硒的分子结构 (2)

Reaction mechanism and molecular basis for selenium/sulfur discrimination of selenocysteine lyase.

硒/硫分离硒代半胱氨酸裂解酶的反应机理和分子基础。

该酶对l-硒代半胱氨酸表现出严格的底物特异性，对其同源的1-半胱氨酸没有活性。在柔性环上的Cys-375将1-硒代半胱氨酸而非1-半胱氨酸引导至活性位点中的正确位置和方向以引发催化反应。这些发现首次提供了理解如何将痕量含硒底物与生物系统中过量的含有同类硫的化合物区分开来的基础。

硒代半胱氨酸裂解酶（SCL）催化吡哆醛5'-磷酸依赖性从1-硒代半胱氨酸中去除硒以产生1-丙氨酸。提出该酶用于从含有硒代半胱氨酸残基的降解硒蛋白中回收微量营养素硒作为必需成分。该酶对l-硒代半胱氨酸表现出严格的底物特异性，对其同源的1-半胱氨酸没有活性。然而，尚不清楚酶如何区分硒代半胱氨酸和半胱氨酸。在这里，我们提出了大鼠硒代半胱氨酸裂解酶的机制研究。野生型和C375A突变体SCL的ESI-MS分析显示催化反应通过在催化必需的Cys-375残基上形成酶结合的硒硫化物中间体而进行。紫外- 可见光谱分析和与1-半胱氨酸复合的SCL的晶体结构证明该酶可逆地与1-半胱氨酸形成非生产性加合物。在柔性环上的Cys-375将1-硒代半胱氨酸而非1-半胱氨酸引导至活性位点中的正确位置和方向以引发催化反应。这些发现首次提供了理解如何将痕量含硒底物与生物系统中过量的含有同类硫的化合物区分开来的基础。

硒是哺乳动物正常功能所必需的微量元素（1）。它的化学性质与硫相似，需要在生物学上区别于代谢过程中硫含量丰富。在合成过程中含硒蛋白，硒被特异性地并入含硒系统酶，并最终进入uga密码子指示的新生多肽链（二）。由seryltrnasec和selenide合成硒代半胱氨酸trnasec的具体过程包括协调的顺序反应。硒磷酸合成酶（3，4），seryl-trna催化激酶（5）和硒代半胱氨酸合成酶（6，7）。但是，硒特异性底物识别的机制在这些酶中仍然未知。正常食品中最常见的硒源是蛋白质中的硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸（8）。上一个研究表明，硒代蛋氨酸通过反式硒化途径转化为硒代半胱氨酸（9，10）。特定硒代半胱氨酸裂合酶（SCL）5对硒代半胱氨酸的裂解是被认为是循环利用的关键代谢步骤硒代半胱氨酸，由含硒蛋白类。

SCL是一种催化5-磷酸吡哆醛（PLP）酶。从L-硒代半胱氨酸中除去硒，得到L-丙氨酸。在以前的研究中，我们确定并描述了SCL的特征。以猪肝（11）和柠檬酸杆菌（12）为首例区别作用于含硒化合物而不是其同源硫类似物的酶。cDNA克隆小鼠SCL（13）显示SCL属于V亚群。折叠转氨酶I型（14）。其中，总的来说哺乳动物SCL序列相似（30%）。半胱氨酸脱硫酶（13）。SCL和半胱氨酸脱硫酶催化相同类型的反应，即从硒代半胱氨酸或半胱氨酸中除去硒或硫，生成丙氨酸。尽管细菌半胱氨酸脱硫酶对半胱氨酸和硒代半胱氨酸都有活性。（15），SCL对硒代半胱氨酸有显著的特异性。机械和晶体结构研究表明半胱氨酸脱硫酶的反应包括在活性部位形成以半胱氨酸过硫酸盐形式存在的磺胺硫。酶（16-18）。硫从过硫酸盐转移到它的伙伴蛋白的半胱氨酸残基，如iscu（19），thi（20）、Tusa（21）和Sufe（22、23）与直接蛋白质-蛋白质相互作用，从而确保过硫酸盐硫向最终目标分子（如铁硫簇、硫胺和硫化核苷，细胞内无活性硫非特异性扩散（24）。尽管SCL在这个位置有一个保守的半胱氨酸残基。对应于过硫酸盐形成的半胱氨酸残基半胱氨酸脱硫酶，其在催化作用中的作用酶尚未建立。在这里，我们研究了大鼠SCL的机制。现场指导野生型和C375A诱变和ESI-MS 研究SCL的突变表明，cys-375对细胞的活性至关重要。SCL是半胱氨酸硒化物形成的部位。以非生产性加合物形式与L-半胱氨酸络合的SCL的紫外可见光谱分析和晶体结构表明硒代半胱氨酸鉴别的结构基础和半胱氨酸。紫外可见光谱分析表明Cys-375的损失导致了与硒代半胱氨酸形成非生产性加合物，表明Cys-375作为指导，引导底物以适当的方向进行催化反应。

结果

大鼠SCL的纯化及性质研究为了获得从小鼠肝脏（13）克隆的SCL晶体不成功，我们构建了大鼠SCL的表达系统。将重组SCL纯化至同质性。稳态动力学分析显示L-硒代半胱氨酸为26 molmin1。mg1和5.5毫米，分别（补充图S1）。这种酶没有显示对L-半胱氨酸的可检测活性（在5-50 mm处检测）。抑制研究表明，L-半胱氨酸具有竞争性。酶抑制剂与Ki 9.6 mm （补充图S1）。因此，SCL的基本性质与那些报告的酶来自猪（11）和老鼠（13）。cys-375-scl 的作用具有一个保守的半胱氨酸残基，对应于半胱氨酸脱硫酶中形成过硫酸盐的半胱氨酸残基（补充图S2）（16，35）。为了研究保存的半胱氨酸残基在SCL中的作用，我们制备了一种突变的SCL蛋白（C375A），其中cys-375在SCL中表达。被丙氨酸残余物替代。纯化的C375A 突变体对L-硒代半胱氨酸无活性，提示cys-375是一种类似于保守催化半胱氨酸残基半胱氨酸脱硫酶（35）。

ESI-MS法分析硒代苯磺酸盐中间体，进一步阐明CYS-375的催化作用，形成一种SCL 结合的硒代过硫酸盐中间产物经电喷雾质谱分析。观察到的质量野生型（47273 da）和突变型（47243 da）SCL与计算的质量一致。从氨基酸序列（分别为47261和47229 da）在ESI-MS 可接受误差范围内测量（0.1%）（图1、a和D）。野生型SCL的孵化用L-硒代半胱氨酸导致一个新物种的形成质量为[m 80]（图1c）。相反，与L-半胱氨酸孵育没有形成这样的物种（图1b）。数据表明[M 80]物种与硒结合。SCL的形式。用L-硒代半胱氨酸或L-半胱氨酸培养的C375A突变体没有产生[M 80]分子（图1，e和f），表明从L-硒代半胱氨酸中消除的硒以a 的形式与酶的cys-375结合。半胱氨酸亚硒酸盐中间体（SCL-S-SE）。紫外可见光谱分析SCL 显示吸收最大416纳米，这是内部特征plp酶的醛亚胺形式。将SCL与L-硒代半胱氨酸一起孵育，可显著提高细胞的吸收率。420纳米（图2a）。相反，L-半胱氨酸添加到酶引起的吸收峰在416纳米，伴随着350纳米的增加（图2b）。用D-半胱氨酸、D-硒代半胱氨酸或2-巯基乙醇孵育也会导致吸收峰从416纳米移动到416纳米。以与在酶中观察到的相同方式达到330–340纳米。用L-半胱氨酸孵育（数据未显示）。这些结果表明L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、D-硒代半胱氨酸和2-巯基乙醇可以进入酶的活性部位，影响吸收。PLP部分的性质，即使它们不作为酶的底物。有趣的是，c375a突变酶用L-硒代半胱氨酸或L-半胱氨酸培养也显示出一个峰值。从416纳米移动到350纳米（图2，c和d）。这些结果表明，cys-375对底物L-硒代半胱氨酸的正确捕获至关重要。

总体结构SCL的总体结构如图3a.多肽链折叠成二聚体形式每个亚单位由小的（从N端到LEU-30和从THR-306到C末端）和大的（从glu-31到glu-305）结构域。小域具有一个/结构，由两股平行线组成-三股反平行薄板-薄板和六个螺旋（补充图S3b）。大领域

显示典型/结构其中七股平行股（s2–S8），除了S8，形成一个开口由六个螺旋围绕的核心扭曲的薄片溶剂侧和双螺旋蛋白质方面。七层薄板构成了结合辅酶PLP的活性位点，具有PLP依赖性折叠Ⅰ型酶（14，36）。这个分子有两个活性部位围绕分子2折叠轴形成空腔。每个空腔都位于在一个亚单位的域界面和亚单位界面。使用了Dali（37）程序

检测具有三维结构最类似于无门的来自PLP依赖者之间的SCL蛋白质中折叠I型酶数据库。最高的Z分数被计算为62.4对于人类SCL（尚未发布的结构，PDB）2hdy），49.5用于大肠杆菌ISCS（38），48.2用于嗜热菌MaritimaNifs样蛋白（39），40.6用于同囊孢子虫PCC 6803 SUF（40），38.9用于大肠杆菌CSDB（17，18），35.2用于同回声囊肿胱氨酸c-s裂合酶（41），荧光假单胞菌Kynureniase（42）为30.5。结果表明，SCL的结构相当复杂。与人的症状自评量表相似，与人的症状自评量表相似。I组半胱氨酸脱硫酶（ISCS和NIFS样蛋白）比第二组半胱氨酸脱硫剂（SUF和CSDB）（35、43）（图3b）。SCL将其整体结构从开放式改为

由小域作为刚性的3.8°旋转形成的闭合形式。半胱氨酸与活性部位缝隙结合形成的体

辅因子半胱氨酸复合物（图3a）。除了刚性体旋转的小区域，半胱氨酸结合诱导扩展叶的局