6氨基移换反应及其产物的鉴定

实验报告

课程名称：生物化学实验（甲）

指导老师：杨劲树

同组学生姓名：

一、实验目的和要求三、实验材料和主要仪器五、实验数据记录和处理七、实验讨论和心得二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析

一、实验目的和要求

1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；

2、学习纸层析的原理和操作技术。

二、实验内容和原理

1.氨基移换反应：

在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。

转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性较高。

GPT催化下的转氨基反应为：

L－谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L－谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L－谷氨酸。

本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。

2. 纸层析原理：

滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。

层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。

实验名称：_ __________________姓名： 学号：

溶质在滤纸上的移动速率用Rf 值表示：Rf=X/Y

在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf 值的大小与样品的性质、结构、溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的pH ）、层析的温度和层析滤纸有关。此外，样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。

用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R 基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。

3. 茚三酮的显色原理：紫红红色复合80℃

△

茚三酮类+氨基酸

所呈现的颜色随反应的条件(酸度、温度、盐浓度、铜、镉离子等)不同而异，本实验中其颜色的深浅主要与谷氨酸/丙氨酸的浓度有关。

三、实验材料和主要仪器

1、实验材料：

动物肝脏(牛蛙肝或猪肝）

2、实验试剂：

⑴ 0.01mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）；

⑵ 0.1mol/L α－丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）；

⑶ 0.1mol/L α－酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）；

⑷ 0.1mol/L 谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）；

⑸ 展层溶剂－酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）；

⑹ 10％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）；

⑺ 0.25%碘乙酸（抑制L －谷氨酸脱氢酶活性）；

⑻ 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。

装

订

线

P.2

3、实验仪器

⑴研钵；

⑵试管及试管架；

⑶恒温水浴箱（37℃、100℃）；

⑷铅笔、尺和圆规；

⑸毛细管（直径0.5mm)；

⑹新华定性滤纸（直径11cm）；

⑺剪刀和镊子；

⑻电吹风；

⑼滴管；

⑽康氏皿；

⑾喷雾器。

四、实验方法和步骤

1、转氨酶液的制备

取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。

2、氨基移换反应

取4支洁净、干燥的试管，按表1操作

3、层析

⑴准备：

①取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2 cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径约0.2cm)。

②另取2cm×3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。

⑵点样：

用毛细管依次点标准α－丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)各点2次，其余1－4号管样液各点2～3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。

⑶展层、显色：

将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中, 平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮－乙醇溶液，用电吹风热风吹干显色3min。

五、实验数据记录和处理

六、实验结果和分析

1号反应管：虽然有两种底物，但是转氨酶提前100℃变性失活了，也没有发生氨基移换反应。只有一条丙氨酸的显色带。

2号反应管：只有单一底物丙氨酸，没有发生氨基移换反应。所以只有一条丙氨酸的显色带。

3号反应管：只有单一底物α—酮戊二酸，没有发生氨基移换反应。所以没有出现显色带。但仔细观察可以发现有极少量谷氨酸的显色带，可能是由于滤纸“灯芯”遭到1号反应管中样品的污染或者酶液中本身存在的少量谷氨酸。

4号反应管：部分丙氨酸将氨基转移给α—酮戊二酸，生成了谷氨酸，所以有丙氨酸和谷氨酸两条显色带。5号丙氨酸标准品：出现一条圆弧状的紫红色（半径较大）显色带

6号谷氨酸标准品：出现一条圆弧状的紫红色（半径较小）显色带。