蛋白相互作用酵母双杂交.pptx
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酵母双杂交系统技术介绍ppt课件
QDO/X/A
2266 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: 传统细菌筛选培养
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
提取质粒
刮取平板上的 菌落，提取质 粒。
转化酵母菌
将提取的质粒 转化Y187， 获得酵母 。Mating筛选将文库与诱饵 培养液混合， 进行Mating。 涂筛选板，挑 取阳性克隆子 。
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
1133 酵母双杂交系统技术介绍
G2
1/11/2020
•
主要内容
1144 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
•
Clontech 酵母双杂交系统: MM Series
1155 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
630467 Easy yeast Plasmid Isolation Kit
2299 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
•
验证互作: 体内验证
630305
Mammalian Matchmaker TwoHybrid Assay Kit 2
SEAP
3300 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•构建: Clontech MM构建方法
SMART合成cDNA 共转化，涂板 培养，收集菌液 分装，冻存1ml mating
SMART cDNA
两
小
时
聪明的酵母
构
自己
建
做克隆
Y187
文 库
同源重组
SD/Leu-
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
结合后的复合物可以激活或抑制报告基因的表达，从而判断待研究的蛋 白质是否与DNA相互作用。
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
j酵母双杂交 ppt课件
酵母双杂交
专业：微生物与生化药学 学号：21140811040 姓名：崔小清
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
1
酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System
酵母双杂交系统是在1989年由StanleyFields和k-kyu Song首次提出并初步建立的在酿酒酵母体内分析蛋白质与 蛋白质相互作用的系统。
16
具体事例
《应用酵母双杂交筛选与 FAM172A相互作用蛋白的研究》
FAM172A蛋白的生理功能之一是参与细胞生长的调控, 与糖尿病大血管为深入研究新发现的 蛋白质 FAM172A，生物学功能及在疾病中的作用奠定基础。 FAM172A基因的过表达改 变了细胞周期的分布，促使细胞从 G1期加速向 S期过渡，最终促进了HEK293 细 胞 的 增 殖，抑 制 了 细 胞 凋 亡，因 此， FAM172A基因可以通过抑制细胞凋亡，增加细胞增 殖而促进细胞的生长。
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
17
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
18
1、材/OB，酵 母表达载体p GB-VectorB，PDC315-FAM172A质粒。
2、主要试剂和试剂盒 营养缺陷培养基（Leu-/Trp-、 Leu-/Trp- /His-），X-gal，Sfi Ⅰ限制性内切 酶，T4DNA连接酶， 鲑鱼精 DNA， 高保真Pfu DNA 聚合酶，DNA胶回 收试剂盒，PCR产物回收试剂盒
自建立已有153年的历史，已经逐步发展成一个较完 善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统，并基于原初
的基本原理衍生了一系列类似的系统：酵母单杂交系统、
反向双杂交系统、三杂交系统，还有人预测，将来还可
专业：微生物与生化药学 学号：21140811040 姓名：崔小清
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
1
酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System
酵母双杂交系统是在1989年由StanleyFields和k-kyu Song首次提出并初步建立的在酿酒酵母体内分析蛋白质与 蛋白质相互作用的系统。
16
具体事例
《应用酵母双杂交筛选与 FAM172A相互作用蛋白的研究》
FAM172A蛋白的生理功能之一是参与细胞生长的调控, 与糖尿病大血管为深入研究新发现的 蛋白质 FAM172A，生物学功能及在疾病中的作用奠定基础。 FAM172A基因的过表达改 变了细胞周期的分布，促使细胞从 G1期加速向 S期过渡，最终促进了HEK293 细 胞 的 增 殖，抑 制 了 细 胞 凋 亡，因 此， FAM172A基因可以通过抑制细胞凋亡，增加细胞增 殖而促进细胞的生长。
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
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j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
18
1、材/OB，酵 母表达载体p GB-VectorB，PDC315-FAM172A质粒。
2、主要试剂和试剂盒 营养缺陷培养基（Leu-/Trp-、 Leu-/Trp- /His-），X-gal，Sfi Ⅰ限制性内切 酶，T4DNA连接酶， 鲑鱼精 DNA， 高保真Pfu DNA 聚合酶，DNA胶回 收试剂盒，PCR产物回收试剂盒
自建立已有153年的历史，已经逐步发展成一个较完 善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统，并基于原初
的基本原理衍生了一系列类似的系统：酵母单杂交系统、
反向双杂交系统、三杂交系统，还有人预测，将来还可
酵母双杂交原理ppt演示
第一个蛋白质是DNA结合域，通常来源于酵母转录因子GAL4，能够特异结合上游 激活序列；第二个蛋白质是转录激活域，能够激活转录起始复合物的形成。
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
(2021)蛋白相互作用完美版PPT
在体外和体内(大肠杆菌BL21 中) 分别证明了,只有借助亮氨酸拉链的相互作用,GFP 的2 个多肽片段才能够靠近,重新形成完整的GFP
的第158 位氨基酸. 在体外和体内(大肠杆菌BL21 蛋白,并发射荧光.
青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）为目前蛋白-蛋白相互作用研究中
单,由于只是检测荧光的有无, 因而背景干净, 检测更加灵敏. 重建后的荧光蛋白结构较 稳定,双分子荧光互补技术还可以用于研究 蛋白质之间的弱相互作用或瞬间相互作用[
3) 必须通过酵母细胞培养才能观察到结果,耗时较长.
的亮氨酸拉链介导的GFP 重组实验. 该实验选用 两段重组基因在细胞中融合表达，若目标蛋白间存在相互作用，通过linker 牵引荧光蛋白的N 端片段与C 端片段就能够相互靠近，进而
形成荧光蛋白生色团重新发出荧光.
了易被检测的GFP 蛋白,将其从氨基酸Gln157- 系统中相互作用的蛋白在其天然环境中处于不同
在荧光显微镜下检测是否有互补荧光产生，就可 以推断出两目标蛋白是否发生了相互作用。
Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)
Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)
• 优点： • BiFC系统对仪器要求低、数据处理相对简
Identifying Protein-Protein Interactions: FRET
Identifying Protein-Protein Interactions: FRET
• 青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色 荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）为目前蛋白 -蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射 光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体 蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋 白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧 光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测 量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。 两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就 越多，检测器所接收到的荧光就越少。
的第158 位氨基酸. 在体外和体内(大肠杆菌BL21 蛋白,并发射荧光.
青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）为目前蛋白-蛋白相互作用研究中
单,由于只是检测荧光的有无, 因而背景干净, 检测更加灵敏. 重建后的荧光蛋白结构较 稳定,双分子荧光互补技术还可以用于研究 蛋白质之间的弱相互作用或瞬间相互作用[
3) 必须通过酵母细胞培养才能观察到结果,耗时较长.
的亮氨酸拉链介导的GFP 重组实验. 该实验选用 两段重组基因在细胞中融合表达，若目标蛋白间存在相互作用，通过linker 牵引荧光蛋白的N 端片段与C 端片段就能够相互靠近，进而
形成荧光蛋白生色团重新发出荧光.
了易被检测的GFP 蛋白,将其从氨基酸Gln157- 系统中相互作用的蛋白在其天然环境中处于不同
在荧光显微镜下检测是否有互补荧光产生，就可 以推断出两目标蛋白是否发生了相互作用。
Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)
Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)
• 优点： • BiFC系统对仪器要求低、数据处理相对简
Identifying Protein-Protein Interactions: FRET
Identifying Protein-Protein Interactions: FRET
• 青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黄色 荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）为目前蛋白 -蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射 光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体 蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋 白之间的距离在5-10nm的范围内，则供体CFP发出的荧 光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时通过测 量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。 两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就 越多，检测器所接收到的荧光就越少。
酵母单、双杂交PPT
Amp抗 评 价及 鉴定分装 及冻存诱饵质粒构建流程
目 的 基 因 合 成
载目
重
体的
组
的片
鉴
连段
定
接与
重 组 质 粒 纯 化
诱饵质粒 自激活 及细胞质 定位检测
自激活检测 （排除bait蛋白可 与myristlyation
signal结合）
细胞质定位检测 （用于验证Sos-bait
信号(Myr) ，加入galactose可诱导表达
Sos蛋白介导的双杂交系统原理
人类Sos蛋白和所研究的基因融合而成诱饵蛋白。靶蛋白上连有一 个十四烷基化（Myristylation）膜定位信号，它使靶蛋白锚定到细 胞膜上。诱饵和靶蛋白的相互作用使人类Sos蛋白在酵母细胞膜上定 位，从而激活Ras信号转导级联反应（cascade）。
细胞信号传导研究
通过细胞内一系列蛋白 质间的相互作用或蛋白质与 其它分子间的相互作用完成 的
5 Part
赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
酵母单、双杂交验证实验
基因克隆的获得
及DNA测序检验
1
每个基因克隆的酵母
双杂交自激活检验
3
赛尔 生物
基因的酵母单、双杂交
2
载体构建及其DNA测序
检验
酵母细胞内的蛋白-蛋
酵母菌株标志性表型的鉴定
确
定
酵 母 菌 表 型
营养缺陷 型筛选
Trp(-)、Leu (-) 、 His (-) 、Ura (-) 不能生长，在 YPDA上可以生长
检测 回复 突变
接种于YPDA 培养基， 25℃有菌生长， 37 ℃无菌生长构建流程ds cDNA ＋
连接并转化 XL1-blue 感受态细菌
酵母双杂交系统PPT课件
低约4个数量级。 • 最后，在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株
生长及报告基因的表型。
第14页/共19页
酵母双杂交系统的应用
• 酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白 质在体研究体系，双杂交系统主要应用于 ：
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人 以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSn相互作用的新蛋白Synphilin-1
第16页/共19页
酵母双杂交系统方法的优化
• (1)酵母接合型的引入:Bendixen etal 通过酵母接合型的引用， 避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。
• (2)诱饵表达载体: 常用的有二种，酵母细胞的GAL4 和来自大肠 杆菌的LexA，二者的差别在于LexA 不具有核定位序列。
• (3)猎物表达载体: 酵母GAL4 的转录激活域；来自单纯疱疹病毒 的VP16，其转录活性较高；来自大肠杆菌的B42转录活性弱，但 可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响。
主要从以下几方面介绍 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
第1页/共19页
酵母双杂交系统的概念
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白 间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学 的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全 面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
生长及报告基因的表型。
第14页/共19页
酵母双杂交系统的应用
• 酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白 质在体研究体系，双杂交系统主要应用于 ：
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人 以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSn相互作用的新蛋白Synphilin-1
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酵母双杂交系统方法的优化
• (1)酵母接合型的引入:Bendixen etal 通过酵母接合型的引用， 避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。
• (2)诱饵表达载体: 常用的有二种，酵母细胞的GAL4 和来自大肠 杆菌的LexA，二者的差别在于LexA 不具有核定位序列。
• (3)猎物表达载体: 酵母GAL4 的转录激活域；来自单纯疱疹病毒 的VP16，其转录活性较高；来自大肠杆菌的B42转录活性弱，但 可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响。
主要从以下几方面介绍 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
第1页/共19页
酵母双杂交系统的概念
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白 间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学 的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全 面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
蛋白相互作用酵母双杂交
Slide 3
3
蛋白质相互作用研究技术
Genetic
Yeast Two-hybrid Phage Display Mutational analysis
Chemical
Crosslinking Label-transfer FeBABE mapping
Biochemical
Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (Co-
5
噬菌体展示技术的原理
基因型
表达型
融合蛋白 PIII
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体衣壳 蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随衣壳蛋白的表达而表达， 同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。通过体 外亲和（绑定）靶分子筛选到的噬菌体克隆经过下一轮扩增而富集。
–Ade minimal medium.
AUR1-C. A dominant mutant version of the AUR1 gene that encodes the enzyme inositol
phosphoryl ceramide synthase.its expression confers strong resistance (AbAr) to the otherwise
感染 和扩增
E.coli
编辑ppt
11 Slide 11
编辑ppt
Slide 12
பைடு நூலகம்
12
编辑ppt
Slide 13
13
GST-pull down原理
RIGI
Experimental (GST-Fusion)
GST
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
征性报动物的蛋白结合
根据这个特性,将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在同 一个表达载体上,在酵母中表达两者的
BD-Bait protein融合表达载体上,在酵母中
表达两者的融合蛋白.
如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用,那
么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激 活结构域就会相互作用,从而激活lacZ报 道基因的表达.所以我们可以通过转化的
酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否 有相互作用.
•
这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4,又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP,因此, 酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长.当上 述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能
•
原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子.研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构, 可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点UAS；而转录激活结构域可与 RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用,提高RNA 聚合酶的活性.在这 一过程中,DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.
•
据此,我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白,只要他
能与我们想要了解的目的基因相互作用,就照样可以通过其转录激活
结构域激活RNA聚合酶,从而启动对下游报告基因的转录.
•
正是基于这一理论,酵母单杂•
另外,也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因
之间功能相关的主要方法.
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫ELISA、免疫共沉淀CO-IP技术都是利用抗原 和抗体间的免疫反应,可以研究抗原和抗体之间的相互作用,但 是,它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相 互作用.而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母 双杂交进行检测.
根据这个特性,将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在同 一个表达载体上,在酵母中表达两者的
BD-Bait protein融合表达载体上,在酵母中
表达两者的融合蛋白.
如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用,那
么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激 活结构域就会相互作用,从而激活lacZ报 道基因的表达.所以我们可以通过转化的
酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否 有相互作用.
•
这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4,又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP,因此, 酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长.当上 述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能
•
原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子.研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构, 可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点UAS；而转录激活结构域可与 RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用,提高RNA 聚合酶的活性.在这 一过程中,DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.
•
据此,我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白,只要他
能与我们想要了解的目的基因相互作用,就照样可以通过其转录激活
结构域激活RNA聚合酶,从而启动对下游报告基因的转录.
•
正是基于这一理论,酵母单杂•
另外,也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因
之间功能相关的主要方法.
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫ELISA、免疫共沉淀CO-IP技术都是利用抗原 和抗体间的免疫反应,可以研究抗原和抗体之间的相互作用,但 是,它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相 互作用.而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母 双杂交进行检测.
【资料】酵母双杂交ppt汇编
NA2CO3终止反应
Z Buffer洗涤
取上清，测定 420nm下OD值
液氮中冻融3次
β-半乳糖苷酶活性=1000×OD420/（t×V×OD600）
酵母双杂交系统的应用
❖ 验证通过其他方法发现的蛋白质间可能 的相互作用
❖ 确定蛋白质特异相互作白质
Functions of OsBZR1 and 14-3-3 proteins in brassinosteroid signaling in rice PNAS 2007, 104(34):13839–13844
Gal4 AD
Gal4
a rice cDNA library
full-length OsBZR1
MATCHMAKER GAIL Two-Hybrid System 3 双杂交系统
酵母菌株
质粒
实验流程
❖ 诱饵质粒的构建及表达 ❖ cDNA的构建和鉴定(猎物载体的构建和表步确定 ❖ 阳性克隆的测序分析 ❖ β-半乳糖苷酶活性定量分析
BD
reporter
Sequences of the putative 14-3-3 binding site inOsBZR1 and its mutagenized version S156G.
Interaction between OsBZR1 and GF14c in yeast two-hybrid assays
应SD平板上
阳性克隆的测序分析
将已验证为阳性克隆的AD质粒测序，通过BLAST进行核 酸序列同源性分析
β-半乳糖苷酶活性定量分析
阳性克隆SD-2中 转接YPAD培养至
30℃培养过夜Leabharlann OD600=1.0-1.5
《酵母双杂交自激活》课件
利用酵母双杂交自激活技术揭示疾病 发生和发展过程中蛋白质相互作用机 制，为疾病诊断和治疗提供新思路。
利用酵母双杂交自激活技术检测生物 安全威胁和生物防御，为公共卫生安 全提供有力保障。
药物发现与筛选
通过酵母双杂交自激活技术筛选潜在 的药物靶点，发现新的药物候选分子 ，加速药物研发进程。
未来研究的方向与挑战
酵母双杂交自激活的实例分
03
析
实验材料与试剂
01 酵母菌株
用于表达不同蛋白的酵母 菌株。
03 重组蛋白
用于构建融合蛋白的蛋白
。
02 培养基
用于培养酵母菌株的培养
基。
04 抗体
用于检测融合蛋白的表达
和相互作用。
实验步骤与操作
构建融合蛋白
将目的蛋白与诱饵蛋白或检测蛋 白融合，构建成融合蛋白。
转化酵母细胞
实验流程
准备实验材料
选择适当的酵母菌株、质粒载体、酶、DNA 片段等。
构建融合蛋白
将目的蛋白与转录激活域或DNA结合域融合， 构建成融合蛋白表达载体。
转化酵母细胞
将融合蛋白表达载体转化入酵母细胞中。
筛选阳性克隆
通过抗生素筛选、PCR鉴定等方法筛选出成功转化 的阳性克隆。
检测报告基因表达
通过β-半乳糖苷酶活性检测、荧光素酶活性检测 等方法检测报告基因的表达水平。
THANKS
感谢观看
结果判断
根据实验结果，判断融合 蛋白之间是否存在相互作 用。
讨论
对实验结果进行深入讨论 ，分析可能的影响因素和 实验误差，提出改进措施 和未来研究方向。
酵母双杂交自激活的未来发
04
展与展望
酵母双杂交自激活技术的改进与创新
酵母杂交技术原理及应用ppt课件
目的基因的分离
目的基因的功能克隆 序列克隆法 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术 利用差示分析法分离目的基因克隆
DNA插入诱变法分离目的基因 根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆
目的基因的功能克隆
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他蛋白分离技术分离出一定发育时期的特异蛋白 应用蛋白质测序技术测定特异氨基酸序列， 推测编码该蛋白的核苷酸序列，人工酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激 活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白 在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质 的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。
在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。
酵母单杂交
酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对 报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术 则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细 胞内的基因表达调控。
酵母双杂交系统的优点和特点
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点: ⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而
给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 ⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 ⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于
返回
酵母双杂交
1）将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein （诱饵蛋白）的基因 构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait prot上。 同时将上述两种载体转化改造后的酵母 （这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成ADE、 HIS 、
目的基因的功能克隆 序列克隆法 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术 利用差示分析法分离目的基因克隆
DNA插入诱变法分离目的基因 根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆
目的基因的功能克隆
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他蛋白分离技术分离出一定发育时期的特异蛋白 应用蛋白质测序技术测定特异氨基酸序列， 推测编码该蛋白的核苷酸序列，人工酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激 活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白 在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质 的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。
在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。
酵母单杂交
酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对 报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术 则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细 胞内的基因表达调控。
酵母双杂交系统的优点和特点
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点: ⑴ 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而
给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 ⑵ 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 ⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于
返回
酵母双杂交
1）将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein （诱饵蛋白）的基因 构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait prot上。 同时将上述两种载体转化改造后的酵母 （这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成ADE、 HIS 、
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Slide 26
酵母质粒双酶切线性化
10×NEB buffer 100×BSA EcoR I BamH I pGBKT7
1ul 0.1ul 0.2ul 0.2ul 8.5ul
37℃，3h
Slide 27
融合酶融合
5×In-Fusion HD Enzyme Premix Linearized Vector(50-200ng) Purified PCR Fragment(10-200ng) dH2O
Protein-protein Interaction
• 蛋白质之间相互作用以及通 过相互作用而形成的蛋白复 合物是细胞各种基本功能的 主要完成者。
• 几乎所有的重要生命活动， 包括DNA的复制与转录、蛋 白质的合成与分泌、信号转 导和代谢等等，都离不开蛋 白质之间的相互作用。
Slide 3
蛋白质相互作用研究技术
蛋白相互作用与酵母双杂交
Protein-protein Interaction &
Yeast Two-hybrid
黄宝玉 2012.8.17
Slide 1
报告内容： 1.蛋白相互作用与研究方法 2.酵母双杂交原理和方法 3.酵母双杂交的发展 4.已有实验的进展 5.存在问题与下一步计划
Slide 2
30min
3. 加入DMSO, 轻弹混匀
20ul
4. 42℃水浴，每5min轻弹混匀
15min
5. 离心，弃上清，10000rpm
15s
6. 用0.9% NaCl重悬
1ml
7 取适量菌液涂布在相应的筛选培养基上。
我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。 PEG是一种高分子聚合物, 在酵母
转化中起到在高浓度醋酸锂环境中 保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结 构的过度损伤,同时促进质粒与细胞 膜接触更紧密。
Slide 31
涂布单缺培养基
pGADT7 Amp+ -Leu pGBKT7 Kan+ -Trp
Slide 32
挑选发育良好菌落mating并随后二缺四缺 培养基筛选
Slide 33
酵母双杂交系统的自激活验证
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上 游活化序列（GAL UAS）结合，但不能引 起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到BD载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母 双杂中的自激活现象。
IP) Pull-Down Assays Far Western
Fluorescent
Immunofluorescence co-localization
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Slide 4
Slide 5
噬菌体展示技术的原理
Y
Promoter
transcription
reporter gene
(Fields&Song,1989)
Slide 19
酵母双杂交系统:三个启动子，四个报告基因
Slide 20
三个启动子，四个报告基因
HIS3. When bait and prey proteins interact, Gal4-responsive His3 expression permits the cell to biosynthesize histidine and grow on –His minimal medium. ADE2.When two proteins interact, Ade2 expression is activated, allowing these cells to grow on –Ade minimal medium. AUR1-C. A dominant mutant version of the AUR1 gene that encodes the enzyme inositol phosphoryl ceramide synthase.its expression confers strong resistance (AbAr) to the otherwise highly toxic drug Aureobasidin A. MEL1. MEL-1 encodes α-galactosidase. As a result of two-hybrid interactions, α-galactosidase (MEL1) is expressed and secreted by the yeast cells. Yeast colonies that express Mel1 turn blue in the presence of the chromagenic substrate X-a-Gal.
2 ul x ul x ul x ul
10ul
50℃，15min。 Then place on ice.
Slide 28
转化大肠杆菌感受态并测序
重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
挑阳性克隆进行菌落pcr
送测序
测序正确提取质粒
Slide 29
测序正确的质粒转化酵母
酵母菌株感受态细胞制备：
1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30℃培养3天左 右。 2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行 做3管）30℃，250rpm，培养8-12h 3.取200ul 菌液，测OD600 。 4.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50ml新鲜 的YPDA培养基中30℃ ，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3。 5. 将 培 养 好 的 菌 液 转 入 2 个 50ml 离 心 管 ， 室 温 离 心 3000g ， 3min ， 弃 上 清 ， 用 100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。 6.30℃ ，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）。 7.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用 30ml ddH2O重悬。 8.再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.5ml 1.1×TE/LiAc重悬。 9.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s。 10.弃上清，每管用600ul 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进 行转化。
基因型
表达型
融合蛋白 PIII
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体衣壳 蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随衣壳蛋白的表达而表达， 同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。通过体 外亲和（绑定）靶分子筛选到的噬菌体克隆经过下一轮扩增而富集。
Slide 6
Solution phase selection with biotinylated antigen
Slide 21
酵母双杂交所用的两个质粒载体
Slide 22
Restriction Map and Multiple Cloning Site (MCS) of pGBKT7
Slide 23
Restriction Map and Multiple Cloning Site (MCS) of pGADT7.
antigen biotin
Slide 7
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
Slide 8
Wash to remove unbound phage particles.
Slide 9
Elute bound phage
Slide 10
Amplify eluted phage
Genetic
Yeast Two-hybrid Phage Display Mutational analysis
Chemical
Crosslinking Label-transfer FeBABE mapping
Biochemical
Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (Co-
Slide 16
酵母双杂交系统的功能
Slide 17
酵母双杂交的简单介绍
酵母双杂交原理图
Slide 18
酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
GAL4 UAS
Promoter
reporter gene
AD
Y
reporter gene
X
DNA-BD
GAL4 UAS
AD
Slide 30
测序正确的质粒转化酵母
Transformation of Competent Yeast Cells:
1. 加入质粒DNA
鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml) 加入感受态细胞, 轻弹混匀 加入PEG/LiAc, 轻弹混匀
100-500ng
5ul 50ul 500ul
Hale Waihona Puke 2. 30℃水浴，每10轻弹混匀
GST
MAVS
Control (GST)
GST
GST
MAVS
RIGI
RIGI
GST
Wash SDS-PAGE
GST沉降示意图
Slide 14
Cross-linking
Slide 15
报告内容： 1.蛋白相互作用与研究方法 2.酵母双杂交原理和方法 3.酵母双杂交的发展 4.已有实验的进展 5.存在问题与下一步计划
Repeat selection
酵母质粒双酶切线性化
10×NEB buffer 100×BSA EcoR I BamH I pGBKT7
1ul 0.1ul 0.2ul 0.2ul 8.5ul
37℃，3h
Slide 27
融合酶融合
5×In-Fusion HD Enzyme Premix Linearized Vector(50-200ng) Purified PCR Fragment(10-200ng) dH2O
Protein-protein Interaction
• 蛋白质之间相互作用以及通 过相互作用而形成的蛋白复 合物是细胞各种基本功能的 主要完成者。
• 几乎所有的重要生命活动， 包括DNA的复制与转录、蛋 白质的合成与分泌、信号转 导和代谢等等，都离不开蛋 白质之间的相互作用。
Slide 3
蛋白质相互作用研究技术
蛋白相互作用与酵母双杂交
Protein-protein Interaction &
Yeast Two-hybrid
黄宝玉 2012.8.17
Slide 1
报告内容： 1.蛋白相互作用与研究方法 2.酵母双杂交原理和方法 3.酵母双杂交的发展 4.已有实验的进展 5.存在问题与下一步计划
Slide 2
30min
3. 加入DMSO, 轻弹混匀
20ul
4. 42℃水浴，每5min轻弹混匀
15min
5. 离心，弃上清，10000rpm
15s
6. 用0.9% NaCl重悬
1ml
7 取适量菌液涂布在相应的筛选培养基上。
我们采用的是PEG/ LiAc法转化酵母。 PEG是一种高分子聚合物, 在酵母
转化中起到在高浓度醋酸锂环境中 保护细胞膜,减少醋酸锂对细胞膜结 构的过度损伤,同时促进质粒与细胞 膜接触更紧密。
Slide 31
涂布单缺培养基
pGADT7 Amp+ -Leu pGBKT7 Kan+ -Trp
Slide 32
挑选发育良好菌落mating并随后二缺四缺 培养基筛选
Slide 33
酵母双杂交系统的自激活验证
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上 游活化序列（GAL UAS）结合，但不能引 起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到BD载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母 双杂中的自激活现象。
IP) Pull-Down Assays Far Western
Fluorescent
Immunofluorescence co-localization
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Slide 4
Slide 5
噬菌体展示技术的原理
Y
Promoter
transcription
reporter gene
(Fields&Song,1989)
Slide 19
酵母双杂交系统:三个启动子，四个报告基因
Slide 20
三个启动子，四个报告基因
HIS3. When bait and prey proteins interact, Gal4-responsive His3 expression permits the cell to biosynthesize histidine and grow on –His minimal medium. ADE2.When two proteins interact, Ade2 expression is activated, allowing these cells to grow on –Ade minimal medium. AUR1-C. A dominant mutant version of the AUR1 gene that encodes the enzyme inositol phosphoryl ceramide synthase.its expression confers strong resistance (AbAr) to the otherwise highly toxic drug Aureobasidin A. MEL1. MEL-1 encodes α-galactosidase. As a result of two-hybrid interactions, α-galactosidase (MEL1) is expressed and secreted by the yeast cells. Yeast colonies that express Mel1 turn blue in the presence of the chromagenic substrate X-a-Gal.
2 ul x ul x ul x ul
10ul
50℃，15min。 Then place on ice.
Slide 28
转化大肠杆菌感受态并测序
重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
挑阳性克隆进行菌落pcr
送测序
测序正确提取质粒
Slide 29
测序正确的质粒转化酵母
酵母菌株感受态细胞制备：
1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30℃培养3天左 右。 2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行 做3管）30℃，250rpm，培养8-12h 3.取200ul 菌液，测OD600 。 4.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50ml新鲜 的YPDA培养基中30℃ ，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3。 5. 将 培 养 好 的 菌 液 转 入 2 个 50ml 离 心 管 ， 室 温 离 心 3000g ， 3min ， 弃 上 清 ， 用 100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。 6.30℃ ，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）。 7.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用 30ml ddH2O重悬。 8.再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.5ml 1.1×TE/LiAc重悬。 9.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s。 10.弃上清，每管用600ul 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进 行转化。
基因型
表达型
融合蛋白 PIII
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体衣壳 蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随衣壳蛋白的表达而表达， 同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。通过体 外亲和（绑定）靶分子筛选到的噬菌体克隆经过下一轮扩增而富集。
Slide 6
Solution phase selection with biotinylated antigen
Slide 21
酵母双杂交所用的两个质粒载体
Slide 22
Restriction Map and Multiple Cloning Site (MCS) of pGBKT7
Slide 23
Restriction Map and Multiple Cloning Site (MCS) of pGADT7.
antigen biotin
Slide 7
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
Slide 8
Wash to remove unbound phage particles.
Slide 9
Elute bound phage
Slide 10
Amplify eluted phage
Genetic
Yeast Two-hybrid Phage Display Mutational analysis
Chemical
Crosslinking Label-transfer FeBABE mapping
Biochemical
Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (Co-
Slide 16
酵母双杂交系统的功能
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酵母双杂交的简单介绍
酵母双杂交原理图
Slide 18
酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
GAL4 UAS
Promoter
reporter gene
AD
Y
reporter gene
X
DNA-BD
GAL4 UAS
AD
Slide 30
测序正确的质粒转化酵母
Transformation of Competent Yeast Cells:
1. 加入质粒DNA
鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml) 加入感受态细胞, 轻弹混匀 加入PEG/LiAc, 轻弹混匀
100-500ng
5ul 50ul 500ul
Hale Waihona Puke 2. 30℃水浴，每10轻弹混匀
GST
MAVS
Control (GST)
GST
GST
MAVS
RIGI
RIGI
GST
Wash SDS-PAGE
GST沉降示意图
Slide 14
Cross-linking
Slide 15
报告内容： 1.蛋白相互作用与研究方法 2.酵母双杂交原理和方法 3.酵母双杂交的发展 4.已有实验的进展 5.存在问题与下一步计划
Repeat selection