叶酸介导靶向砒霜纳米粒的实验研究
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
L IU H ai1 , ZHU L iang23 ( 1. D epa rtm en t of Pha rm acology, M ed ica l College of N anchang U n iversity, N anchang 330006, Ch ina; 2. College of Pha rm acology, Guangdong Pha rm acolog ica l U n iversity, Guangzhou 510006, Ch ina)
中药砒霜 (三氧化二砷 )是中药中的传统毒药 ,近年来有关 50 mg /m l牛血清白蛋白的 PBS溶液 ,搅拌下反应数小时即得 [3 ] 。
其抗肿瘤作用 ,尤其是在我国率先开展的三氧化二砷治疗急性早 将反应液过 Sephadex G - 25柱 ,收集前段淡黄色有乳光部分 [4 ] 。
幼粒细胞性白血病 (APL )的研究引起了人们的广泛兴趣 ;研究已 2. 1. 2 因素和水平的确定 经过查阅相关文献资料和大量的预
吸收 。标准曲线法定量 ,计算偶联率 。 偶联率 =被偶联被的偶牛联血的清叶白酸蛋量白/μ量g /mg
2. 1. 4 正交实验结果 按正交设计表 L9 (34 )进行实验 ,计算偶 联率 (见表 2) ,方差分析结果见表 3。
·666·
L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2008 VOL. 19 NO. 3
包裹有砒霜的 F - BSANP组对靶细胞的杀伤作用较非靶细 胞 、BSANP组和砒霜组明显 ,证明 F - BSANP对靶细胞具有特异 性杀伤作用 ;而包裹有砒霜的 F - BSANP组对靶细胞的杀伤作用 较叶酸阻断组明显也从侧面证明纳米粒的靶向性是通过叶酸介
△X
11. 22 55. 29 7. 12
X1 , X2 和 X3 分别是各因素水平 1、水平 2、水平 3偶联率之和 ; △X是 各因素内部水平 1、水平 2、水平 3偶联率之和的最大差距
表 3 方差分析表
间充质干细胞 [9 ] 。同法操作计算细胞抑制率 。结果见表 4。 用 t检验对实验结果进行分析 ,结果显示包裹砒霜的 F -
A
21. 536
B
509. 499
C
8. 581
e
16. 103
2
10. 768 1. 337
0. 428
3 讨论
2
254. 750 31. 640
0. 031
2
4. 290 0. 533
0. 652
本实验中选择人骨髓间充质干细胞作为对照用的非靶细胞 ,
2
8. 051
主要是因为人骨髓间充质干细胞具有很强的增殖分化能力 ,与肿
收稿日期 : 2007204224; 修订日期 : 2007209227 作者简介 :刘 海 (19832) ,男 (汉族 ) ,江西九江人 ,现为南昌大学医学院 药学系在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事靶向药物制剂研究工作.
3 通讯作者简介 :朱 亮 (19572) ,男 (汉族 ) ,江西抚州人 ,现任广东药学 院教授 ,硕士学位 ,主要从事靶向药物制剂的研究工作.
残疾和早死的主要疾病之一 。目前 ,临床使用的抗肿瘤化疗药物 血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司 ) ; RPM I 1640 培养基
均有较大的毒副作用 ,有些严重的毒副反应是限制药物剂量或使 ( Gibco) ;胰蛋白酶 1∶250 (Am resco) 。
用的直接原因 。研究发现 ,在多种肿瘤细胞 (如卵巢癌 、肺癌 、乳 2 方法和结果
时珍国医国药 2008年第 19卷第 3期
L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2008VOL. 19 NO. 3
叶酸介导靶向砒霜纳米粒的实验研究
刘 海 1 , 朱 亮 23
(1. 南昌大学医学院 ,江西 南昌 330006; 2. 广东药学院药科学院 ,广东 广州 510006)
关键词 :砒霜 ; 纳米粒 ; 叶酸 ; 牛血清白蛋白 中图分类号 : R285. 5 文献标识码 : B 文章编号 : 100820805 (2008) 0320666202
Study on Prepara tion and Targetib ility of Fola te Receptor - m ed ia ted An titum or Nanop2 articles En trapp ing Arsen ic Tr iox ide
司 ) ; 1 - 乙基 - 3 - (3 - 二甲氨丙基 )碳二亚胺盐酸盐 (简称 EDC 白偶联率作为评价指标 。
·HCl) (上海三杰生物技术有限公司 ) ; Sephadex G - 25 ( Phar2
偶联率的测定 ,将叶酸偶联白蛋白溶于 pH7. 4的 PBS中 ,用
2. 5%的胰蛋白酶消化 2 h后离心取上清液于 358 nm 处测紫外
瘤细胞有相似之处 。
由表 3～4可见 ,在考察的 3个因素中 , EDC / folate影响最大
( P < 0. 05) ,而叶酸用量与反应时间几乎没有影响 ( P > 0. 05) ,叶 酸偶联白蛋白合成工艺最佳水平组合为 A3B3 C1 ,以该工艺制备 的叶酸偶联白蛋白的叶酸偶联率为 30. 31μg/mg。
BSANP对靶细胞的抑制作用较非靶细胞明显 ; 较 BSANP组 ,叶 酸阻断组与砒 霜 组 也 显 示 出 非 常 高 的 抑 制 作 用 , 差 异 具 有 显 著性 。
表 4 靶细胞与非靶细胞的抑制率 ( x ±s)
%
组别
靶细胞
非靶细胞
F - BSANP ( 10 μg·m l - 1 ) F - BSANP ( 1 μg·m l - 1 ) F - BSANP ( 0. 1μg·m l - 1 )
腺癌 、结直肠癌等 )膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一 2. 1 叶酸偶联白蛋白的合成
般正常细胞 ,这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定 2. 1. 1 叶酸偶联白蛋白的合成与分离 将叶酸溶于 pH7. 4 的
了基础 [1 ] 。
磷酸缓冲液 ( PBS)中 ,加入 EDC·HCl后搅拌活化 5 m in,再加入
摘要 :目的 研究叶酸偶联牛血清白蛋白的合成工艺 ,制备包裹砒霜的白蛋白纳米粒并检验其对靶细胞的杀伤作用 。方
法 叶酸在缩合剂的作用下与牛血清白蛋白偶联 ,通过正交设计选择最佳配方 ;用去溶剂法制备包裹砒霜的纳米粒 ,并观 察其对靶细胞特异性杀伤作用 。结果 采用最佳条件合成的叶酸偶联牛血清白蛋白的偶联率为 30. 31 μg/mg,纳米粒的 砒霜包封率为 10. 3% ,对靶细胞杀伤率为 97% ,对非靶细胞的杀伤力仅为 23%。结论 包裹有砒霜的叶酸偶联牛血清白 蛋白纳米粒 (简称 F - BSANP)对靶细胞有特异性杀伤作用 。
表 1 因素水平
白蛋白制成的纳米粒中 ,并进行其对靶细胞杀伤作用的研究 。为 以后制备其它抗癌药靶向制剂作铺垫 。 1 材料
人肺癌细胞株 A549 (购于武汉大学生命科学院中国典型培 养物保藏中心 ) ;人骨髓间充质干细胞 ;分离自正常人骨髓血 (骨
水平
1 2 3
A 叶酸用量 m / g
4 6 8
B EDC / tolate摩尔比
A bstra ct:O bjective To study the synthetic p rocedure of folate - conjugated bovine serum album in ( F - BSA ) and p reparation of album in nanoparticles entrapp ing arsenic trioxide, and to exam ine the peculiar toxicity of nanoparticles on targeting cells. M eth2
odsFolic acid was conjugated to bovine serum album in via condensing agent, we studied the best synthetic formula of F - BSA by
the orthogonal test design. The nanoparticles were p repared by desolvation method, and the peculiar toxicity of F - BSANP on A549 was studied. Results The average conjugating rate of folate in F - BSA made in the best formula was 30. 31μg/mg. The entrapp ing rate of arsenic trioxide was 8. 34%. W e exam ined the peculiar toxicity of F - BSANP on targeting cells and control group cells, re2 spectively, and the death rate of targeting cells was 97 percent , whereas that of control group was only 23 percent. Conclusion F
22. 6 ±2. 7 12. 8 ±2. 5 5. 2 ±1. 8 18. 1 ±4. 3 10. 2 ±1. 0 9. 0 ±0. 8
与正常细胞比较 , 3 P < 0. 01, 3 3 P > 0. 05; a与 b, c, d及 c与 d比较 ,
Factors
SS
v
MS
F
P
P < 0. 01; n = 8
时珍国医国药 2008年第 19卷第 3期
表 2 正交设计
(BSANP)组 (1μg/m l) 、砒霜组 ( 1μg /m l) 。培养 24 h后 , M TT法
编号
因素 A B C D
偶联率 C /μg·mg - 1
测定各孔及本底 A490,计算细胞抑制率 。 取正常人骨髓血 3 m l,培养数天后分离贴壁细胞即得人骨髓
- B SANP is peculiar to their targeting - cells.
Key words:A rsenic trioxide; Nanoparticles; Folate; Bovine serum album in
肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病 ,是导致 macia) ;三氧化二砷 (购自上海化学试剂采购供应站 , CP) ;胎牛
砒霜 ( 1 μg·m l - 1 ) BSANP ( 1μg·m l - 1 ) 叶酸阻断 ( 1μg·m l - 1 )
96. 9 ±2. 23 71. 8 ±2. 13 a 29. 7 ±1. 43 16. 7 ±5. 43 3 b 13. 5 ±3. 23 3 c 21. 0 ±2. 23 d
2 ∶1 4 ∶1 6 ∶1
C 反应时间 t / h
2 4 6
髓血样由南昌大学医学院一附院血液科提供 ) ; 牛血清白蛋白 2. 1. 3 评价指标的选取与测定 叶酸与牛血清白蛋白偶联越
(上海新量化工试剂有限公司 ) ;叶酸 (上海新量化工试剂有限公 多 ,纳米粒对肿瘤的靶向性就越高 。因此选择叶酸与牛血清白蛋
发现砒霜能显著抑制人肺癌的细胞生长并诱导其凋亡 [2 ] 。但 实验最终确定叶酸用量 、EDC ·HCl与叶酸摩尔比 、反应时间 3
是 ,在治疗过程中 的 严 重 毒 副 作 用 是 影 响 其 抗 癌 疗 效 的 主 要 因素各取 3水平优化工艺 。见表 1。
原因 。 本实验以传统中药砒霜为治疗药物 ,将其包裹在用叶酸偶联
1
1
1
1
1
9. 07
Fra Baidu bibliotek
2
1
2
2
2
14. 59
3
1
3
3
3
22. 25
4
2
1
2
3
7. 66
5
2
2
3
1
18. 34
6
2
3
1
2
27. 10
7
3
1
3
2
7. 64
8
3
2
1
3
19. 18
9
3
3
2
1
30. 31
X1
45. 91 24. 37 55. 35
X2
53. 10 52. 11 52. 56
X3
57. 13 79. 66 48. 23
中药砒霜 (三氧化二砷 )是中药中的传统毒药 ,近年来有关 50 mg /m l牛血清白蛋白的 PBS溶液 ,搅拌下反应数小时即得 [3 ] 。
其抗肿瘤作用 ,尤其是在我国率先开展的三氧化二砷治疗急性早 将反应液过 Sephadex G - 25柱 ,收集前段淡黄色有乳光部分 [4 ] 。
幼粒细胞性白血病 (APL )的研究引起了人们的广泛兴趣 ;研究已 2. 1. 2 因素和水平的确定 经过查阅相关文献资料和大量的预
吸收 。标准曲线法定量 ,计算偶联率 。 偶联率 =被偶联被的偶牛联血的清叶白酸蛋量白/μ量g /mg
2. 1. 4 正交实验结果 按正交设计表 L9 (34 )进行实验 ,计算偶 联率 (见表 2) ,方差分析结果见表 3。
·666·
L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2008 VOL. 19 NO. 3
包裹有砒霜的 F - BSANP组对靶细胞的杀伤作用较非靶细 胞 、BSANP组和砒霜组明显 ,证明 F - BSANP对靶细胞具有特异 性杀伤作用 ;而包裹有砒霜的 F - BSANP组对靶细胞的杀伤作用 较叶酸阻断组明显也从侧面证明纳米粒的靶向性是通过叶酸介
△X
11. 22 55. 29 7. 12
X1 , X2 和 X3 分别是各因素水平 1、水平 2、水平 3偶联率之和 ; △X是 各因素内部水平 1、水平 2、水平 3偶联率之和的最大差距
表 3 方差分析表
间充质干细胞 [9 ] 。同法操作计算细胞抑制率 。结果见表 4。 用 t检验对实验结果进行分析 ,结果显示包裹砒霜的 F -
A
21. 536
B
509. 499
C
8. 581
e
16. 103
2
10. 768 1. 337
0. 428
3 讨论
2
254. 750 31. 640
0. 031
2
4. 290 0. 533
0. 652
本实验中选择人骨髓间充质干细胞作为对照用的非靶细胞 ,
2
8. 051
主要是因为人骨髓间充质干细胞具有很强的增殖分化能力 ,与肿
收稿日期 : 2007204224; 修订日期 : 2007209227 作者简介 :刘 海 (19832) ,男 (汉族 ) ,江西九江人 ,现为南昌大学医学院 药学系在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事靶向药物制剂研究工作.
3 通讯作者简介 :朱 亮 (19572) ,男 (汉族 ) ,江西抚州人 ,现任广东药学 院教授 ,硕士学位 ,主要从事靶向药物制剂的研究工作.
残疾和早死的主要疾病之一 。目前 ,临床使用的抗肿瘤化疗药物 血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司 ) ; RPM I 1640 培养基
均有较大的毒副作用 ,有些严重的毒副反应是限制药物剂量或使 ( Gibco) ;胰蛋白酶 1∶250 (Am resco) 。
用的直接原因 。研究发现 ,在多种肿瘤细胞 (如卵巢癌 、肺癌 、乳 2 方法和结果
时珍国医国药 2008年第 19卷第 3期
L ISH IZHEN MED IC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2008VOL. 19 NO. 3
叶酸介导靶向砒霜纳米粒的实验研究
刘 海 1 , 朱 亮 23
(1. 南昌大学医学院 ,江西 南昌 330006; 2. 广东药学院药科学院 ,广东 广州 510006)
关键词 :砒霜 ; 纳米粒 ; 叶酸 ; 牛血清白蛋白 中图分类号 : R285. 5 文献标识码 : B 文章编号 : 100820805 (2008) 0320666202
Study on Prepara tion and Targetib ility of Fola te Receptor - m ed ia ted An titum or Nanop2 articles En trapp ing Arsen ic Tr iox ide
司 ) ; 1 - 乙基 - 3 - (3 - 二甲氨丙基 )碳二亚胺盐酸盐 (简称 EDC 白偶联率作为评价指标 。
·HCl) (上海三杰生物技术有限公司 ) ; Sephadex G - 25 ( Phar2
偶联率的测定 ,将叶酸偶联白蛋白溶于 pH7. 4的 PBS中 ,用
2. 5%的胰蛋白酶消化 2 h后离心取上清液于 358 nm 处测紫外
瘤细胞有相似之处 。
由表 3～4可见 ,在考察的 3个因素中 , EDC / folate影响最大
( P < 0. 05) ,而叶酸用量与反应时间几乎没有影响 ( P > 0. 05) ,叶 酸偶联白蛋白合成工艺最佳水平组合为 A3B3 C1 ,以该工艺制备 的叶酸偶联白蛋白的叶酸偶联率为 30. 31μg/mg。
BSANP对靶细胞的抑制作用较非靶细胞明显 ; 较 BSANP组 ,叶 酸阻断组与砒 霜 组 也 显 示 出 非 常 高 的 抑 制 作 用 , 差 异 具 有 显 著性 。
表 4 靶细胞与非靶细胞的抑制率 ( x ±s)
%
组别
靶细胞
非靶细胞
F - BSANP ( 10 μg·m l - 1 ) F - BSANP ( 1 μg·m l - 1 ) F - BSANP ( 0. 1μg·m l - 1 )
腺癌 、结直肠癌等 )膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一 2. 1 叶酸偶联白蛋白的合成
般正常细胞 ,这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定 2. 1. 1 叶酸偶联白蛋白的合成与分离 将叶酸溶于 pH7. 4 的
了基础 [1 ] 。
磷酸缓冲液 ( PBS)中 ,加入 EDC·HCl后搅拌活化 5 m in,再加入
摘要 :目的 研究叶酸偶联牛血清白蛋白的合成工艺 ,制备包裹砒霜的白蛋白纳米粒并检验其对靶细胞的杀伤作用 。方
法 叶酸在缩合剂的作用下与牛血清白蛋白偶联 ,通过正交设计选择最佳配方 ;用去溶剂法制备包裹砒霜的纳米粒 ,并观 察其对靶细胞特异性杀伤作用 。结果 采用最佳条件合成的叶酸偶联牛血清白蛋白的偶联率为 30. 31 μg/mg,纳米粒的 砒霜包封率为 10. 3% ,对靶细胞杀伤率为 97% ,对非靶细胞的杀伤力仅为 23%。结论 包裹有砒霜的叶酸偶联牛血清白 蛋白纳米粒 (简称 F - BSANP)对靶细胞有特异性杀伤作用 。
表 1 因素水平
白蛋白制成的纳米粒中 ,并进行其对靶细胞杀伤作用的研究 。为 以后制备其它抗癌药靶向制剂作铺垫 。 1 材料
人肺癌细胞株 A549 (购于武汉大学生命科学院中国典型培 养物保藏中心 ) ;人骨髓间充质干细胞 ;分离自正常人骨髓血 (骨
水平
1 2 3
A 叶酸用量 m / g
4 6 8
B EDC / tolate摩尔比
A bstra ct:O bjective To study the synthetic p rocedure of folate - conjugated bovine serum album in ( F - BSA ) and p reparation of album in nanoparticles entrapp ing arsenic trioxide, and to exam ine the peculiar toxicity of nanoparticles on targeting cells. M eth2
odsFolic acid was conjugated to bovine serum album in via condensing agent, we studied the best synthetic formula of F - BSA by
the orthogonal test design. The nanoparticles were p repared by desolvation method, and the peculiar toxicity of F - BSANP on A549 was studied. Results The average conjugating rate of folate in F - BSA made in the best formula was 30. 31μg/mg. The entrapp ing rate of arsenic trioxide was 8. 34%. W e exam ined the peculiar toxicity of F - BSANP on targeting cells and control group cells, re2 spectively, and the death rate of targeting cells was 97 percent , whereas that of control group was only 23 percent. Conclusion F
22. 6 ±2. 7 12. 8 ±2. 5 5. 2 ±1. 8 18. 1 ±4. 3 10. 2 ±1. 0 9. 0 ±0. 8
与正常细胞比较 , 3 P < 0. 01, 3 3 P > 0. 05; a与 b, c, d及 c与 d比较 ,
Factors
SS
v
MS
F
P
P < 0. 01; n = 8
时珍国医国药 2008年第 19卷第 3期
表 2 正交设计
(BSANP)组 (1μg/m l) 、砒霜组 ( 1μg /m l) 。培养 24 h后 , M TT法
编号
因素 A B C D
偶联率 C /μg·mg - 1
测定各孔及本底 A490,计算细胞抑制率 。 取正常人骨髓血 3 m l,培养数天后分离贴壁细胞即得人骨髓
- B SANP is peculiar to their targeting - cells.
Key words:A rsenic trioxide; Nanoparticles; Folate; Bovine serum album in
肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病 ,是导致 macia) ;三氧化二砷 (购自上海化学试剂采购供应站 , CP) ;胎牛
砒霜 ( 1 μg·m l - 1 ) BSANP ( 1μg·m l - 1 ) 叶酸阻断 ( 1μg·m l - 1 )
96. 9 ±2. 23 71. 8 ±2. 13 a 29. 7 ±1. 43 16. 7 ±5. 43 3 b 13. 5 ±3. 23 3 c 21. 0 ±2. 23 d
2 ∶1 4 ∶1 6 ∶1
C 反应时间 t / h
2 4 6
髓血样由南昌大学医学院一附院血液科提供 ) ; 牛血清白蛋白 2. 1. 3 评价指标的选取与测定 叶酸与牛血清白蛋白偶联越
(上海新量化工试剂有限公司 ) ;叶酸 (上海新量化工试剂有限公 多 ,纳米粒对肿瘤的靶向性就越高 。因此选择叶酸与牛血清白蛋
发现砒霜能显著抑制人肺癌的细胞生长并诱导其凋亡 [2 ] 。但 实验最终确定叶酸用量 、EDC ·HCl与叶酸摩尔比 、反应时间 3
是 ,在治疗过程中 的 严 重 毒 副 作 用 是 影 响 其 抗 癌 疗 效 的 主 要 因素各取 3水平优化工艺 。见表 1。
原因 。 本实验以传统中药砒霜为治疗药物 ,将其包裹在用叶酸偶联
1
1
1
1
1
9. 07
Fra Baidu bibliotek
2
1
2
2
2
14. 59
3
1
3
3
3
22. 25
4
2
1
2
3
7. 66
5
2
2
3
1
18. 34
6
2
3
1
2
27. 10
7
3
1
3
2
7. 64
8
3
2
1
3
19. 18
9
3
3
2
1
30. 31
X1
45. 91 24. 37 55. 35
X2
53. 10 52. 11 52. 56
X3
57. 13 79. 66 48. 23