5 离子交换色谱法
离子色谱分析法
恒流泵：驱使液体（如淋洗液）在 管道中流动，它可以提高流动相的 速度，使离子色谱法能进行快速分 析，同时能控制流动相单位时间内 流出的体积。
分离系统：由前置柱、分离柱、抑 制柱组成。前置柱是用来保护分离 柱的。
检测系统：由电导池，读数表 头和有关的线路板组成。
碱金属、碱土金属及胺类的分析
（二）重金属和过渡金属的分析
三、离子色谱的优点
1.快速、方便、灵敏度高、选 择性好、可同时分析多种离子化 合物。
四、离子色谱的应用
离子色谱在环境分析中的应用（饮用水、 生活污水和工业废水的分析）、大气飘 尘与降水的分析、微电子、电子工业中 痕量分析、在食品和饮料分析中的应用、 在生化分析中的应用、在石油化工中应 用
标准的色谱图
分离度的确定
2. 峰高和峰面积的测量
在使用积分仪和色谱工作站测量峰 高和峰面积时，仪器根据设定的积 分参数（半峰宽，峰高和最小峰面 积等）和基线的设定来计算每个色 谱峰的峰高和峰面积，然后直接打 印出峰高和峰面积的结果。
第三章 七种阴离子的离 子色谱法测定
设备
离子色谱仪的主机由下列主要部件组成： 储液槽：用来储存实验过程中需要的各
准备淋洗液；在使用前，用0.24mol/l碳 酸钠；0.3mol/l碳酸氢钠配制成 0.9mMmol碳酸钠+0.85 mMmol碳酸氢 钠工作溶液。
3.标准溶液的制备：
储备溶液 ：
储备液的浓度是1000g/L(F--﹑CL-﹑NO2-﹑ Br--﹑NO3- ﹑ PO3﹑SO43-)。依据表格，预处理一定量 的物质，分别置于1000ml容量瓶中， 用少量水溶解后稀至刻度。表1-1
第一章 离子色谱分析法
离子交换色谱（ion
离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）2、离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）蛋⽩质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH⼩于其等电点时，带净正电荷，⽽在缓冲液pH⼤于其等电点时，带净负电荷。
阴离⼦交换凝胶本⾝带有正电荷基团，阳离⼦交换凝胶本⾝带负电荷基团。
由于静电相互作⽤⽽使样品结合到凝胶上，再采⽤盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进⾏洗脱对于等电点⼩于5.0的酸性蛋⽩质，推荐使⽤阴离⼦交换，对于等电点⼤于7.0的碱性蛋⽩质，推荐使⽤阳离⼦交换。
两种模式：⼀种使⽬的蛋⽩结合凝胶，通过梯度洗脱；⼀种使⽬的蛋⽩不结合凝胶，⽽⼤部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有⽬的蛋⽩。
column chromatography（柱⾊谱）batch chromatography（批⾊谱）c、疏⽔作⽤⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽在⾼盐存在下，可以结合疏⽔凝胶，⽽在盐浓度降低时⼜可以解脱的原理实现分离。
d、亲和⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽与某些配基的特异性相互作⽤⽽进⾏分离。
例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋⽩-凝集素，抗原-抗体等。
近来发展了⾦属螯合亲和⾊谱，⽤于纯化表⾯含⾊氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋⽩质以及(His)6-tagged重组蛋⽩。
亲和⾊谱分为特异性亲和⾊谱和组别亲和⾊谱两类。
肝素、凝集素、染料、⾦属螯合亲和⾊谱均为组别亲和⾊谱（同⼀配基可以结合许多种蛋⽩质）。
e、反相⾊谱常⽤于蛋⽩质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极⾼，可以分离两种仅相差⼀个氨基酸的多肽。
如⾎管紧张素（angiotensin）的⼏个亚型通过反相⾊谱可以很好地分离。
同⼀个样品在同⼀Source 30 RPC柱上进⾏分离，由于⾊谱条件进⾏了改变，⾊谱图截然不同，说明反相⾊谱具有⾼度的选择性。
四、应⽤举例例⼀、⼀种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab⽚断（E.coli中表达）分⼦量：50 kD等电点：11表达定位：周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离⼦交换去除⼤部分杂质，疏⽔作⽤⾊谱进⼀步去除杂质，最后⽤凝胶过滤分离。
实验5 离子色谱法测定水中阴离子试验报告
实验 5 离子色谱法测定水中阴离子一实验目的（1）掌握离子色谱法分析的基本原理。
（2）了解离子色谱仪的组成及基本操作技术。
（3）掌握常见阴离子的测定方法。
（4）掌握离子色谱的定性和定量分析方法。
二实验原理（1）进样：样品环进样（2）分离：离子交换分离离子色谱中使用的固定相是离子交换树脂。
离子交换树脂上分布有固定的带电荷的基团和能离解的离子。
当样品进入离子交换色谱柱后，用适当的溶液洗脱，样品离子即与树脂上能离解的离子连续进行可逆性交换，最后达到平衡。
不同阴离子（F-,Cl-，NO2-,NO3-等）与阴离子树脂之间亲和力不同，其在树脂上的保留时间不同，从而达到分离的目的。
（3）检测：电导检测器根据离子色谱峰的峰高和峰面积对样品中的阴离子进行定性和定量分析。
三仪器与试剂仪器：离子色谱仪；阴离子分析色谱柱：，阴离子分析色谱保护柱；超声波发生器；真空过滤装置；1mL、10mL 注射器各一支；0.20微米、0.45微米水相微孔过滤膜。
试剂：KCl、NaNO2均为优级纯；超纯水。
四实验步骤（1）准备浓度分别为 10ppm，20ppm，50ppm 和未知浓度的试样各一份。
(含KCl,NaNO2)（2）设置仪器参数：淋洗液流量0.8ml/min,数据采集时间10min.（3）用注射器注入10ppm 的溶液进入离子色谱仪并观察色谱图，一段时间后记下相关数据，依次进行其他浓度试样的检测。
(注意试液装入前清洗三次，最后抽取时无气泡）（4）绘制标准曲线。
五结果处理数据记录溶液离子出峰时间/min峰面积Cl-10ppmNO2-Cl-20ppmNO2-Cl-50ppmNO2-未知试样未知（1）根据标准试样和样品试样色谱图中色谱峰的保留时间，确定分析离子在色谱图中的位置答：（2）绘制标准曲线，拟合线性回归方程。
Cl-线性回归方程：NO2-线性回归方程：（3）计算水样中被测阴离子的含量。
答：六注意事项（1）淋洗液必须先进行超声脱气处理。
离子色谱分析法
阳极 阳离子交换膜
二、高效离子排斥色谱（HPIEC）
分离是基于固定相和被分析物 之间三种不同的作用-Donnan 排斥、空间排斥和吸附作用。
1、分离原理
典型的离子排斥色谱柱是全磺化高交换容量的 H+ 型阳离 子交换剂，其功能基为磺酸根阴离子(SO3-)，树脂表面的 这一负电荷层对负离子具有排斥作用，即所谓的 Donnan
第三章
离子色谱分析法
一、离子色谱法原理 二、离子色谱仪
一、离子色谱法原理
离子色谱法（IC) :以离子型化合物为分析 对象的液相色谱法。 通常使用离子交换剂固定相和电导检测器 。
离子型物质 : 在水溶液中电离，具有 + 或 –
电荷的元素
无机阴离子（Ｃｌ－，ＮＯ2－，ＳＯ４２－，ＣｒＯ４２－）和
污染雨水河水大气污水雨水中离子城市用水自来水水源自来水中消毒副产物样品应用化学品设备提取物聚合物环氧类粘合剂中的阴离子电子半导体高纯水晶片冲洗水高纯水中的离子型杂质金属钢材表面处理液镀冷却水电镀槽中的抗坏血酸高效离子排斥色谱hpiec分离机理高效离子交换色谱法hpic是离子色谱法中应用最为广泛的固定相是一种具有可交换离子的聚合电解质能参与溶液中离子的交换作用而不改变本身一般物理特性
/
R
欧姆定律 R = V Resistance Voltage (Ohm) (Volt)
/
I Current (Ampere)
欧姆定律表明电阻等于电压与电流的比值。电导为 电阻的倒数，直接与溶液的浓度有关。
电极
电导检测器定量原理
电导
G =
1
G = 1
. ห้องสมุดไป่ตู้i
/
ci λi
R
有机酸分离方法
有机酸分离方法引言：有机酸是一类含有羧基（-COOH）的有机化合物，具有酸性。
有机酸的分离对于化学分析和工业生产具有重要意义。
本文将介绍几种常用的有机酸分离方法。
一、溶剂萃取法溶剂萃取法是一种常用的有机酸分离方法。
该方法利用不同有机酸在水和有机溶剂中的溶解度差异，通过萃取达到分离的目的。
一般来说，有机酸在有机溶剂中的溶解度较高，因此可以通过将混合溶液与有机溶剂进行摇匀、分层等操作，使有机酸从水相迁移到有机相中，从而实现分离。
二、离子交换色谱法离子交换色谱法是一种基于溶液中离子的吸附-解吸过程进行分离的方法。
该方法利用离子交换树脂的特性，通过控制溶液中的pH值和离子浓度，实现有机酸的分离。
离子交换色谱法具有分离效果好、操作简便等优点，因此在有机酸分离中得到广泛应用。
三、薄层色谱法薄层色谱法是一种基于化合物在固体表面上吸附-解吸过程进行分离的方法。
该方法利用薄层色谱板上的吸附剂，通过控制溶剂的挥发速度和色谱板的温度，实现有机酸的分离。
薄层色谱法具有操作简便、分离效果好等优点，因此在有机酸分离中得到广泛应用。
四、气相色谱法气相色谱法是一种基于化合物在气相中的分配系数进行分离的方法。
该方法利用气相色谱柱和气相载气的选择性，通过控制温度和流速等条件，实现有机酸的分离。
气相色谱法具有分离效果好、分析速度快等优点，因此在有机酸分离中得到广泛应用。
五、液相色谱法液相色谱法是一种基于化合物在液相中的分配系数进行分离的方法。
该方法利用液相色谱柱和流动相的选择性，通过控制温度、流速和流动相组成等条件，实现有机酸的分离。
液相色谱法具有分离效果好、分析灵敏度高等优点，因此在有机酸分离中得到广泛应用。
总结：有机酸分离是化学分析和工业生产中的重要步骤。
本文介绍了几种常用的有机酸分离方法，包括溶剂萃取法、离子交换色谱法、薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法。
这些方法各具特点，可以根据实际需要选择合适的方法进行有机酸的分离。
在实际应用中，还可以结合多种方法进行分离，以提高分离效果和准确性。
多糖分离纯化
多糖分离纯化一、概述多糖是一类高分子化合物，具有复杂的结构和多样的功能，广泛存在于生物体内。
多糖的分离纯化是研究其结构和性质、开发应用的前提和基础。
本文将介绍多糖分离纯化的方法及其优缺点。
二、多糖分离纯化方法1. 溶液沉淀法溶液沉淀法是一种常用的多糖分离纯化方法。
该方法基于不同多糖在不同浓度下溶解度不同的原理，通过控制溶液中某些成分（如盐类）浓度来使目标多糖沉淀。
该方法操作简单，但需要对目标多糖在不同条件下的溶解度有较为准确的了解，并且会受到其他成分影响。
2. 离子交换色谱法离子交换色谱法是一种利用固定在固相上带电基团与目标多糖间相互作用实现分离纯化的方法。
该方法适用于具有明显电荷差异或含有特定官能团（如硫酸基、羧基等）的多糖。
该方法分离效果好，但需要对固相的选择和操作条件进行优化。
3. 凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法是一种利用多孔凝胶作为分离介质，目标多糖根据其大小在凝胶中进行分离的方法。
该方法适用于具有不同分子量的多糖，且操作简单、分离效果较好。
但由于凝胶孔径大小限制，对于较小或较大的多糖可能无法有效分离。
4. 亲和层析法亲和层析法是一种利用目标多糖与特定配体间相互作用实现分离纯化的方法。
该方法适用于具有特定结构或功能的多糖，如具有特异性结合蛋白质、抗原表位等。
该方法操作简单、分离效果较好，但需要对配体选择和操作条件进行优化。
5. 聚焦电泳法聚焦电泳法是一种利用电场作用将目标多糖在pH梯度中移动并实现分离纯化的方法。
该方法适用于具有不同等电点或带电性质的多糖。
该方法分离效果好、可同时实现高效分离和纯化，但需要对pH梯度的选择和操作条件进行优化。
三、多糖分离纯化方法的优缺点1. 溶液沉淀法优点：操作简单，无需昂贵设备。
缺点：需要对目标多糖在不同条件下的溶解度有较为准确的了解，并且会受到其他成分影响。
2. 离子交换色谱法优点：分离效果好，适用于具有明显电荷差异或含有特定官能团（如硫酸基、羧基等）的多糖。
离子交换色谱法和离子色谱法
阳离子交换树脂
RSO H
3
+
X
RSO3X
+
H
不可交换离子 可交换离子 待测离子
交换平衡常数或选择性系数
RSO X H RSO X 3 3 s m s Ks RSO3 H s X m RSO3 H s / X m K A KB / H m
强酸型阳离子交换树脂：含有磺酸基-SO3 H+的树脂
OH 2.阴离子交换树脂：在骨架上引入能电离出 的
碱性基团，如季铵基、氨基、仲胺基，叔胺基。 强碱型阴离子交换树脂：含有季铵基-N(CH3)+3 OH 的树脂。
交联度和交换容量
交联度：
表示离子交换树脂中交联剂的含量大小，即合成树脂 时二乙烯苯在原料中的重量百分含量。 强酸型--2～16%：强碱性--<10%。 交联度越高。网眼越小，选择性越高，大体积离子愈 难进入树脂基体。
影响Ks的因素
1）溶质的离子电荷数越大或水合离子半径越 小，则KS ↑。 2）交换能力强、选择性大的离子组成流动相 的洗脱力越大，则tR↓, KS↓ 3) pH降低时，弱电解质的离解被抑制（弱酸 ），tR↓, KS↓ 4）交联度↑，交换容量↑， tR ↑, KS ↑
流动相
离子交换色谱多以水溶液为流动相，因为水具有使组
分离子化的特性，也可在流动相中加入少量有机溶剂（甲
醇，四氢呋喃和乙腈）以增加某些组分的溶解度进而改变 分离选择性，这对分离可离解的有机化合物尤为有利。 以水为流动相的离子色谱中，组分的保留时间和分离 度主要通过控制流动相pH和离子强度调节。
离子交换色谱法分析化学
离子交换色谱法分析化学离子交换色谱法是一种常用的分离和分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
该方法基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用，实现对目标化合物的分离和分析。
本文将介绍离子交换色谱法的基本原理、实验操作步骤以及在化学分析中的应用。
一、离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱法利用离子交换剂作为固定相，通过与样品中离子之间的相互作用，实现分离目标化合物。
离子交换剂是一种具有交换基团的功能性材料，通过基团与样品中离子进行交换，从而实现对目标化合物的分离。
根据不同的交换基团和固定相材料，离子交换色谱法可应用于不同类型化合物的分离和分析。
二、实验操作步骤1、准备实验仪器和试剂，包括色谱柱、流动相、样品溶液等。
2、将离子交换剂填充至色谱柱中，制成固定相。
3、将样品溶液注入进样器中。
4、开启泵，使流动相通过色谱柱，将样品中的离子与固定相中的交换基团进行交换。
5、通过检测器对分离后的离子进行分析和检测。
6、根据峰高、峰面积等参数计算目标化合物的含量。
三、离子交换色谱法在化学分析中的应用1、有机酸和碱的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定有机酸和碱的含量，如乳酸、柠檬酸、苯胺等。
通过选择合适的离子交换剂和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
2、金属离子的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定金属离子，如钠、钾、钙、镁等。
通过选择含有适当功能基团的固定相，可实现对不同金属离子的分离和分析。
3、环境样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定环境样品中的阴、阳离子，如水样、土壤样品的分离和分析。
通过优化实验条件，可实现高分辨率分离和准确测定。
4、生物样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定生物样品中的离子，如氨基酸、多肽等。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
5、其他领域的应用：离子交换色谱法还可应用于化学合成、药物分析、食品分析等领域。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现对不同类型化合物的分离和分析。
离子交换色谱法的分离原理和操作步骤
离子交换色谱法的分离原理和操作步骤离子交换色谱法（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的高效分离技术，广泛应用于药物研究、生物化学和环境监测等领域。
该技术的原理基于离子间的互相吸附和解吸作用，通过离子交换剂和淋洗缓冲液的选择实现目标物质的分离和纯化。
一、分离原理：离子交换色谱法的分离原理是基于离子交换剂与样品中离子的相互作用。
离子交换剂通常是具有固定电荷的树脂材料，其内部可以连接带正电（阴离子交换树脂）或带负电（阳离子交换树脂）的功能基团。
当样品中的离子进入色谱柱，会与离子交换剂表面的功能基团发生静电相互作用，发生互相吸附。
在离子交换色谱的过程中，树脂固定相上的离子交换剂与样品中的离子发生竞争吸附，较强的离子与树脂固定相发生更强的吸附，较弱的离子则发生较弱的吸附。
通过调整淋洗缓冲液的性质和浓度，可以改变离子交换剂与样品中离子的相互作用强度，实现对目标物的选择性吸附和解吸。
二、操作步骤：1. 样品预处理：将待检样品进行前处理，例如提取、浓缩和溶解等步骤，以获得适合分析的样品。
2. 样品加载：将样品通过进样口注入离子交换色谱柱中，尽量避免空气进入，以免影响分析结果。
3. 柱洗脱：通过在色谱柱上通入淋洗缓冲液，将非目标物质从固定相上洗脱。
淋洗缓冲液的性质和浓度需要根据目标物质的亲和性进行选择。
4. 目标物洗脱：通过改变淋洗缓冲液的性质和浓度，实现目标物质与固定相的离子交换。
通常，当淋洗缓冲液中的离子浓度增加时，目标物质与固定相之间的离子交换作用会减弱，从而实现目标物质的洗脱。
5. 柱平衡：在每次使用色谱柱之前，都需要进行柱平衡步骤。
通过使用柱平衡液将色谱柱进行适当的平衡，以确保每次实验结果的准确性和重现性。
6. 数据采集和分析：最后，用适当的检测器检测洗脱出的样品，并对数据进行采集和分析。
根据峰面积或峰高，可以定量分析目标物质的含量。
离子交换色谱法作为一种高效的分离技术，具有分析速度快、选择性高、分辨率好等优点。
离子色谱
抑制型电导技术由最初的抑制柱技术，又经历了可连续再生式的纤维管、微膜抑制器阶段，最新的抑制技术采用电解抑制法，使抑制电导检测可以自动进行而不必采用传统的再生液。通过电导抑制可以使背景电导值很低，而检测灵敏度可以达到很高水平。
因此，目前大多数离子色谱基本上还是采用抑制电导法检测。无论是痕量测定的电场，还是半导体工业，抑制电导检测始终是最理想的方法。
由于H.Small等人研制的抑制型离子色谱仪是专利产品，只有Dionex公司可以生产和销售，人们设想采用其他途径研制离子色谱仪。这其中最为成功的是在美国依阿华州立大学J.S. Fritz等人提出非抑制型离子色谱，即采用低交换容量的离子交换树脂制成色谱柱，采用弱酸及其盐类作为淋洗液对不同离子进行淋洗，在控制一定pH值的条件下，背景电导比较低，可以不加抑制器直接电导检测。该方法称为非抑制电导离子色谱。由于非抑制型离子色谱只采用了分离柱，人们通常称之为单柱型离子色谱；而对应的称为抑制型离子色谱，由于用分离柱和抑制器，又称为双柱型离子色谱。
20世纪80年代初，离子色谱已经广泛地被人们所认同、接受，离子色谱的销售量每年以15%以上的速度递增。美国化学文摘及英国的分析化学文摘专门将离子色谱分成独立的一类；而Journal of Chromatography Science每年在介绍色谱仪器时，将其分为液相色谱、气相色谱、离子色谱和毛细管电泳4大类型。国际上每年都召开国际离子色谱学术会议，至今已经召开了十四届，而国内目前也每两年召开一次全国性离子色谱会议和一些区域性的离子色谱协作会议。由此可见，离子色谱学科以飞快的速度向前发展。
三、离子排斥色谱
它主要根据Donnon膜排斥效应：电离组分受排斥不被保留，而弱酸则有一定保留的原理制成。离子排斥色谱主要用于分离有机酸以及无机含氧酸根，如硼酸根、碳酸根和硫酸根、有机酸等。它主要采用高交换容量的磺化H型阳离子交换树脂为填料，以稀盐酸为淋洗液。
离子色谱法
图：非化学抑制的792 Basic IC连接示意图
图：化学抑制的792 Basic IC连接示意图
抑制器:有三根高容量、长寿命和易操作的微填充抑制柱。
非抑制电导率:
背景电导率 = 洗脱液
色谱峰的电导率 = 洗脱液 ＋ 样品
样品的电导率 =色谱峰的电导率 -洗脱液电导率
阴离子抑制 ：
洗脱液－基线(背景)：
非抑制、抑制的比较：
非抑制
高背景电导率 低灵敏度的阴离子
抑制
低背景电导率 高灵敏度的阴离子
高灵敏度的阳离子
成本低
高灵敏度的阳离子 成本高
792 标准型离子色谱仪：
五 、 仪 器 设 备 介 绍
IC 泵
进样阀
在线过滤
排气阀
检测器
MSM抑制器
分离柱
蠕动泵
六、影响色谱分析的各种条件
色谱柱的选择 淋洗液的温度 淋洗液的浓度与组成 淋洗液的流速 淋洗液中的杂质
R-SO3– H+ + Na+ + HCO3– R-SO3– Na+ + H2O + CO2 背景电导率 = 水 +CO2， （背景电导率降低）
样品－信号(以NaCl为例)：
R-SO3– H+ + Na+ + Cl– R-SO3– Na+ + H+ + Cl– （信号增加）
抑制器功能 : 抑制降低背景电导率、待测离子灵敏度增加。
（一）离子色谱柱选择
1. 阴离子色谱柱
抑制型阴离子色谱及非抑制阴离子色
谱柱
2. 阳离子色谱柱 3. 有机酸离子色谱柱 4. 糖类离子色谱柱
离子交换色谱法标准操作程序
方法摘要：离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。
当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。
溶液pH低于C产品组分等电点PI时，组分带正电荷，可以跟固定相上的阳离子交换，吸附在固定相上，用盐浓度梯度洗脱时，组分按照表面正电荷从少到多的顺序被洗脱下来。
紫外检测器检测280nm处的响应值，根据组分峰面积计算纯度。
范围：适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。
职责：操作人员：➢严格按照此规程要求进行操作。
岗位主管：➢起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；➢监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；➢培训，确保此操作规程的正确实施。
程序：1术语解释无2试剂和材料➢色谱柱：阳离子交换色谱柱，例如MabPac TM SCX-10，4.0×250mm，10µm（Thermo）➢试剂：N-（2-乙酰胺基）-2-氨基乙磺酸（ACES，分析纯），氯化钠（NaCl，色谱纯），盐酸（HCl，分析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4，色谱纯），磷酸（H3PO4，色谱纯），纯化水（自制）➢滤膜：孔径为0.45µm或以下注：所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代，但应证明适用；所有材料遵循厂家有效期。
3仪器设备➢液相色谱仪：例如Agilent 1260➢天平，精确到mg➢pH计➢溶剂过滤装置➢离心机（转速10000 rpm以上）➢移液器（10-1000 µl）4溶液配制4.1流动相配制4.1.1流动相A：20 mM ACES，pH 6.20称取ACES 3.64 g，加入1000 ml 水搅拌至完全溶解，HCl调pH 6.20±0.02；经0.45 μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。
色谱分离技术—离子交换色谱分离技术
离子交换剂
离子交换树脂的性能评价——滴定曲线 滴定曲线也是检验和测定离子交换剂性能的重要数据，如下图是几种离子交
换剂的滴定曲线。
几种典型离子交换剂的滴定曲线
n为单位质量离子交换剂所加入的NaOH或HCl的毫摩尔数 1,2,3,4分别为强酸型、弱酸型、强碱型、弱碱型离子交换剂滴定曲线
影响离子交换的因素
温度的影响 温度的改变对稀溶液的离子交换性能影响不大，但在0.1mol/L以上浓度时，
温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附。同时离子的活性系数增大，对弱 酸、弱碱交换剂来说其交换率有较大的影响。一般温度增高，离子交换速度加 快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件， 避免引起交换剂的破坏。
离子交换树脂的命名 离子交换树脂的型号由三位阿拉伯数字组成：第一位数
字代表产品的分类；第二位数字代表骨架；第三位数字为顺 序号，用以区别基团。
离子交换色谱分离技术
离子交换剂
离子交换树脂的性能评价——交换容量
不同的树脂其交换能力大小不同，表征树脂交换能力大 小的主要参数是交换容量，即指每克干燥离子交换树脂或每 毫升完全溶胀的离子交换树脂所能吸收的一价离子的毫摩尔 数。交换容量的大小，取决于网状结构中活性基团的数目， 含有活性基团越多，交换容量也越大。但交换容量太大，活 性基团太多，树脂不稳定。
影响离子交换的因素
溶剂的影响 通常在水中进行交换，亦可采用含水溶剂，但在极性小的溶剂中难以进行
或不进行交换，同时还导致离子交换的选择性的降低或消失。
离子交换色谱分离技术的应用
可溶性的有机或无机离子化合物均可进行离子交换色谱操作。 化合价越高，被结合的生物物质越强，相同化合价和条件下，结合的亲和力
离子交换色谱
其中[RX + ]表示与离子交换树脂活性中心结合的离子浓度，[X + ]表示游离于流动相中的离子浓度。
一、分离原理
离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。
离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
离子交换色谱法 离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC)
离子色谱分析法出现在20世纪70年代，80年代迅速发展起来，以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象。
离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离。现在它不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，因此应用范围较广。
二、固定相
离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式，一是常见的纯离子交换树脂。第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂，第三种为大孔径网络型树脂。它们各有特点，例如第二种树脂有很高的柱效，但它的柱容量不大；第三种树脂适用于非水溶液中物质的分离，因为它们的孔径和内表面积大，不需要用水溶胀，便可满意地使用。
离子交换色谱
背景
色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸 附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色 带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板 理论，以及其远见卓识的预言。 1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层 色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱 （HPLC）等。
色谱法的基本原理
色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差 异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、 分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的， 称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相） 中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度 移动而达到分离的目的。
色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.
阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速 度和标准物（与固定相没有亲和力的流 动相 Kd=0）的迁移率之比
溶质的迁移距离 Rf 流动相在色谱系统中的迁移距离
Am Rf Am K d As
其意义在于体现某一种溶质与固定相之间 的亲和力大小.
按分离的压力 高压色谱 中压色谱 低压色谱 按流动相分 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱
22.3
各类色谱技术及应用
凝胶过滤色谱 离子交换色谱 疏水色谱 聚焦色谱 反相色谱 超临界流体色谱 羟基磷灰石色谱 灌注色谱 应用
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三、提高离子交换分离效果的途径
1）树脂的选择与填充技术 参照文献方法，结合被分离对象（阴离子？阳离子？）选择合适类型
交联度为8%的强酸性聚苯乙烯型树脂，约50um， 柱温50℃。
以150×0.9cm的交换柱，0.2M柠檬酸钠，pH 3.244.25为淋洗剂可以先分离出酸性氨基酸如谷氨酸，后分离 出中性氨基酸，如苯丙氨酸
以15 ×0.9cm的短交换柱，0.4M 0.2M柠檬酸钠， pH5.26为淋洗剂可以分离出碱性氨基酸，如精氨酸等。
带”——即色谱 Chromatography
该方法现在仍然广泛使用，如有机合成中的“过柱子”。常见的 是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。又称为柱层析/柱色谱，或经 典液相色谱法（相对于HPLC）。
一、离子交换色谱法的分类
1）淋洗色谱：通常先将少量样品通过交换柱，达到吸附 平衡，然后用亲和力比组分A、B、C都弱的离子作淋洗剂， 得到相互分离开的淋洗曲线。主要用于分析分离。
后进行测定。
置换色谱：
锂和钠的硫酸盐混合溶液通过一根氢型DOWE×50，300目树脂的交 换柱，用1.0mol/L(NH4)2SO4淋洗得到的淋洗曲线。
有时，在淋洗液中加入一定的络合剂，降低金属离子与树脂的亲和力， 从而使得NH4 +, Na+能对二、三价的金属离子起到置换作用。 Li+＜H+＜Na+＜NH4+＜K+＜Rb+＜Cs+＜Ag+＜Tl+
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀， 用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由 于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著 降低。
层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使支持 板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小 心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀，并放出 过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则 在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这 个过程，直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降 到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免 加样时扰乱离子的钠盐混合溶
液通过一支Ac-交换柱的淋洗曲线。
二、离子交换色谱的操作技术
1）交换柱的准备： 填充均匀
2）淋洗 加样时不能扰动柱床。 要求有恒定的流速，否则出现不规则小峰。
3）流出液的收集与分析 手工检测/自动分析？ 绘制淋洗曲线（浓度与淋洗体积V）
层析柱的基本装置如图。层析柱通常是玻璃的。
的柱子 装柱通常采用重力下沉法。将树脂用蒸馏水调成浆状，在柱内加入
3cm的蒸馏水，然后到入浆状树脂，让其在重力作用下下沉。（匀浆法） 不能有裂缝。 2）流速
最佳流速根据树脂的性能、粒度大小、交换反应的快慢等由实验结果 确定。
流速应稳定、适中.太快，难以有效分离，或者出现紊流，是本来已 经分开的组分重新混合；太慢，耗时，也可能由于扩散使分离效率降低。 （通常可调范围有限。）
长柱分辨力好（柱子径高比一般在1：5-10 ），但大
量物质的处理则用粗的柱比较适宜。
分离材料: 又称为色谱填料、固定
相等。可以是硅胶、氧化铝或者其他 如氧化锆、活性炭、……、壳聚糖微 球等。
在装柱前这些材料要用溶剂平衡， 另外还需作一些预处理。例如，凝胶 层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热 或酸处理来活化，离子交换树脂需要 用酸碱处理来得到所需的电离形式。
第五章 离子交换色谱法
1903-1906年，俄国植物学家Tswett发表了叶绿素和其他植物色素分 离过程的描述。但直到25年后才得到公认。
Twestt的色素分离 过程说明 1、层析柱（即玻璃管） 2、装入固定相（“CaCO3”）； 3、从上面加入植物色素，然后
用石油醚淋洗； 4、分离成为有“颜色的谱
2）置换色谱：先将较大量的样品（通常接近柱的满负载） 通过交换柱，然后用亲和力比组分A、B、C都强的离子作 淋洗剂，将样品组分依次置换下来，得到部分重叠的淋洗 曲线。可用于大量物质的制备分离。又称顶替or排代色谱。
3）前沿色谱：将样品直接通过交换柱，最先流出的组分 可以部分得到纯的组成（不需要淋洗剂）。实际应用不多。 又称迎头色谱。
淋洗色谱：
Li+，Na+，K+ 的分离： （1）含有Li+，Na+，K+的混合溶液通过强酸型阳
离子交换树脂柱，三种离子都被树脂吸附。 （2）用0.1mol/L的HCl淋洗，三种离子都被洗脱。 （3）根据树脂对这三种离子亲和力的不同，依次得
到不同的金属离子（见淋洗曲线）。 （4）将洗脱下来的Li+，Na+，K+分别用容器收集
3）淋洗液的性质与浓度（重要的影响因素！）
浓度太高，组分很快被洗脱，未能得到分离；浓度太低分离时间延 长，并出现拖尾现象。
有时可采用梯度淋洗法，即用两种或两种以上浓度的同一种淋洗液 按一定顺序淋洗，其效果见图。有时，还采用酸度、温度梯度淋洗。
在分离稀土元素时，性质差别小，为了扩大差异，可加入柠檬酸作 淋洗剂（络合淋洗，非简单的交换）。 4）温度
提高温度可以加快传质速度，加快反应速度（如络合交换），有利 于改善分离效果。（但操作上有一定的难度。） 5）交换柱的长度、内径
结合分离效率、实际需求（样品量）、操作难易（填充均匀性、柱 压）等考虑。
梯度淋洗 等度淋洗
四、离子交换色谱法的应用
同离子交换分离法。（色谱方法与离子交换法相互 结合，提高了分离效率，尤其是性质相似物质的分离或 者多种组分的分离。） 例：氨基酸的分离