微生物所进行的铁还原反应的速率有所不同，来源于四川水稻土的微 生物（SC）导致的铁还原的速率最快，Vmax 为 14.68 mg/(L·d)，而吉林（JL）和江西水稻土的微生 物（JX）的铁还原速率(Vmax)分别为 7.172 和 9.112 mg/(L·d)。到培养结束时，接种四川和江西水 稻土的微生物的富集培养中累积的 Fe(II)相同，而接种吉林土的微生物的培养中 Fe(II)累积量则相 对较少。吉林和江西水稻土的微生物还原磷酸铁的潜力较大，表现为用 Logistic 方程拟合的最终 Fe(III)量计算的潜在铁还原率较高，可达到 82.23%和 83.79%，而接种四川水稻土微生物的处理仅
形态中，晶体态磷酸铁是Fe-P的重要组成部分。那么，淹水过程能否引起晶体态磷酸铁的迅速还原
呢？虽然普遍认为晶体磷酸铁具有一定的生物有效性，但目前仍缺少确切的实验数据证明晶体磷酸 铁的微生物还原潜力。对于土壤中铁的氧化还原过程研究主要集中在氧化铁矿物的转化，而针对晶 体态磷酸铁的研究资料较少。针对不同氧化铁的纯培养试验发现[6]，比表面积大的无定型氧化铁 （ferrihydrite）和弱晶体氧化铁（如纤铁矿，lepidocrocite）能够被铁还原微生物全部及部分还原， 而针铁矿和赤铁矿等晶体氧化铁的微生物还原速率极低。不同水稻土中的铁还原研究表明[7]，微生
混合培养中提供微生物生长所需的碳源为 10mmol/L的葡萄糖、乙酸盐和丙酮酸，氮源为 1.0g/L 的NH4Cl。为了强化微生物活性，设置了添加 5mmol/L的磷酸缓冲液[11]（KH2P04-K2HPO4摩尔比为 0.5809）的处理。微生物所需的其它元素和生长因子由接种液来提供。 1.4 试验方案及测定方法
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混合培养中晶体磷酸铁的异化还原能力
孙宏飞，曲 东*，张 磊
(西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌 712100)
[摘 要] 采用厌氧混合培养方法，以 3 种典型的水稻土浸提液作为接种液，研究了晶体磷酸铁的微生物还原过程。
以Fe(II)浓度及游离磷酸盐浓度变化为指标，探讨了不同来源的微生物导致的晶体磷酸铁还原反应及对不同碳源利