分子生物学前沿技术培训资料

分子生物学前沿技术

激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。

背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。

原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸

收峰接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上[2]。LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml 离心管相匹配。

机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.5~5.0毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验[3]。

EVA膜约100~200μm厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C，保持数毫秒后又迅速冷却，保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。

优缺点：LCM最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。结合组织结构特点以及所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，可以迅速获取大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为基础的

显微切割技术相比[4]，具有以下优点：(1)分离细胞速度快，无需精巧的操作技能；(2)捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较好地控制捕获细胞的特异性；(3)捕获细胞与塑料帽结合紧密，减少了组织损失的风险。相比而言，除了激光切割弹射微分离系统[5]以经染色的用于存档的切片也可被成功进行显微切割。

尽管LCM应用广泛，但对于常规染色、固定且不加盖玻片的组织切片，其视觉分辨率受到很大限制。而对于那些本身缺乏一定结构特点的复杂组织（如淋巴组织，广泛浸润的腺癌等），要准确分离出某一类细胞几乎是不可能的。Fend等[6]通过采用特殊染色，尤其是免疫组化方法，使目标细胞或想要去除的细胞变得更加醒目，从而解决了上述难题。

应用LCM，偶尔会出现无法将选择的细胞从切片上移走的情况，出现这种结果有两种原因：(1)细胞与热塑膜之间的粘合力不足，通常是由于组织未完全脱水或激光的能量设置过低造成的；(2)组织切片与载玻片间的粘合力过强，通常发生在显微切割干燥时间过长的冰冻切片。针对不同样本组织（包括免疫组化染色的组织切片），一些研究小组分别详尽报道了采用适合的处理方法，以达到最佳的显微切割条件[7]。

应用：LCM较以往的显微切割技术有了突破性的进展，现已广泛应用于肿瘤研究，包括前列腺癌[8]、肾癌、肺癌、甲状腺癌[9]、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、胶质瘤、恶性胸膜间皮瘤、淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM还成功应用于其它一些疾病

的研究中，如Crohn病[10]、肌萎缩性侧索硬化症[11]、子宫内膜异位症、获得性免疫缺陷综合征、结核病、丙型肝炎等。而应用LCM 所分离的组织也多种多样，包括单个细胞、单一细胞群（主要是癌巢）、血管等类型。

展望：LCM成功解决了组织异质性问题，且具有迅速、准确等诸多优点，已被广泛应用于肿瘤等疾病基因水平的研究中，并显示出了良好的应用前景[1]。但今后可能还需要以下几个主要方面的发展和完善：理论上，除上述组织及细胞以外，LCD还可应用于其他所有组织细胞（如脾脏巨噬细胞、肝脏Kuffer细胞等）的分离，但其各自的切片制备、染色等技术方法尚需要进行探索；开发相应的应用程序，仅需输入目标细胞或组织的特异性参数即可实现计算机自动控制LCD[12]，从而大大缩减所需的人力和时间；提高捕获单个细胞的精确度，以减少非目标组织的沾染；进一步优化快速免疫组化染色的步骤，改进DNA和 RNA抽提技术，实现从少量捕获细胞或组织中获得高质量的核酸。

变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）

原理：在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变