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第二发酵工业菌种与种子的扩大培养
第一节 发酵工业菌种概述
菌种在发酵工业中起着重要作 用，它是决定发酵产品是否具有产 业化价值和商业化价值的关键因素、 是发酵工业的灵魂。
一、发酵工业用菌种的特点及要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物
有关合成产物的途径尽可能wk.baidu.com简单，或者说菌 种改造的可操作性要强 遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学 上最好与致病菌无关）
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌 属或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷 氨酸生产菌选育而成； 工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
二、已工业化产品生产菌的介绍
3. 食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理 试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。 目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食 品用酶。
生产特性要符合工艺要求
二、已工业化产品生产菌的介绍
1. 抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复 杂的代谢，目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉 素四环素；红 霉素等）
真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
二、已工业化产品生产菌的介绍
2. 氨基酸生产有关的微生物
二、已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40 万株微生物中，发现了三种有潜力的新 抗生素。
第二节 发酵工业菌种的选育
工业菌种的分离：菌株分离是将混杂着各种微生 物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、 准确、有效的方法对它们进行分离、筛选。进而 得到所需微生物的过程。
工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对 某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方 位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强 化，或去除不良性质或增加新的性状。
二、新种分离与筛选的步骤 2. 增殖培养
为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。
例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
二、新种分离与筛选的步骤
3. 培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生 物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
二、新种分离与筛选的步骤
4. 筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。
二、新种分离与筛选的步骤 5. 毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。
有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵 母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须 作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通 过两年以上的毒性试验。
分离：利用分离技术得到纯种。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样
（1）采样对象
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物 的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野 果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物， 腐败物品，某些水域等。
一、菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、新种分离与筛选的步骤 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。
增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌 种增殖培养后，在数量上占优势。
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统 （2）真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统
（2）真核细胞表达系统 ➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统 具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
1. 采样
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样 （2）采样季节
以温度适中，雨量不多的秋初为好。
（3）采土方式
在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取 离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸 袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、 地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中 微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
二、新种分离与筛选的步骤
6.培养分离中要解决的问题 （1）“分离什么和从哪里分离出?” （2）必须充分考虑所分离微生物的生产能力、
生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其 提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性 及遗传操作的难易程度等。 （3）选择适宜的培养分离方法和检测方法。
α -淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢 杆菌和地衣牙孢杆菌
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统 （1）原核生物
大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
第一节 发酵工业菌种概述
菌种在发酵工业中起着重要作 用，它是决定发酵产品是否具有产 业化价值和商业化价值的关键因素、 是发酵工业的灵魂。
一、发酵工业用菌种的特点及要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物
有关合成产物的途径尽可能wk.baidu.com简单，或者说菌 种改造的可操作性要强 遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学 上最好与致病菌无关）
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌 属或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷 氨酸生产菌选育而成； 工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
二、已工业化产品生产菌的介绍
3. 食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理 试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。 目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食 品用酶。
生产特性要符合工艺要求
二、已工业化产品生产菌的介绍
1. 抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复 杂的代谢，目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉 素四环素；红 霉素等）
真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
二、已工业化产品生产菌的介绍
2. 氨基酸生产有关的微生物
二、已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40 万株微生物中，发现了三种有潜力的新 抗生素。
第二节 发酵工业菌种的选育
工业菌种的分离：菌株分离是将混杂着各种微生 物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、 准确、有效的方法对它们进行分离、筛选。进而 得到所需微生物的过程。
工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对 某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方 位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强 化，或去除不良性质或增加新的性状。
二、新种分离与筛选的步骤 2. 增殖培养
为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。
例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
二、新种分离与筛选的步骤
3. 培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生 物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
二、新种分离与筛选的步骤
4. 筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。
二、新种分离与筛选的步骤 5. 毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的， 将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品 工业有关的菌种，更应慎重。
有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵 母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须 作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通 过两年以上的毒性试验。
分离：利用分离技术得到纯种。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样
（1）采样对象
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物 的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野 果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物， 腐败物品，某些水域等。
一、菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
二、新种分离与筛选的步骤 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。
增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌 种增殖培养后，在数量上占优势。
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统 （2）真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统
（2）真核细胞表达系统 ➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统 具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
1. 采样
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样 （2）采样季节
以温度适中，雨量不多的秋初为好。
（3）采土方式
在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取 离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸 袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、 地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中 微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
二、新种分离与筛选的步骤
6.培养分离中要解决的问题 （1）“分离什么和从哪里分离出?” （2）必须充分考虑所分离微生物的生产能力、
生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其 提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性 及遗传操作的难易程度等。 （3）选择适宜的培养分离方法和检测方法。
α -淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢 杆菌和地衣牙孢杆菌
二、已工业化产品生产菌的介绍
4. 常用的基因表达系统 （1）原核生物
大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.