简述SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理

2005－2006学年第二学期考试试题答案

考试科目：现代分子生物学大实验考试时间：120分钟试卷总分100分

一、名词解释（本大题共5小题，每小题3分，总计15分）

1、探针：能够与靶分子特异结合的核酸分子，带有供杂交后检测的合适标记物。

2、显色反应：在IPTG的诱导下，载体可与宿主菌产生有活性的β-半乳糖苷酶，此酶能使显色底物X-gal分解成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。若有外源片段插入此位点，则使载体的β-半乳糖苷酶基因失活，不能形成有活性的β-半乳糖苷全酶，X-gal 不能被分解，菌落为白色。

3、PCR：聚合酶链式反应，在聚合酶、引物、buffer、模板、dNTPs存在的条件下，经过变性、退火、延伸3步多个循环后，使模板上介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制。

4、质粒：独立于染色体DNA之外的，能稳定遗传的共价闭合双链DNA分子。

5、BLAST：是基本的局部对比排列搜索工具（basic local alignment search tool）的简称。可以从数据库中找出与查询序列的某些子序列相似的子序列。

二、填空题（本大题共5小题，每小题3分，总计15分）

1、染色体DNA、结构的大小差异

2、最快，最慢，中间

3、3.2

4、乳糖，操纵子

5、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度

6、电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应

7、等电聚焦（IEF）

二、简答题（本大题共4小题，每小题10分，总计40分）

1、如有一核苷酸序列A，未知其功能，请用至少一种方法对其进行初步地功能标示。答：通过国际生物信息数据库，如美国国立生物信息中心，对未知序列A进行基本局部序列比对BLAST，找到与其同源性较高的序列，将其功能用来注释未知序列（6分）。步骤如下：登录,点击BLAST网页，在序列对话框内粘贴序列A，点击BLAST按钮，等待其返回同源性结果，选择含有mRNA序列的GenBank文件，将其功能作为未知序列的功能（10分）。

2、简述SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。

答：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上，蛋白质样品可根据其分子大小、形状以及所带电荷多少等因素造成的电泳迁移率的差别而得到分离（4分）。SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入SDS

和还原剂后，强还原剂例如巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，

通过加热使蛋白质解离。解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，在达到饱和的状态下，每克蛋白质约克结合1.4g SDS。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构像的改变。（8分）蛋白质SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与蛋白质相对分子质量的相关。因此，SDS-PAGE 不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率的大小测定蛋白质的分子量。（10分）

3、列举RNA提取的最关键的3个实验步骤，并说明其技术要求及注意事项。

答：1）研磨，液氮速冻，研磨充分，成粉末状（2分）。注意加粉末时速度要快，不要使其融解。（4分）

2）吸上清，要小心（6分）。注意不要搅动中间层，也不要吸到下层的有机层（8分）。

3）干燥，不要过度，室温5-10分钟即可。注意不要让沉淀掉下来。（10分）

4）冰上操作，所有操作及离心均应低温进行，防止Rnase的降解。（10分）

以上只要答出3条即可，其它的关键步骤也可以。

4、如果经PCR反应后未获得目的长度片断或者特异性不强，从那几个方面调整PCR程

序以获得特异性强的目的片断？

答：1）如果PCR未获得目的片段，则应降低退为温度；适当提高模板量；最后如果未获得片段则重新设计引物，以获得特异性强的目的片段（5分）。

2）如果PCR后获得的目的片段特异性不强，则应提高退为温度；适应降低模板量；减少酶的用量；或者重新设计引物以获得特异性强的目的片段（10分）。

三、论述题（本大题共3小题，每小题15分，总计45分）

1、请设计克隆某一目的基因的主要实验过程并说明涉及的关键技术的原理及注意事项。答：1）如果该目的基因为已知基因，且序列已知，则通过数据库查到基因序列，根据已知序列设计引物，PCR获得全长，凝胶回收后，与载体连接、转化、挑单克隆培养提取质粒DNA，测序验证。（5分）

2）如果该目的基因为新材料中的基因，且序列未知，则可通过数据库进行同源基因序列搜索，比对分析，根据同源性高的部分设计引物，PCR获得片段，测序得到部分序列，根据已知的部分序列设计GSP引物，利用RACE分别获得5’及3’端序列，测序拼接成全长序列，再根据1）步的步骤获得该目的基因。（10分）

关键技术：①引物设计，利用碱基互补原理，注意引物Tm值、GC%含量、发夹结构、引物二聚体、错配等。②连接、转化，利用Taq酶反应加A的特性，与T载体可以互补，连接。转化，则是利用α互补显色反应原理，对阳性克隆进行筛选。注意连接时目的片段与载体的摩尔比为5：1-10：1,一般16度过夜连接，转化时注意感受态的制作和热激时间50s左右。③质粒DNA提取则利用碱裂解法原理抽提，注意提取时蛋白要去除充分，RNA要消化干净。④RACE原理，根据mRNA反转录时加入接头，利用GSP引物和接头引物将目的片段扩增出来。注意引物设计要长，Tm值要高。（15分）

2、请按照实验顺序写出Northern杂交的主要实验步骤并说明该步骤的注意事项。

答：1）RNA提取，注意RNA纯度要高，没有DNA污染，且无降解。（2分）