DNA限制性内切酶酶切反应
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析实验目的：通过限制性内切酶酶切分析，了解DNA的结构和特性，掌握限制性内切酶的使用方法，以及掌握DNAGel电泳技术。
实验原理：限制性内切酶是一类可切割DNA分子的酶，可特异性地识别DNA的特定核苷酸序列并切割它们。
限制性内切酶可以将DNA切割成特定大小的DNA片段，这些片段可以进一步用于基因克隆、DNA指纹分析、DNA测序、DNA杂交等。
将DNA和内切酶一起反应一段时间后，可以通过电泳将酶切后的DNA片段按大小分离，从而得出不同DNA序列的长度和特征，达到对DNA结构特点进行研究的目的。
实验步骤：1. 从实验室提供的细菌菌株中提取DNA样品。
2. 将DNA样品用水稀释到适当浓度。
3. 按照所选内切酶的说明书，将相应量的酶加入DNA样品中。
混匀并放在37℃的水浴中进行反应1-2小时。
4. 制备1%的琼脂糖凝胶。
5. 将酶切后的DNA和DNA加载缓冲液混合后，放入琼脂糖凝胶槽中。
6. 进行DNAGel电泳，根据DNA片段的大小，将DNA分离开。
7. 取出凝胶进行染色，直接观察或用紫外线透射方式扫描成像。
实验注意事项：1. 在实验室中需要严格遵守生物安全措施，避免污染。
2. 在进行内切酶酶切反应时，需要严格按照酶的使用方法进行操作，以保证反应质量和结果准确。
3. 在制备DNA样品时需要避免DNA的降解或氧化。
4. 在进行DNAGel电泳时需小心操作，以避免凝胶破损或电流过强，影响实验结果。
实验结果分析：通过限制性内切酶酶切分析后，可以得到DNA片段的长度和特征，从中了解到DNA的特性和结构。
实验结果需要根据实验方法、酶的选择等进行分析和总结，以便进一步推进科研工作。
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007）1、目的及适用范围利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。
2、主要试剂及仪器微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer3、操作步骤按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。
反应物体积（μL）灭菌水3DNA4010× Buffer K 5EcoR I1BamH I1总体积504、问题向导4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。
4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
21。
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。
梳子干净晾干有利于梳孔的形成。
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。
3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。
二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。
瓶子。
因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。
保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。
3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。
倒胶时尽量减少气泡的产生。
可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。
梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。
不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。
用枪头赶掉气泡。
高，导致背景太深。
摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。
高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。
4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。
时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。
暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。
电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。
实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。
限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。
实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。
2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。
3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。
4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。
实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。
每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。
实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。
通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。
如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。
2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。
如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。
如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。
3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。
酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。
如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。
实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。
这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。
DNA限制性内切酶酶切分析
DNA限制性内切酶酶切分析一、原理限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。
限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。
与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。
把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。
如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。
把目的基因与切开的载体DN A混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。
进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。
特定的酶有其配套的缓冲液。
进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。
二、目的了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。
三、材料、试剂与器具1、DNA样品。
2、限制性内切酶。
3、10×限制性内切酶反应缓冲液。
4、无菌双蒸水。
5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。
6、10×TBE buffer。
7、琼脂糖。
8、溴化乙锭溶液。
9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。
10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。
11、10mg/ml Rnase。
四、操作步骤1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。
2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：DNA样品 0.1-2mg10×内切酶反应缓冲液 1ml内切酶1 1ml内切酶2 1ml加无菌水至 10ml3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。
用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。
4、在37℃温育60－120分钟。
酶切反应原理
酶切反应原理酶切反应原理酶切反应是一种广泛应用于生物学、分子生物学、基因工程等领域的技术。
它是利用特定的酶对DNA分子进行切割，从而实现DNA分子的特定序列分离和提取的方法。
本文将详细阐述酶切反应的原理。
一、DNA结构为了更好地理解酶切反应的原理，首先需要了解DNA结构。
DNA是双链螺旋结构，由四种碱基（腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G和胞嘧啶C）组成。
两条链通过氢键相互配对，A与T形成两个氢键，G 与C形成三个氢键。
这种稳定的配对方式保证了DNA分子在遗传信息传递中的准确性。
二、限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别和切割DNA特定序列的酶。
它们广泛存在于细菌和古菌中，并且具有高度的特异性和高效率。
目前已经发现了数百种限制性内切酶，并且不同种类之间具有不同的切割位点和切割方式。
三、酶切反应酶切反应是一种利用限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割的方法。
在酶切反应中，首先需要选择一种合适的限制性内切酶，并确定其特定的切割位点。
然后将待处理的DNA分子与该限制性内切酶一起加入反应体系中，经过一定时间后，DNA分子会被该限制性内切酶在特定位点上进行断裂。
四、DNA片段在酶切反应中，被限制性内切酶识别和断裂的DNA分子称为DNA片段。
根据不同的限制性内切酶和不同的DNA分子，可以得到不同大小和不同序列的DNA片段。
这些DNA片段可以通过电泳等方法进行分离和提取，从而实现对特定序列的精确检测和分析。
五、应用由于其高度的特异性和高效率，酶切反应已经成为现代生物学、分子生物学、基因工程等领域中最为重要和常用的技术之一。
它被广泛应用于基因克隆、基因组测序、PCR扩增、DNA指纹鉴定等方面，为人类认识生命、治疗疾病和改善人类生存环境做出了巨大贡献。
六、总结酶切反应是一种利用限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割的方法。
它通过选择不同的限制性内切酶和不同的DNA分子，可以得到不同大小和不同序列的DNA片段，从而实现对特定序列的精确检测和分析。
DNA的限制性内切酶酶切
DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。
2.了解限制性内切酶的特点。
实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。
根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。
绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。
实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。
实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。
（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。
（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。
实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。
（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。
（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。
注意事项（1）注意要在冰上操作。
（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。
实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。
思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。
ｄｎａ的限制性酶切反应
ＤＮＡ的限制性酶切反应实验目的学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。
Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。
Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。
故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶。
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。
其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
DNA 的限制性内切酶酶切分析
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质 粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离 心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓 冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布 封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物 或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请 说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前 两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使 反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后 应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。
2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。
3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。
二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。
2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。
3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。
4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。
一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。
5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。
6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。
三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。
合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。
2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。
3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。
同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。
4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。
同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。
5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。
四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。
生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十五 DNA的限制性内切酶酶切分析【目的要求】1.掌握限制性核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理2.熟悉DNA的限制性内切酶酶切分析操作技术及其影响因素3.了解DNA酶解技术生物研究领域的应用【实验原理】限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构)，并以内切方式水解水解双链DNA的核酸水解酶。
它主要分布于细菌体内，目前已发现1800多种。
根据酶的组成、辅助因子及水解DNA的方式不同，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，而Ⅱ型限制性内切酶是重组DNA技术中常用的限制性内切酶，如Eco RⅠ、BamHⅠ等，它们被誉为分子生物学家的手术刀。
临床上某些遗传病由于基因突变发生在限制性内切酶切割位点，因此当用一定的限制性内切酶切割时，产生的酶切DNA片段大小就会与正常人酶切DNA片段发生差异，因而发生DNA限制性酶切图谱改变，据此可达到基因诊断的目的。
实验选用价格低廉、酶切效果较好的Eco RⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切分析，观察限制性内切酶的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp等不同分子量的DNA片段。
经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外扫描仪下摄影即可观察到λDNA的Eco RⅠ限制性酶切图谱。
【实验准备】一、器材1.恒温水浴箱2.电泳仪和电泳槽3.紫外扫描分析仪4.台式高速离心机5.微波炉6.加样枪、EP管及试管架等二、试剂1．DNA底物λDNA或质粒DNA或制备的肝组织DNA。
2．限制性内切酶Eco RⅠ及其缓冲液购自华美生物工程公司，每种限制性内切酶均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。
3．10×TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至500ml。
生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析
生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析摘要：DNA的限制性内切酶酶切分析是现代生物学和分子生物学中非常重要的一项研究技术，主要应用于DNA结构和功能以及遗传学和进化学等方面的研究。
本实验使用EcoRI和HindIII这两种限制性内切酶，对大肠杆菌的某一段DNA进行酶切，得到了预期的多个DNA 片段，并利用琼脂糖凝胶电泳对其进行分离和检测，结果表明，酶切后的DNA片段与预期大小基本一致，证明酶切反应成功。
关键词：DNA，限制性内切酶，酶切分析，琼脂糖凝胶电泳引言：DNA的限制性内切酶酶切分析是一种基于DNA序列差异的技术。
DNA序列不同，限制酶切割的位置也不同，因此，不同的DNA序列酶切后会生成不同大小的DNA片段。
这种技术可以用于DNA序列分析、构建基因工程载体、DNA指纹图谱的建立、遗传学分析等领域。
实验目的：1. 掌握限制性内切酶的性质和酶切反应的条件；2. 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；实验仪器和试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、蒸馏水、限制性内切酶EcoRI、HindIII、DNA Lambda/HindIII Marker。
实验步骤：1. 取0.1ml的大肠杆菌液体培养物放入1.5ml离心管内，离心10000r/min，去除细胞上清，加入200μl TE缓冲液（pH8.0），混匀。
2. 使用热澄清法将样品DNA被酶切（50℃下酶解1小时），收集酶切片段3. 为了预防酶切反应被停止，在样品DNA被酶切后立即在65℃下将反应体系加热10分钟，然后在4℃下保存至少10分钟；4. 准备琼脂糖凝胶，取0.8%琼脂糖溶液60ml，加入TAE缓冲液40ml，混合均匀后加入眼镜面板中，等待凝固；5. 将DNA样品与核酸标准品（控制）混合，电泳插板，然后加入注射器内的浓缩染料混合物。
6. 加电泳电源600V，电泳15分钟，至染料前端到达凝胶底部为止；7. 用止血酵素缓慢清洗文胸架，并用蒸馏水冲洗凝胶板表面，然后将凝胶板上的DNA 条带转移到薄膜上；8. 用紫外线辐射染色机染色（UV-28，365nm）。
酶切反应的正确操作方法
酶切反应的正确操作方法酶切反应是一种常用的生物学实验方法，可以将DNA分子在特定的酶切位点切割成较小的片段。
以下是酶切反应的正确操作方法：1. 准备酶切反应体系：在一个无菌的微量离心管中，准备以下反应体系：DNA 样品，10倍的切割缓冲液（通常是50-100 mM Tris-HCl，1-10 mM MgCl2，pH 7.4-8.0），适量的选择性限制性内切酶（根据实验需求选择合适的酶），通过溶剂添加到反应体系中。
2. 混合反应液：将切割缓冲液和DNA样品轻轻混匀，然后加入适量的酶，再次轻轻混匀。
注意避免产生气泡。
3. 孵育反应：使用合适的温度和时间对反应体系进行孵育。
反应条件会因所用酶而有所不同，通常会在37C孵育1-2小时，但具体条件需参考酶的说明书。
4. 终止反应：加入适量的酶切终止缓冲液（通常是约5倍于切割缓冲液的量），终止缓冲液中包含酶缓冲液的成分，可用于停止酶切反应。
5. 分离DNA片段：将反应液通过凝胶电泳或其他分离方法，将切割得到的DNA 片段与未切割的DNA片段分离开。
需要注意的是，在进行酶切反应时，应注意以下几点：- 确保实验环境和工作台面的无菌性，避免外源性DNA的污染。
- 使用高质量的DNA样品，以确保反应的准确性和重复性。
- 按照酶的说明书严格控制反应条件，包括温度、孵育时间等。
- 注意避免气泡的产生，以免影响反应的进行。
- 使用适量的酶，以免过度切割或切割不完全。
- 酶切反应结束后，及时停止反应并进行下一步的实验操作，避免长时间孵育造成DNA片段的进一步切割。
以上是酶切反应的正确操作方法，希望对你有所帮助。
如有需要，请参考相关文献或咨询专业人士进行进一步的实验设计和操作指导。
2.实验二-质粒DNA的限制性内切酶酶切
取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分 10μL 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： 溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： dsDNA浓度
实验组 Buffer EcolⅠ Ⅰ Hind Ⅲ 质粒 ddH2O 总体积 4 3 3 X 10-X 20
是体外剪切基因片段的重要工具所以常常与核酸聚合酶是体外剪切基因片段的重要工具所以常常与核酸聚合酶连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
质粒DNA DNA的限制性内切酶酶切 实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切
一 实验目的
了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 DNA
二 实验原理
型酶识别的DNA序列一般含有4 个核苷酸。 DNA序列一般含有 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端； 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末 DNA同时切割产生平末端 DNA双链产生粘性末端 双链产生粘性末端。 型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ Mg2+激活 端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列， 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可 DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口， 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切 片断。 片断。 本实验采用PMD18- 质粒具有EcoRⅠ Hind的识别序列和酶切位 EcoRⅠ和 本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位 PMD18 点分别为 GAATTC CTTAAG 和 AAGCTT TTCGAA
DNA的限制性内切酶酶切分析
DNA的限制性内切酶酶切分析DNA限制性内切酶酶切分析（restriction enzyme digestion analysis）是一种常用的实验方法，用于分析DNA片段的长度及其在不同DNA样本中的存在与否。
本文将介绍DNA限制性内切酶的定义和分类、酶切分析的原理、实验步骤和结果的分析等内容。
DNA限制性内切酶（restriction enzyme）是一种能够识别特定的DNA序列并酶切它们的酶类。
它的发现和应用让分子生物学和遗传学研究取得了重要的突破。
限制性内切酶按照它们识别的DNA序列和酶切的方式可以分为以下几类：1. 四切酶（Type I）：这类酶不仅有切割DNA的酶活性，还有甲基转移酶活性。
它们通常是多亚基复合物，需同时与子基的甲基转移酶活性合作。
2. 六切酶（Type II）：这类酶是最常用的限制性内切酶，它们能够识别特定的DNA序列，并在识别序列中特定的位置切割DNA链。
这类酶可以以精确的方式酶切DNA，生成具有粘性末端或平滑末端的DNA片段。
3. 四切酶（Type III）：这类酶也是多亚基复合物，通常需要其中一种辅助因子才能发挥酶切活性。
4. 五切酶（Type IV）：这类酶的酶切方式和高度特异性尚不清楚。
在酶切分析实验中，我们通常选用能够产生可检测到的DNA片段的限制性内切酶进行反应。
实验步骤如下：1.提取DNA样本：从要分析的细胞或组织中提取总DNA。
2. 选择限制性内切酶：根据需求选择一种适合的限制性内切酶。
常用的限制性内切酶有EcoRI、HindIII、BamHI等。
3.DNA酶切反应体系的设置：配置适当的酶切反应缓冲液，加入所选的限制性内切酶和总DNA，进行适当的搅拌反应。
4.酶切反应的条件调整：根据所选酶切酶的最佳工作条件进行反应温度、反应时间等参数的调整。
5.停止酶切反应：加入适当的制动剂（如酶切反应停止缓冲液）终止酶切反应。
6.扩增和可视化：对酶切后的DNA样品进行聚合酶链反应（PCR）扩增或直接进行凝胶电泳检测，以确定DNA片段的长度和存在与否。
DNA的限制性酶切实验原理
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 （如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
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Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
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五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其 杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的 强度，应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽 中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避 免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出 现气泡，以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能
实验八_DNA的限制性内切酶酶切和鉴定
5´GAATTC EcoRⅠ CTTAAG 5´
AAGCTT HindⅢ 5´ TTCGAA5 5´
质粒pUC18的物理图谱 的物理图谱 质粒
三、材料
重组质粒； EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购 买成品； HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购 买成品;琼脂糖(Agarose) 。 四、仪器 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液 枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。
五、试剂
1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液
六、操作步骤 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号,用微量移液枪分别加入质粒DNA （5---14 µl）和 相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2µl,再加入重蒸水 使 总 体 积 为 18µl, 将 管 内 溶 液 混 匀 后 加 入 EcoRI 和 HindⅢ 各1µl,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量 d 离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验 成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应 尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支 持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时, 使酶切反应完全。 3、 每管加入2µl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停 止反应,置于冰箱中保存备用。
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一、核酸限制性内切酶
• II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制性内 切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶 组成。II型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因 子，能识别双链DNA的特定序列，一般为4-6个碱 基的反转重复序列。II型限制酶一般在识别序列内 进行切割，产生特异的DNA片断。
切割下来，装入1.5ml微量离心管中。 ⑦ 置-20℃保存。
• 本周实验报告： 1. 实验原理 2. 实验步骤 3. 实验结果 4. 实验结果分析 • 下周请预习：离心吸附柱法从琼脂糖凝胶
中回收DNA
0.5μl
④ Xho I (10Units/μl)
0.5μl
2. 混匀试剂。将离心管置37℃水浴，反应1小 时。
三、实验步骤
3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
① 制备1%琼脂糖凝胶。 ② 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓
冲液，混匀。 ③ 将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样
27.5μl。 ④ 135V衡压电泳30-40分钟。 ⑤ 在紫外灯下观察酶切条带。 ⑥ 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中
二、限制性内切酶酶切反应
2. 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星 活性。
– 星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在某 些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的现 象。其结果是酶切条带增多。
– 星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘 油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
第五课
DNA限制性内切酶酶切反应
一、核酸限制性内切酶
• 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA特定碱基序 列的核酸水解酶。这些酶都是在原核生物中发现的， 可以为宿主抵御外来DNA的侵袭。根据酶的切割特性 、催化条件及是否具有修饰性可分为I、II、III型三大 类。
• I型酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋 酶四种活性。其内切酶的识别位点和切割部位不一致 ，无固定的切割位点，不产生特异片断。
② 反应缓冲液：不同厂家、不同的酶都有不同的最 佳反应条件。应严格按照产品说明书操作。双酶 切时要选择两种酶都具有最高活性的缓冲液。
③ 反应容积：在DNA浓度<0.4μg/μl的情况下，根据 后续实验的要求选择合适的反应容积。过高浓度 的DNA会使溶液过于粘稠影响酶的扩散，并降低 酶活性。
二、限制性内切酶酶切反应
二、限制性内切酶酶切反应
3. 终止反应：可以通过以下3种方式终止酶切 反应：
① 若DNA在酶切后不进行进一步的酶反应时，可加 入EDTA至终浓度10mM，或加入0.1%SDS。 EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反 应变得极为困难。
② 若DNA在酶切后须进行下一步的酶反应，可将反 应产物置65℃或80℃加热20分钟。但有些酶加热 灭活不彻底。
1. 配制反应体系
④ 内切酶及使用的酶量
• 根据实验要求选择限制性内切酶。 • 1个酶活力单位的定义：在50μl反应体系中，
1μgDNA在推荐的反应缓冲液和温度下反应1 个小时，被完全酶切所需要的内切酶的量。 • 过量的酶可缩短反应时间。但使用过多的酶将 导致识别序列特异性下降。一般采用2-10倍的 酶量。 • 加入酶的总容积不能超过反应体系总容积的 10%。否则甘油终浓度将达到5%以上，将抑 制酶的活性。
↓
5’…G3’
5’GATCC…3’
3’…CCTAG5’
3’G…5’
Xho I识别及切割位点：5’…C↓TCGA G…3’
–
3’…G AGCT↑C…5’
二、限制性内切酶酶切反应
1. 配制反应体系
① DNA：必须具备一定纯度，微量的酚、氯仿、大 于10mM的EDTA、去垢剂、及高盐的存在均将 影响限制性内切酶的活性。DNA碱基上的甲基化 修饰也是影响酶切的重要因素。
• II型修饰酶识别和II型限制酶一致的DNA序列，但 其作用是负责对识别序列的甲基化修饰。
一、核酸限制性内切酶
• II型限制酶切割DNA双链可产生三种不同的DNA末端 ：平末端、5’端突出的粘性末端、和3’端突…G↓GATC C…3’
3’…C CTAG↑G…5’
③ 用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀。
4. 酶切结果的鉴定 • 酶切完成后，取适量反应液进行琼脂糖凝胶
电泳观察酶切结果。
三、实验步骤
1. 按顺序，在1.5ml微量离心管中配制反应试 剂：
① 10X Buffer
5μl
② DNA (~100ng/μl)（质粒或PCR产物） 44μl
③ BamH I (15Units/μl)