放射免疫分析技术和免疫放射分析技术
体外分析技术
Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。
放射免疫技术
常见标记免疫技术
放射免疫技术 酶免疫技术
荧光免疫技术
第一节 放射免疫技术
早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的 放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的 免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特 异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便 且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和 临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药 物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起 到了极大地推动作用。
比放射性－自身置换法 标准曲线与自身置换曲线平行
表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合 的抗原物质总量相同 计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算 为nCi/ml) 计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量 (ng/ml) 以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直 线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng)
效价
五、方法学评价
除了常规的灵敏度、精密度、准确性、 特异性和稳定性之外，应注意以下指标：
可靠性 剂量-反应曲线 高剂量钩状效应
第二节 放射免疫分析
一、放射免疫分析－基本原理
竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 Ag*和Ag具有等同的
小 结
放射免疫技术的基本原理是放射性核素可探测的灵敏性、 精确性与抗原抗体反应的特异性相结合，主要包括RIA 和IRMA。RIA所用的标记物应具备高比活度、高纯度 和完整的免疫活性；抗血清应具有较高的抗体亲和力、 高度的特异性和适宜的工作滴度；标准品浓度需按标准 进行标定；结合与游离反应物的分离（二抗法、PEG法、 PR试剂法和固相法）应彻底、迅速、不影响反应平衡、 非特异性低和操作简便。拟合标准曲线需根据不同检测 项目和不同的要求选用恰当的反应参数。
核医学名解
放射免疫分析法：放射免疫分析法属竞争性放射配体结合分析技术，其基础是放射性标记的抗原和非标记抗原（标准抗原或被测抗原）同时与限量的特异性抗体进行的竞争结合反应。
有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度高以及广泛应用等特点，是疾病诊断和医学研究的重要方法。
免疫放射分析法：本法属非竞争性放射配体结合分析技术，它与以RIA为代表的竞争性放射配体分析技术的主要区别有两点，其一是用放射性核素标记抗体去测抗原，而不是像RIA法那样用标记抗原去测抗原；其二是采用过量抗体，而不是像RIA法那样采用限量抗体。
IRMA法与RIA法相比较，前者提高了检测的灵敏度，并使检测范围增宽，特异性和精确度也得到进一步提高，故已在临床上推广应用，前景看好。
放射受体分析法：本法属竞争性放射配体结合分析技术之一种，其原理与RIA法相似，所不同者是以组织受体代替RIA中的抗体作为结合剂，本法的检测对象是配体。
受体放射分析法：它的检测对象是受体，可以分析组织中所含某种受体的种类和数量。
本法采用放射性核素标记的配体（如受体的激动剂或阻断剂），使之在饱和结合条件下与相应受体形成复合物，根据该复合物的最大放射性及所用标记配体的比活度即可推算出受体的数量。
交叉性失联络：当大脑皮质存在局限性放射性分布减低或缺损时，对侧小脑或大脑放射性分布亦呈放射性减低，多见于慢性脑血管病，可能系一种自我保护机制，机制未明。
过渡灌注现象：在脑血流灌注显像中，一些缺血性病灶周围可出现放射性浓聚区，常发生在短暂性脑缺血发作（TIA）、脑梗死亚急性期和慢性期的病灶旁。
肺灌注显像：肺灌注显像又称肺血流显像。
将略大于肺毛细管直径的放射性微粒注入静脉，微粒随血流到达肺血管床，一过性嵌顿在肺的毛细血管或肺小动脉内，其分布与该处的灌注血流量成正比。
在体外用核医学设备对放射性微粒在肺内的分布进行显像，即可得到反映肺血流灌注的影像。
肺通气显像：肺通气显像是反复吸入密闭系统中的放射性气体或气溶胶，待其充盈气道和肺泡并达到平衡后，其在肺内的分布与肺的局部通气量成正相关。
放射免疫分析
• b. 常用的分离方法
• 1. 双抗体法
– 特点： 分离完全，非特异结 合小，环境影响小， 效价高，但分离时间 长，成本高。
• 2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000）
– 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大
• 3. 双抗体PEG法
– 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。
– 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间 长和沉淀法非特异性结合高的缺点。
• b. 抗血清的制备：
• 1.大分子物质可直接免疫动物诱导抗体产生，但 是小分子物质为半抗原，必须与载体结合制成人 工抗原（半抗原-蛋白质），才能进行免疫。 • 2．选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊。 • 3．应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛 脂、石蜡油 +卡介苗）。 • 4．选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股 沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加 强）与次数。
放免分析的优点
• 灵敏度高
• 特异性强
• 精确度高
• 用血量少
• 缺点：污染；放射性核素衰变及不 稳定
第三章 放射免疫分析
放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用
免疫放射分析法 （immunoradiometric assay， IRMA）
• 1968年，Miles和Hales创立了免疫放射分析法 （IRMA）。 • IRMA与IRA不同，它是将放射性核素标记在抗体 上，而不是标记在抗原上。同时所用的标记抗体 与待测抗原比较是过量的。
• CA50——胰腺癌、肝癌、结、直肠癌、卵 巢癌、子宫癌、胃癌、肺癌、食道癌。 • CA19-9——对胰腺癌和胆囊癌诊断有较高 特异性，阳性率＞80%，绝对值升高明显。 • CA125——非粘液性卵巢癌诊断特异性强。 • CYFRA21-1——肺癌的诊断和疗效观察。
放射免疫分析
放射免疫分析摘要：放射免疫技术（radio immunoassay ,RIA）类型主要包括经典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。
由于受接触放射性物质，损害操作人员的身体，测定完成后放射性材料的处置等问题的存在,再加上80年代初出现的非同位素标记技术得到了极大的发展和广泛应用，放射免疫技术的应用有下降的趋势。
0引言：放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。
目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。
关键词：结构，原理，临床应用1检测的基本结构原理、结构及其探测原理核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。
核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。
转换模式是放射能→光能→电能→脉冲。
液体闪烁测量是在闪烁杯内进行的，放射性样品主要被溶剂和闪烁剂分子包围，射线能量先被溶剂分子吸收，受激溶剂分子退激时释放出能量激发闪烁剂，当激发态回到基态时释放出光子到达光阴极，光阴极产生光电子，在光电倍增管的电场作用下，在阳极获得大量电子，形成脉冲信号，输入后读分析电路形成数据信号，最后由计算机数据处理，求出待测抗原含量。
放射性活度测定方法放射免疫分析中经抗原抗体反应和B、F分离后通过检测放射性量来反映待测物的含量。
放射性量的检测需特殊的仪器，放射免疫分析仪实际上就是进行放射性量测定的仪器。
测量仪器有两类，即晶体闪烁计数仪（主要用于检测γ射线，如125I、131I、57Cr等）和液体闪烁计数仪（主要用于检测β射线，如3H、32P、14C等）。
检验核医学放射免疫分析和免疫放射分析
3 标记Ag 常用125I和3H标记化合物 要求： (1)适当高的放射性比活度 影响方法的灵敏度和 精密度，标记Ag化学量≤被测Ag的最小量 (2)放射化学纯度>95% 影响方法的灵敏度 (3)免疫活性与未标记Ag基本保持一致 (4)稳定性好，在一定条件下，稳定期1-3月
标记Ag与Ab的用量对 测定的影响
实验室内部质量控制方法
1对实验数据进行审核剔除“坏点” 2剂量反应曲线拟合及质量审核 3精密度评价 (1)反应误差关系RER
从多批实验资料求出直线方程式 SDR = a + bR
a反映分离误差 b反映加样误差
(2)精密度图(P-P图) (用剂量反应曲线)
通过RER将SDR转换SDD(CVD%) 作SDD (CVD%) - lgD曲线 CVD%≤10%
[Q0]
1
[Q0]
B2 – B (1 + ——— + ——— ) + ——— = 0 (4)
[P0] K [P0]
[P0]
将B = 1 - F代入(3)
[Q0]
1
1
F2 – F (1 - ——— - ——— ) + ——— = 0 (5)
[P0]
K [P0] K [P0]
定义R = B / F，由B + F = 1得B = R / (1+R)代入(3)
偏差分析 2实验室外部质量控制(1)对某种分析方法的试剂
或试剂盒进行综合评价 (2)对不同实验室的分析工作
质量进行比较
质量控制样品 质控的“标准系统”－质控血清(QC) 要求：1 QC样品与待测样品性质相同
2 QC样品与待测样品中待测物相同，免疫活性一致 3 QC样品中待测物量已知，分高、中、低三档浓度 4足量制备，分装，低温存放，分批使用 制备方法：1按三档浓度收集多余病人血清，测定标示值
放射免疫分析技术
时间长
• 置换法： 3H 最常用
c. 标记产物的纯化：常用 Sephadex 层析，也可用硅胶 G 薄板层析
或 HPLC 分离
d. 标记产物的鉴定：常用 RIA 法
• 最大结合百分率 • 标准曲线比较法
e. 半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），
层析纯化
• d. 抗体的鉴定
•
鉴定内容：效价、亲和力、特异性
•
鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA
• e. 单克隆抗体的使用：
•
用于 IRMA 或 RIA，特异性高
•
不一定优于传统的多克隆抗体
5. 竞争性放射免疫分析法的建立
• （1）反应方式 • a. 平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育 • b. 顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入
酶免疫
• 检测方法 • 生化、常规免疫 • 荧光免疫、酶免疫 • 放射免疫、发光免疫 • PCR
检测范围 mg~μg（10-3 ~10-6 g） μg~ng（10-6 ~10-9 g） ng~pg（10-9 ~10-12 g） pg~fg（10-12 ~10-15 g）
一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay， RIA）
放射免疫分析技术
（Radioimmunoassay，RIA）
核医学
• 治疗：肿瘤、甲亢等
• 诊断 •
•
体内——PET、SPECT、 放射免疫成像等
体外——放射免疫分析（RIA）
标记免疫分析技术
•
用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的
2020厦门卫生事业单位备考：放射免疫分析和免疫放射分析的比较
2020厦门卫生事业单位备考：放射免疫分析和免疫放射分析的比较
放射免疫试验以放射性核素作为标记物，将放射性核素标记在抗原或抗体分子上，将免疫分析的特异性和放射性核素的敏感性完美结合。
放射免疫试验开创了体液超微量物质定量分析的新领域，并为酶免疫分析、发光免疫分析的建立和发展奠定了理论和实践基础。
其中，放射免疫分析(RIA)与免疫放射分析(IRMA)是放射免疫技术中的两种重要类型，分别是竞争性分析和非竞争性分析的典型案例,所以两者的区别是需要大家着重掌握的内容。
放射免疫分析免疫放射分析
标记物标记抗原标记抗体
抗体用量限量过量
分析模式竞争性分析非竞争性分析
测定时间十几小时几小时
分离技术双抗体-PEG法固相吸附法
数学函数反比例函数正比例函数
线性范围较窄较宽
应用范围小分子半抗原大分子抗原或抗体
对同一抗体有相同的亲合力，常采用PEG-第二抗体对（结合标记物）B或（游离标记物）F进行分离。
放射免疫分析多用于小分子半抗原（甾体激素）的定量分析，如胃泌素、醛固酮、血管紧张素等。
影响放射免疫试验的因素很多，优质检测试剂、严格技术操作、合理数据处理是获得理想实验结果的重要条件。
免疫放射分析则是以标记抗体为特点，为非竞争性免疫分析模式，以过量标记抗体与待测抗原进行非竟争性免疫结合反应，采用固相免疫吸附方式对B或F进行分离；免疫放射分析以双位点（双抗体夹心）法较为常用，适用于大分子蛋白质（多肽）的定量分析。
第七章-放射免疫分析技术和免疫放射分析技术(1)
(B/F)2+B/F(kAgt -kAbt +1)- kAbt =0
• 标准曲线：标准曲线可由B/F对Agt作图， 即为在放免分析中常用的标准曲线。
• 通过未知样品的B/F值，便可从曲线上读出 对应x轴上抗原浓度。
• 现工作中常用B/B0来表示，然后通过数学 模式来进行数据处理，可直接打印出求知 样品的测值。
• 1、灵敏度
• 所谓灵敏度，一般用最小检出量来表示， 但也有用零剂量的精密度来表示的。实际 上无论用哪种方法表示，某种物质的RIA， 总得表示出最小检测量，才能达到临床应 用的要求。
• 在RIA中，标准曲线的斜率反映其灵敏度， 即刚好能与被测物浓度为零时区分开来的 量。而斜率与亲和常数K成正比。
• 灵敏度的大小与K值有关，K值越大，灵敏 度超高。
• （二）标记抗体浓度对剂量反应曲线的影响
• 从图1－21可知，亲和常数Ka相同的抗体，抗体 含量越大，曲线欲达到饱和时需要更多的抗原， 这说明曲线的可测范围越宽。但应指出，由于标 记抗体量的增加，游离标记抗体也会增多，分离 时将有明显的分离误差，使NSB升高，因此测量 的灵敏度将下降，所以抗体最佳浓度应通过实验 来选择。
• IRMA的测量反应曲线是根据下式来作图：
[AgAb*]2 [AgAb*](Ag Ab* 1)[Ag][ Ab*] 0 k
[AgAb*] B
[Ag] p
[Ab*] q
代入上式
B2 B( p q 1 ) pq 0 k
• 式中，k和q是固定值，B随p增多而增大，二者呈 双曲线关系，随着p的逐渐增大，q渐趋饱和，B
[AgAb*] B [ Ag] p [Ab*] q 代入上式
体外分析技术
体外分析技术体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
第一节放射免疫分析一、原理放射免疫分析法 (radioimmunoassay,RIA) 的基本原理是，限量标记抗原[*Ag]和可变量的非标记待测抗原[Ag]与定量的特异抗体[Ab]发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示：*Ag + Ag + Ab [AgAb]* + [AgAb]上述式中，Ab的分子数少于*Ag，因此即使系统中没有Ag，仅有*Ag，当反应达到平衡时，绝大部分 (因为是可逆反应，不会是100%) Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag，则Ag与*Ag竞争结合Ab，形成AgAb，*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb (B)或*AgAb 占加入总*Ag的% (B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag (F)或游离*Ag占加入总*Ag的% (F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb/*Ag的比值 (R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线 (也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供RIA的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析名词解释
放射免疫分析（RIA）是一种检测技术，可以用来测定多种体内物质，包括激素、细胞因子、蛋白质和抗原。
它可以应用于动物和人体，并且具有灵敏度高、可操作性好的优点，被广泛应用于临床和科研领域。
放射免疫分析由以下几个步骤构成：首先，将样本中待测物质结合到放射抗体中。
放射抗体是一种特异性抗体，能够特异性结合待测物质，避免其他物质干扰检测结果。
放射抗体可以是膜抗原抗体、非膜抗原抗体或者多肽抗体。
其次，将样本和放射抗体制成滴定曲线，测定放射抗体结合待测物质的含量。
最后，通过计算放射抗体浓度滴定曲线的相关系数来计算样本中的待测物质的含量。
放射免疫分析为临床和科研提供了许多方便，特别是在生理学方面，其应用极为广泛。
它可以用来检测各种激素、蛋白质和细胞因子的表达水平，对疾病的研究有重要意义。
放射免疫分析也可以检测各种抗原，为临床诊断疾病提供有力的支持。
放射免疫分析由于具有高灵敏度和特异性，可以很好地检测微量物质，在临床和科研领域具有重要的应用价值。
近年来，放射免疫分析在药物研发和食品质量检测方面也越来越受到重视，为科学研究和技术创新提供重要的技术支持。
综上所述，放射免疫分析是一种重要的检测技术，它不仅在临床检测中具有重要的应用价值，而且也受到越来越多科学研究和技术创新的重视。
它也可以帮助我们更准确、更早期地诊断疾病，为患者身
体健康提供有力的支撑。
放射免疫分析
放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。
放射免疫技术放射免疫分析免疫放射分析放射免疫分析技术的应用放射免疫技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大的推动作用。
基本类型及原理1.放射免疫分析（RIA）2.免疫放射分析（IRMA）常用的放射性核素放射免疫技术常用的放射性核素有125Ⅰ、131Ⅰ、3H、14C等。
使用最广泛的是125Ⅰ，可采用探测γ射线的晶体闪烁计数器测量。
标志物制备及鉴定125Ⅰ以放射性碘原子通过置换被标志物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
（1）氯胺T（ch-T）法。
（2）乳过氧化物酶标记法。
（3）间接标记法。
放射性标志物的纯化（1）凝胶过滤法：分子筛。
（2）离子交换层析法：极性差异。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：电荷和直径。
（4）高效液相色谱法。
放射性标志物的鉴定1.放射化学纯度：大于95%。
2.免疫活性：标志物与抗体结合的能力。
3.比放射性：标志物中所含的放射性强度。
方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（1）可靠性。
（2）剂量-反应曲线。
（3）高剂量钩状效应。
放射免疫分析放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合有限的特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。
Ag*+Ag+Ab Ag*-Ab+Ag-Ab+Ag*+Ag分离结合与游离标志物1.第二抗体沉淀法。
2.聚乙二醇（PEG）沉淀法。
3.PR试剂法：先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。
4.活性炭吸附法。
放射性测量及数据处理可对标记抗原抗体复合物（B）或游离标记抗原（F）进行放射性测量，绘制标准曲线，查出相应的待检抗原浓度。
第七章 放射免疫分析
第七章放射免疫分析第一节放射免疫技术一、基本类型及原理（一）放射免疫分析（RIA）以放射性核素标记抗原与未标记抗原竞争结合特异性抗体，测定样品中抗原量的一种分析法。
（二）免疫放射分析（IRMA）用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。
二、常用的放射性核素125I、131I、3H、14C等，使用最广泛的是125I。
三、放射性标记物制备及鉴定（一）原理：以放射性碘原子置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。
蛋白质、肽类等含有上述基团，可用125Ⅰ直接标记，不含上述基团的甾体激素或药物分子，须连接相应基团才能用于放射性碘标记。
（二）标记及类型1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记。
常用的方法为：①氯胺 T（ch-T）法；②乳过氧化物酶标记法。
2.间接标记法：也称连接标记法，是最常用的间接碘标记方法。
该法主用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。
（三）放射标记物的纯化1.凝胶过滤法：分子筛机制。
2.离子交换层析法：游离125Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）：按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同。
4.高效液相色谱法。
（四）放射标记的鉴定1.放射化学纯度：单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，要求＞95%。
该参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。
2.免疫活性：制备的标记物与抗体结合的能力。
3.比放射活性：单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所结合放射性原子数目。
四、方法学评价除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：（一）可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同。
借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断。
平行性好者可靠。
（二）剂量-反应曲线：通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。
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• Yalow以胰岛素为例，与抗体（两个结合1 位点分别为Aba与Abb）相互作用，其反应 曲线图2.2,
[Ag] [Aba ] ƒ [AgAba ]
[Ag][Abb] ƒ [AgAbb]
将得到
B/F=ka ([Aba ]-B)+kb ([Abb ]-B)
B Ba Bb [AgAba ][AgAbb ]
(B/F)2+B/F-kAbt -B/FkAbt +B/FkAgt =0
(B/F)2+B/F(kAgt -kAbt +1)- kAbt =0
• 标准曲线：标准曲线可由B/F对Agt作图， 即为在放免分析中常用的标准曲线。
• 通过未知样品的B/F值，便可从曲线上读出 对应x轴上抗原浓度。
• 现工作中常用B/B0来表示，然后通过数学 模式来进行数据处理，可直接打印出求知 样品的测值。
• 三.相关技术得到了发展。由于单克窿抗体的出现 和应用，是传统RIA加速向非竞争性IRMA发展， 同时分离剂和自动化检测也有更大的发展。
• 放射免疫分析技术（IRA）：其基本方法是 放射性标记抗原和被测抗原（或标准品） 对有限量的特异性结合剂（抗体）发生可 逆性的竞争反应，最终形成放射性抗原－ 抗体复合物与被测物的含量呈逆相关，因 而是微量或超微量的待测抗原进行定量检 测的一种方法。
[AgAb*] B [ Ag] p [Ab*] q 代入上式
B2 B(1 q 1 ) q 0 p kp p
• 在IRMA的反应体系中标记抗体是过量的， B值即为放射性活度，可直接用cpm数表示， 为纵轴的单位，横轴与RIA一样是标准物的 浓度，两者是正相关，而RIA却是负相关， 这就体现了IRMA标准曲线剂量反应范围比 RIA大，灵敏度也可明显提高。
• 當Ag ，則Ag - Ab * ，故復合物Ag - Ab * 濃度與 • Ag含量成正相關。
Scatchard作图
Scatchard于1949年对化学反应进行数学 推导，以几何图形的方法叙述了化学反应 到达平衡时，游离物与结合物相互间的参 数，称之为Scatchard作图法。
抗原抗体反应是遵循质量作用定律的，因 此其反应式和数学推导，可沿用Scatchard 作图法进行推导。
• 优点：
灵敏度高，特异性强，应用范围广，操作 简便。
• 基本原理：标记抗原和待测抗原（或标准品）对 有限量的特异性抗体发生可逆的竞争结合反应，
最终形成的放射性复合物与被测抗原含量呈负相 关，所以也称为竞争性放射性免疫分析：
Ag* + Ab Ag* - Ab + Ag- Ab
Ag
• 游离物(F)
在这种情况下，B/F对B作图是一条曲线
根据
B
F =k[Abt ] 代入
[Ab]=[Abt]-[AgAb]
[AgAb]=Agt(B/F)/(1+B/F)
B =k[Abt-(AgtB/F/1+B/F)] F
乘以 1+B/F
得到剂量反应方程式
B/F(1+B/F)-(1+B/F)kAbt +B/FkAgt =0
复合物(B)
當Ab 含量為有限定量，則當Ag ， Ag- Ab ，
Ag* - AbΒιβλιοθήκη • 免疫放射分析技术（IRMA）：
• 主要原理是一种标记抗体与有限量的抗原 结合，剩余的未结合的标记抗体再与固相 抗原结合而被分离。
Ag + Ab * Ag - Ab * + Ab *= Ag - Ab * + Ag - Ab * 固相
对IRA法：
[Ag][Ab] ƒ [AgAb]
•
F
B
• 式中，设[Ag]，[Ab], [AgAb]分别是抗原、 抗体、抗原抗体复合物（B），k1为结合常 数，k2为解离常数，K为反应到达平衡时的 亲和常数。[Abt]为抗体总浓度，F为游离物， B为结合物，B/F为两者比率，也称为竞争 结合率。 [Abt]= [Ab]+ [AgAb] [Ab]= [Abt]- [AgAb]
• IRMA中抗原抗体反应，其本质与RIA一样， 也服从质量作用定律，同样可从质量作用 定律推导数学式，不同的是Ab表示标记Ab （即Ab*）。
[Ag][Ab] ƒ [AgAb]
K
[ AgAb*]
( Ag [ AgAb*])( Ab * [ AgAb*])
• 将上式展开
[AgAb*]2 [ AgAb*]( Ag Ab* 1 ) [ Ag][ Ab*] 0 K
K k1 [ AgAb]
B
B
k2 [ Ag][ Ab] F ([ Abt ] [ AgAb]) F ([ Abt ] B)
B / F K ([ Abt ] B)
B / F K[ Abt ] KB
• B/F对B作图，B为自变量，B/F为因变量， 所得斜率为亲和常数K，x轴截距为[Abt]，y 轴截距为K[Abt]，这就是Scatchard图。如 图2.1。
渐近q，而曲线达到坪区，如图2.3。
• IRMA剂量反应曲线，随抗体量的增加，抗 原量也需相应增加，标准线的斜率段也随 之伸延，这就扩大了可测的剂量范围。
• 一般RIA在剂量范围是二个数量级左右， IRMA可达到三个数量级以上。这时临床应 用很有意义。
• 例如TSH在甲亢症时，血中含量<1U/ml， 但TSH-RIA的最小可测值为>1U/ml，而 TSH-IRMA的灵敏度达到0.02U/ml，所以 TSH-IRMA就更适合应用诊断甲亢症。
• IRMA的测量反应曲线是根据下式来作图：
[AgAb*]2 [AgAb*](Ag Ab* 1)[Ag][ Ab*] 0 k
[AgAb*] B
[Ag] p
[Ab*] q
代入上式
B2 B( p q 1 ) pq 0 k
• 式中，k和q是固定值，B随p增多而增大，二者呈 双曲线关系，随着p的逐渐增大，q渐趋饱和，B
• 第七章 放射免疫分析技术和免疫放射分 析技术
• 自从1959年Yalow和Berson创建放免以来，在 方法学，以及相关技术都得到了大的发展：
• 一.随着放射免疫分析的问世，其它的标记免疫分 析方法相继衍生和发展，如竞争蛋白结合分析， 放射受体分析，酶联免疫吸附分析，时间分辨荧 光免疫分析等。
• 二.传统的竞争性放射免疫分析逐步被非竞争性放 射免疫分析所取代。