碱性磷酸酶的分离提取课件
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。
碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1
试剂（ml）
生理盐水 标准蛋白溶液 样品 考马斯亮蓝试剂
空白管
0.1标Biblioteka 管ABC0.1 A2液0.1 5.0 5.0 5.0 B2液0.1 5.0 C2液0.1 5.0
室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量=A样品/A标准×C标准×稀释倍数
目录
3. 结果处理与分析
结果处理表
酶活性计算 体积 (ml) A 值
目录
检测酶提取纯化的指标
1. 酶的纯度： 用比活性代表（单位重量蛋白质样品中 的活性单位） 2. 酶的回收效率 所含酶
※在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的回收率
目录
实验内容
酶的提取及比活性测定
目录
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 的分离纯化及比活性测定
[目的] 1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注 意事项 2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。
25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液）
A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性
A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度
+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （3000rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃）
蛋白含量计算 酶的总 活性 （ U） A 值
稀 释 倍 数
酶活性 (U/ml)
稀 释 倍 数
比活 酶的 性 蛋白浓度 得率 (U/mg) (mg/ml)
A 液 B液
4 2.2
100%
C液
2
目录
碱性磷酸酶的分离纯化鉴定PPT演示课件
蒸馏水
0.1
BCA试剂
1.5
/
标准管
/ 0.1 / 1.5
50 20
AB
0.1 0.1 // // 1.5 1.5
5
1
CD
0.1 0.1 // //
1.5 1.5
37保温 30分钟 562nm 比色
蛋白含量（mg/ml） =
A样 ×0.2 ×稀释倍数 A标
蛋白标准液浓度
19
计算
样品的酶活性单位 碱性磷酸酶比活性（U/mg） =
碱性磷酸酶的分离纯化
有机溶剂分步沉淀法
1
分离纯化的一般程序
选择材AKP溶于30%乙醇、33%丙酮（上清中）， AKP不溶于60%乙醇、50%丙酮（沉淀中），
3
操作
一、取材及匀浆
取兔肝2g，剪碎， 加入6ml 0.01mol/L醋酸镁和醋酸钠混合液，充分 匀浆。 记录体积 （取0.1ml至一新EP管留作A液，测定时稀释25倍）
红色醌式化合物
16
稀释倍数 (PH8.8tris醋酸镁溶液 ） /
/
25 10 5
1
单位（ml）
空白管 标准管 A B C D
各阶段稀释液
/
/
酚标准液（0.1mg/ml） / 0.1
Tris-醋酸镁
0.1 /
复合底物液
3
3
0.1 0.1 0.1 0.1 //// //// 3 333
37保温 15分钟 各管加入铁氰化钾液2ml，静置15min
紫外分光光度计（200－400nm） 可见光分光光度计（400－760nm） 红外分光光度计（760－1000nm）
9
2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
生化实验碱性磷酸酶的提取与鉴定
实验中的问题与改进
通过总结实验中的问题 并寻找改进方法，我们 可以提高实验效率和准 确性，从而更好地完成 生化实验任务并为未来 的研究打下坚实基础
生化实验:碱性 磷酸酶的提取与
鉴定
1 实验目的 3 实验步骤 5 实验结论 7 实验思考与拓展 9 实验中的问题与改进
-
2 实验原理 4 结果分析 6 实验讨论与改进 8 实验总结
1
实验目的
实验目的
本实验旨在学习 掌握碱性磷酸酶 的提取与鉴定方 法，了解其理化 性质及生物学意 义
2
实验原理
实验原理
该酶的理化性质及生物学意义，还锻炼了我们的实验操作技巧和处理生化样品的能力
2
通过实验，我们认识到碱性磷酸酶作为一种重要的生物酶，在生物体内发挥着参与物质代谢、能量转 化等重要生物学功能。此外，该酶在临床诊断、生物工程和环境监测等领域也具有广泛的应用价值
在实验过程中，我们需要注意实验细节和试剂的正确使用，以保证实验结果的准确性和可靠性。例如，
4
结果分析
结果分析
通过本实验，我们成功地提取并鉴 定了碱性磷酸酶
实验结果显示，该酶具有较高的活 性，且蛋白质浓度符合预期
通过本实验，我们掌握了碱性磷酸 酶的提取与鉴定方法，了解了其理 化性质及生物学意义
同时，实验过程中需要注意操作细 节和试剂的正确使用，以保证实验
结果的准确性和可靠性
5
实验结论
实验中的问题与改进
在实验过程中，我们可能会遇到一
01
些问题，例如提取的酶活性不高、
设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案
AKP纯化程度鉴定
• 纯化程度用酶的比活性反应。
• 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
碱性磷酸酶的活性测定 磷酸笨二钠法
• 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸 氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素 原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。
• 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。
离子交换层析法的原理
• 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的 高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集 团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有 亲水性。 • 由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分 子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作 用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子 因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。
实验原理
1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。 2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除 去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。 3. 有机溶剂分步沉淀法纯化
有机沉淀法
• 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性 磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和 其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心 2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。
立即混匀后使用台式低速离心机离心 5min(2000 r/min)，弃上清液。
向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液， 充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清 液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％， 混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。 向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去 沉淀
实验三 碱性磷酸酶的分离纯化和Km
AKP
磷酸苯二钠 PH 10
磷酸盐 + 酚
铁氰化钾 酚 + 4-氨基安替比林 碱性 红色醌类衍生物
利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活 性（A），按 Lieweaver-Burk 二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其 Km 值。
三、实验仪器及试剂
仪器： 恒温水浴锅，721 型分光光度计。 试剂： 1. 0.04mol/L 作用物液：称取 10.16g 磷酸苯二钠 （C6H5PO4Na2· 2H2O），用 煮沸后冷却的蒸溜水溶解， 并稀释 至 1,000ml， 4ml 氯仿防腐， 加 贮于棕色瓶内， 置冰箱内保存， 可用一周。
• 将分离提取的硷性磷酸分装成 2ml 瓶，冰 冻干燥保存或液体保存也可，但 均置于60℃低温冰箱保存。应用时稀释 5—7 倍测 其 Km 值。
第二部分 碱性磷酸酶Km测定
一、实验目的
掌握碱性磷酸酶的的动力学鉴定—Km 鉴定
二、实验原理
• 当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度 随作用物浓度[S]增 大而增大，但增大到一定限度时，作 用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此 时反应速度为 最大速度（Vmax）。Michaelis Menten 对酶促反应速度与
• 试剂：
1 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至 1000
m1。 2 3 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至 1000 m1。 0.0lmol/L 醋酸镁-0.01mol/L 醋酸钠溶液： 准确吸取 20ml0.5mol/L 醋 酸 镁溶液及 100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至 1000 m1。 4 Tris-HCl pH8.8 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷 12.1g，用蒸馏水溶解 后 定容至 1000mL，即为 0.1mol/LTrls 溶液。取 100m1 0.1mol/LTrls 溶 液，加蒸 馏水约 780mL，再加 0.1mol/L 醋酸镁溶液 100m1，混匀后 用 1％冰醋酸调 pH 为 8.8，用蒸馏水定容至 l000m1。 5 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质
碱性磷酸酶的底物特异性与其结 构有关，通过对其结构的研究可 以了解其与底物识别的机制。
04 碱性磷酸酶的应用
在生物工程中的应用
生产生物催化剂
碱性磷酸酶可以作为生物催化剂，在生物工程中用于合成磷酸酯 、脱氧核糖核酸等物质。
蛋白质水解
碱性磷酸酶可以催化蛋白质水解为氨基酸，为蛋白质工程提供原 料。
生产药物
某些物质可以抑制碱性磷酸酶的活性，这种抑制作用可以是非竞争性抑制或竞争性抑制，非竞争性抑制的抑制剂与底物不竞争结合酶的活性位点，而竞争性 抑制的抑制剂则与底物竞争结合酶的活性位点。
酶的稳定性与活性
温度稳定性
碱性磷酸酶在一定温度范围内是稳定的，但 在高温下会失去活性。
pH稳定性
碱性磷酸酶在一定的pH范围内是稳定的， 但在酸性或碱性条件下会失去活性。
金属离子稳定性
某些金属离子可以增强碱性磷酸酶的稳定性 ，如钙离子和镁离子。
活性测定
通过测定碱性磷酸酶催化底物水解的速率可 以确定其活性。
酶的底物特异性
01
底物种类
碱性磷酸酶可以水解多种磷酸酯 ，但其对底物的特异性有所不同 。
02
03
底物特异性
结构与功能关系
不同来源的碱性磷酸酶对底物的 特异性有所不同，有些酶对某些 底物具有更高的催化活性。
碱性磷酸酶可以用于生产药物，如抗肿瘤药物、抗生素等。
在医学诊断中的应用
肝功能检查
碱性磷酸酶是肝功能检查的重要指标之一，可以反映 肝细胞的损伤程度。
骨骼疾病诊断
碱性磷酸酶升高可能与骨骼疾病有关，如骨肉瘤、骨 折等。
肿瘤转移监测
肿瘤细胞转移时，碱性磷酸酶水平会升高，因此可以 用于肿瘤转移的监测。
碱性磷酸酶的分离纯化-袁野20101009
50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min，弃上 清 （3）沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。 作为D液用于比活性测定。
用于活性测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将 A液稀释25倍、B液稀释10倍、 C液稀释5倍， D液不稀释。
酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶 活性。
(三)碱性磷酸酶的蛋白含量测定
BCA法测定AKP蛋白浓度
BCA (bicinchoninic acid, 二喹啉甲酸)
Protein + Cu2+
OH-
BCA 试剂
Cu+
紫色复合物
1. 取试管6支编号（体积单位为ml）
管号
空白
酶液体
蛋白标准液
Tris-Mg(AC)2 0.1
每步总活力 初提液总活力（A液体）
分离 阶段
A B C D
蛋白质 酶活性 比活性 mg/ml U/ml U/mg
纯化 倍数
得率
9. 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好， 清洗比色杯并晾干。
使用分光光度计的注意事项
1. 分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随 意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶 干燥袋，需定期更换。
2. 开机预热15分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定 期进行波长校准。
酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、 最适的pH、必要的激动剂等），一定的时间 内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗 量或产物的生成量来确定。
AKP
磷酸苯二钠
磷酸盐 + 酚
酚 + 4-氨基安替比林
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定项目名称碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定xinpingzhao@实验目的1. 了解酶提取纯化的基本实验技术;2. 掌握碱性磷酸酶酶活力及比活力的测定方法实验材料新鲜兔肝或兔肾主要仪器设备匀浆器,冷冻离心机,分光光度计,电子天平等.实验原理碱性磷酸酶（简称AKP）在磷酸盐代谢中起重要作用。
核酸序列分析、DNA重组技术、酶标免疫检测技术以及临床检验中都需要利用此酶。
本实验取材于兔肝，经匀浆、正丁醇抽提、硫酸胺分段盐析或者有机溶剂沉淀，获得碱性磷酸酶制品。
本实验采用对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物的方法测定酶活。
对硝基苯磷酸二钠在碱性磷酸酶的作用下被水解为游离磷酸及对硝基苯酚，对硝基苯酚在强碱性条件下显示亮黄色，在405nm处有强烈的吸收峰。
因此可以测定405nm处的吸收值A405nm来计算产物的生成量，从而计算出酶活力，然后通过各级纯化步骤产物蛋白含量的测定,从而计算出酶的比活力.第一部分: 碱性磷酸酶的提取以下操作均在4℃进行。
方案一:1. 称取新鲜兔肝2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，按1:2（m/v）加入预冷的0.05mol/LTris-HCl （pH9.0）缓冲液，匀浆后4℃抽提20 min；4℃，8000r/min离心10min；取上清；此为A 液。
另取1支试管编号为A，取0.1mLA 液，加1.9mLTris缓冲液(pH 8.8)，混匀，供测酶活性用。
2.上清液中加入1/5体积预冷正丁醇脱脂20min；8000r/min离心10min，取上清；此为B液。
吸取0.1m1B 液，置于编号为B 的试管中，加入1.9m1Tris 缓冲液(pH 8.8)，供测酶活用。
3.加入硫酸铵至35%饱和度；4℃30 min；8000r/min离心10min，弃沉淀；取上清；此为C 液。
吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中，加入1.8m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测酶活性用4.然后在上清液中加入硫酸铵至75%饱和度，4℃静置30 min后8000r/min离心10min，得沉淀..用0.05mol/LTris-HCl（pH9.0）缓冲液溶解沉淀；此为D 液。
酶的提取和分离纯化-PPT课件
2.压力差破碎法
通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲 击、突然降压和渗透压差法等。
（1）高压冲击法是在结实的容器中装入菌体 细胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或冲击 锤加高压冲击之，使细胞破碎。冲击压力可达 每平方厘米几百至几千kg。
15
Manton-Gaulin homogeniser valve
32
11.5.1 根据溶解度不同进行的纯化
盐析法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性沉淀法 等电点沉淀法 液液分离法
33
一、盐析法
盐析法是最古老的，但也是目前仍广泛采用 的方法。
盐析法根据的原理是：球蛋白在低盐浓度的 溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大， 表现“盐溶(salting in)”的特性。但是当盐浓 度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度 又会先后以不同速度下降，分别“盐析 (salting out)沉淀析出。盐析纯化法就是根据 酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别 差别而建立的一种纯化方法。
此外可通过加入噬菌体去感染细胞，或通 过电离辐射等方法，使细胞自溶。
24
丙酮干粉的制备
破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetone powder)，一般程序是：
先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件 下，加入5~10倍预先冷至约-20 ℃的丙酮，迅速 搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。 丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁，另一方面 有利于除去大量的脂类杂质，同时还能使某些膜 结合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便 于保存。
6
酶分离纯化的工艺流程设计
设计时需要考虑的因素：
酶源材料 前期工艺过程 产品对纯度的要求 酶存在的状态 设备条件 动力、原料成本及工时费用
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定 ppt课件
定酶活性
保护和稳定AKP
Mg(Ac)2 ~ NaAc 混合液提取AKP pH 8.8 Tris 缓冲液测AKP活性
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
14
活性测定
三、操作步骤
2g新鲜兔肝剪碎→匀浆管
加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc 混合液2ml ，匀浆
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法；
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算；
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
4
活性测定
二、实验原理
1、 AKP概述
① 催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用 ②最适pH：8.6～10.3 ③ 特点：特异性低
AKP比活性（U/mg）=
每ml制剂中蛋白质含量（mg）
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比
27
活性测定
2、得率
每一制剂中总的酶活性单位
得率 =
其比
28
活性测定
3、纯化倍数
每一制剂AKP比活性（U/mg）
纯化倍数 =
溶液A制剂AKP比活性（U/mg）
30
活性测定
有机溶剂体积的计算——96%乙醇
VB/中加乙醇96%
30%
（VB/ + VX）× 30% = 96% × VX
VX = 0.45 VB/
VB/ /中加乙醇（96% ）从30%
60%
（VB/ / + VX）× 60% - VB/ / × 30% = 96% × VX
碱性磷酸酶的分离纯化
碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与定力学分析一、实验原理(一)碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP3.比活性的定义＊单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
＊通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
＊用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之一。
4.测定样品的比活性必须测定：＊每毫升样品中的酶活性单位数。
＊每毫升样品中的蛋白质毫克数。
5.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性测定AKP 4-氨基安替比林＊磷酸苯二钠→→酚→→→→醌衍生物（红色）铁氰化钾↓根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。
＊37℃保温15分钟产生1mg酚者为1个酶活性单位。
(二)底物浓度对AKP活性的影响K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。
因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V= 1/2 V max, K m = [S] ＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km 值。
双倒数作图法（三）PH对AKP活性的影响酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性最高时的pH，称为酶的最适pH，高于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。
不同酶的最适pH不同。
酶的最适pH不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。
（四）温度对AKP活性的影响酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。
通常温度每升高10℃，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。
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碱性磷酸酶的分离提取
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碱性磷酸酶的分离提取
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• 加入底物后, 立即混匀, 37 ℃ 准确15 min后加入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反 应, 混匀, 静置15 min , 510 nm比色
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•
• 酶活性单位（U/ml)=
A样 A标
*0.1*稀释倍数
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• 在悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30% （0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上 清液于另一离心管。
• 上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60% （0.85体积），混匀后3000r/min 5min，沉淀用 4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。
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碱性磷酸酶的提取
• 在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅 拌 2min，室温放置30min，纱布过滤，置于离心 管。
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碱性磷酸酶的纯化
• 滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后 3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5mol/L Mg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管， 待测比活性用。
为D液用于比活性测定。
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碱性磷酸酶的分离提取
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碱性磷酸酶活性的鉴定
磷酸苯二钠 AKP
磷酸盐 + 酚
酚 + 4-氨基安替比林 铁氰化钾 红色醌类衍生物
AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解 磷酸基团。最适pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为 激活剂。
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碱性磷酸酶的纯化
• 其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达
到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min，取 上清液丢弃沉淀。
• 上清液中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到
50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min。 • 沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。作
• 碱性磷酸酶（AKP）溶于30%乙醇或33% 丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成 沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离， 从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以 获得较高纯度的AKP。
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实验目的
1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、 分• 光等方法，从组织中分离纯化 及鉴定特定蛋白质的技能。 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技 术及鉴定的方法
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实验原理
❖碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二
• 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶
液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。
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碱性磷酸酶的提取
• 称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml, 进行匀浆。 将其转入离心管，并加2ml 0.01 mol/L的醋酸镁 及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心 管，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml 作为A液于EP管，待测比活性用。
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蛋白质含量测定基本原理 ——BCA法•碱源自磷酸酶的分离提取16•
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碱性磷酸酶的提取鉴定
朱** 金** 王** 何*
碱性磷酸酶的分离提取
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碱性磷酸酶
• 广泛存在于微生物界和动物界。碱性磷酸 酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，
产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可
以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷 酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
碱性磷酸酶的分离提取
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如何获取碱性磷酸酶