简述SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理
SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定
SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定一、实验目的与原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。
1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。
本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。
二、仪器与试剂1、材料：硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品，Sephadex G-100柱层析的样品。
2、试剂：（1）丙稀酰胺（Acr母液）：30%Acr （Acr/Bis）（2）10%的SDS溶液（3）10%的过硫酸铵溶液（4）四甲基乙二胺（TEMED）（5）分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8（6）浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8（7）电极缓冲液：10×30g Tris，125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3（8）样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，1%SDS，30%甘油，巯基乙醇及溴酚兰（9）染色液：0.15%考马斯亮蓝R250，溶于脱色液（10）脱色液：50%的甲醇，7%的冰醋酸的水溶液（11）标准分子量蛋白。
3、仪器设备：电泳仪、垂直电泳槽等。
三、操作步骤1、凝胶制备：用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。
将配制好的分离胶溶液倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。
sds-page电泳的基本原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术，它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小，从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中，将样品中的蛋白质经过SDS处理后，蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子，并且使蛋白质呈负电荷。
这样，所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度，可以消除蛋白质的本身的电荷特性，使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用，而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后，蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置，从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例，也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来，经过不断的改进和完善，在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来，随着科学技术的不断进步，SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展，并在更广泛的领域得到应用。
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 ．掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 ．熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状，在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量，因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同，二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动，经过一定的时间后得以分离，这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关，为了使其只与蛋白质分子的大小有关，从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量，就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质），使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? ，即 1.8 nm ），而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
说明， SDS 和蛋白质的结合所形成的 SDS- 蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同而对电泳迁移率的影响。
SDS-PAGE测定蛋白质分子质量
3、电泳条件：电压150-180伏（时间50分钟左右） 4、剥胶染色：15分钟 5、脱色：20-30分钟换一次脱色液，换4次，再用 蒸馏水浸泡10-15分钟。 6、凝胶成像进行分析（生化仪器室465室） 复习与思考： 电泳技术的流程，根据本实验分析实验技术的关 键点？
相对迁移率和分子量计算 LogM=a-bRf
相对迁移率(Rf)＝蛋白移动的距离/染料移动的前沿距离
以Rf为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上 绘图,由标准曲线中查出样品分子量。
SDS-PAGE
实验流程（SDS-PAGE)
电泳技术流程： 制备载体（制胶）→加样→电泳→剥胶→染色→ 脱色→测定结果(凝胶成像） 常用载体制备： 丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺→（催化剂） →聚丙 烯酰胺凝胶 SDS的作用：球形蛋白+ SDS →长棒形蛋白 （线状） 样品处理液（巯基乙醇）-S-S- →-HS,SH聚丙烯酰胺凝胶作用：分子筛
二、实验方法
实验方法： 样品处理：100uL样品+100uL处理液混匀(沸水浴加热5分 钟) 1、灌制分离胶 ： 加入试剂如下：两块14％ 的分离胶，需12mL液体（一组） 一份） A液 5.6mL B液 3.0mL 蒸馏水 3.4mL（超纯水） 10％ 过硫酸铵 0.1ml（最后加）（通风柜） TEMED 0.01mL（通风柜） 混合后，用小滴管加入制胶室中，加入高度距短玻板 1.5cm左右，缓慢加入蒸馏水压平，聚合约30分钟。
实验设计思路
SDS-PAGE实验设计： 1、浓缩胶（堆积胶）浓缩效应5% 由三个不连续组成： 凝胶浓度不连续 凝胶缓冲液pH不连续（pH6.8;pH8.8) 凝胶缓冲液负离子不连续：氯离子，甘氨酸 根负离子 2、分离胶（14%）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：
1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加
第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪； （4）电子天平； （6）瓷盘、微量进样器； （3）高速冷冻离心机； （5）电冰箱；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。
其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。
具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。
2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。
3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。
4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。
5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。
需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法——蛋白质的分子量测定
【实验目的】1.掌握SDS-聚丙烯酰胺电泳法的原理。
2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。
【实验原理】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl 或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。
2.实验试剂⑴2mol/L Tris-HCl （pH8.8）：取24.2g Tris，加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
⑵1mol/L Tris-HCl （pH8.8）：取12.1g Tris，加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
实验十 SDS-PAGE测定蛋白质分子量一、实验目的1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二、实验原理1.带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。
其中区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳早期使用不同的支持介质有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
2.PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMr=K-bX，式中：Mr为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
四. 实验过程
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒
定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板
做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱 色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.
•
二. 实验原理
• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统
和不连续系统两大类，连续系统电泳体系 中缓冲液pH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒 在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH ， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
三.
实验试剂和器材
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融 化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。
1.材料： 低分子量标准蛋白试剂盒:
2.实验试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml。
简述SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理
2005－2006学年第二学期考试试题答案考试科目：现代分子生物学大实验考试时间：120分钟试卷总分100分一、名词解释（本大题共5小题，每小题3分，总计15分）1、探针：能够与靶分子特异结合的核酸分子，带有供杂交后检测的合适标记物。
2、显色反应：在IPTG的诱导下，载体可与宿主菌产生有活性的β-半乳糖苷酶，此酶能使显色底物X-gal分解成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。
若有外源片段插入此位点，则使载体的β-半乳糖苷酶基因失活，不能形成有活性的β-半乳糖苷全酶，X-gal 不能被分解，菌落为白色。
3、PCR：聚合酶链式反应，在聚合酶、引物、buffer、模板、dNTPs存在的条件下，经过变性、退火、延伸3步多个循环后，使模板上介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制。
4、质粒：独立于染色体DNA之外的，能稳定遗传的共价闭合双链DNA分子。
5、BLAST：是基本的局部对比排列搜索工具（basic local alignment search tool）的简称。
可以从数据库中找出与查询序列的某些子序列相似的子序列。
二、填空题（本大题共5小题，每小题3分，总计15分）1、染色体DNA、结构的大小差异2、最快，最慢，中间3、3.24、乳糖，操纵子5、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度6、电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应7、等电聚焦（IEF）二、简答题（本大题共4小题，每小题10分，总计40分）1、如有一核苷酸序列A，未知其功能，请用至少一种方法对其进行初步地功能标示。
答：通过国际生物信息数据库，如美国国立生物信息中心，对未知序列A进行基本局部序列比对BLAST，找到与其同源性较高的序列，将其功能用来注释未知序列（6分）。
步骤如下：登录,点击BLAST网页，在序列对话框内粘贴序列A，点击BLAST按钮，等待其返回同源性结果，选择含有mRNA序列的GenBank文件，将其功能作为未知序列的功能（10分）。
生化实验七 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、 实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量 二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。
若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。
1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。
加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。
同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。
其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。
不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。
这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。
需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。
因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。
蛋白 SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定
蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定一、原理：（1）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS-PAGE。
用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）测定。
SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。
SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX（6）1ml注射器及6号长针头；（7）微量注射器（10μl或50μl）?????试剂：标准蛋白质：不连续体系SDS-PAGE有关试剂（1）10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。
SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。
（2）1%TEMED（V/V）：取1mlTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
（3）10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。
最好临用前配制。
（4）样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LpH8.0?Tris-HCl缓冲液。
①先配制0.05mol/LpH8.0?Tris-HCl缓冲液：称Tris?0.6g，加入50ml重蒸水，再加入约3ml?1mol/LHCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。
生化实验3-蛋白质SDS-PAGE胶电泳分子量分析
生化實驗3－蛋白質SDS-PAGE膠電泳分子量分析1.原理：SDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate－polyacrylamide gelelectrophoresis）為變性（denature）的蛋白質電泳，可依分子量分離出不同大小的蛋白質成分，其後以CBR染色或銀染判讀結果。
2.藥劑：Acrylamide + bis-acrylamide ( 37.5 : 1 )、APS (ammoniumpersulfate)、TEMED、Running buffer及Sample buffer。
3.儀器：SDS-PAGE電泳槽套組、電源供應器。
4.實驗方法：a.下層製膠（Running gel）－組合置膠器後，於下層膠體溶液中迅速加入APS及TEMED混合均勻，注入玻璃板間空隙達孔梳下1 cm左右，再注入少量去離子水隔離空氣，靜置凝膠約30 min。
b.上層製膠（Stacking gel）－將下層膠上方的水分倒掉，同樣於上層膠體溶液中迅速加入APS及TEMED混合均勻，注入玻璃板間至上緣，並插入孔梳，靜製凝膠約30 min。
c.樣品前處理－取樣品與sample buffer等量混合，水浴100℃三分鐘後快速離心取上層液。
d.電泳操作－架設電泳裝置套組，將running buffer倒入電泳槽中，取下孔梳，分別將處理好的樣品各20μl注入well內。
蓋上電泳槽，連接電極線於電源供應器，調整電壓至80 V開始跑電泳約30 min，至上下膠體間集膠，後電壓調至120 V，由追蹤染劑觀察蛋白質泳動情形，接近膠體底部時停止電泳。
e.膠片暫存：小心取出玻璃板及膠片（夾著），以buffer潤濕紙巾後包覆，放入夾鍊袋中冷藏於4℃。
課程指導：林文風（5103）實驗協助：陳運源（5103）、楊喬筑（5123）。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
项目三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量一实训目的1掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作步骤2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。
再与标准样品对照即可确定各区带的成分。
要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。
SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X104～16.5X104之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。
LogMW＝K－bm(LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量.三、实训器材配制方法1、浓缩胶缓冲液：1.5克Tris、12.0毫升1mol HCl，加水混匀定容至25毫升。
2、分离胶缓冲液：18.15克Tris、48.0毫升1 mol HCl，加水混匀定容至100毫升。
3、电极缓冲液：3克Tris，14.4克甘氨酸、1克SDS，加水混匀定容至1000毫升。
4、1％过硫酸铵：1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中，临用前配制。
5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I＝0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B液)1：7(v/v)稀释。
6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M，2％SDS，10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；0.8克SDS，4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升，再1滴0.1％溴酚兰。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理及步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目的要求（1）学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
（2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。
原理SDS-PAGE是PAGE是一种特殊形式，SDS是带负电荷的阴离子去污剂。
用SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。
在样品溶解液中含有巯基乙醇及SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复合物。
因此各种蛋白质分子在SDS-PAGE中，只能按其分子量大小而分离。
SDS-PAGE有连续体系（b）及不连续体系两种(d)，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
Acr 和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。
但在具有自由基团体系时，它们聚合。
引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。
在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。
TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。
这些因素在实际操作时都应予以控制。
光聚合以光敏感物核黄素（即V B2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。
sds凝胶电泳原理
sds凝胶电泳原理
SDS凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
其基本
原理是利用表面活性剂SDS（十二烷基硫酸钠）将蛋白质分
子进行线性化，并给予负电荷，使其蛋白质的迁移速率仅与其相对分子质量成正比。
通过电场作用下，蛋白质在凝胶中移动，从而实现对蛋白质分子的分离。
具体操作步骤如下：
1. 准备凝胶：常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯醛凝胶。
凝胶制备时需加入电泳缓冲液，以提供离子导电。
2. 准备样品：将待分析的蛋白质样品加入SDS-PAGE凝胶样
品缓冲液，并进行蛋白质样品的热变性处理，使蛋白质线性化并降解二级结构。
3. 加载样品：将处理后的蛋白质样品加入凝胶孔穴中。
4. 进行电泳：在电泳槽中加入适量的电泳缓冲液，将凝胶放入电泳槽，并施加正向电场。
电场作用下，蛋白质样品会向阳极迁移。
5. 可选-分子量标记：可以在凝胶中加入分子量标记蛋白质，
用于对照和分子量测定。
6. 凝胶染色：电泳结束后，可使用蛋白质染色剂如Coomassie
蓝染色，观察和分析分离的蛋白质带。
通过SDS凝胶电泳，可以实现对复杂蛋白质混合物的分离和
初步定性分析。
此方法广泛应用于生物医学、生物化学等领域的蛋白质研究中。
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。
SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。
2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。
通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。
3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。
较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。
4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。
通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。
总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。
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2005－2006学年第二学期考试试题答案
考试科目：现代分子生物学大实验考试时间：120分钟试卷总分100分
一、名词解释（本大题共5小题，每小题3分，总计15分）
1、探针：能够与靶分子特异结合的核酸分子，带有供杂交后检测的合适标记物。
2、显色反应：在IPTG的诱导下，载体可与宿主菌产生有活性的β-半乳糖苷酶，此酶能使显色底物X-gal分解成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。
若有外源片段插入此位点，则使载体的β-半乳糖苷酶基因失活，不能形成有活性的β-半乳糖苷全酶，X-gal 不能被分解，菌落为白色。
3、PCR：聚合酶链式反应，在聚合酶、引物、buffer、模板、dNTPs存在的条件下，经过变性、退火、延伸3步多个循环后，使模板上介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制。
4、质粒：独立于染色体DNA之外的，能稳定遗传的共价闭合双链DNA分子。
5、BLAST：是基本的局部对比排列搜索工具（basic local alignment search tool）的简称。
可以从数据库中找出与查询序列的某些子序列相似的子序列。
二、填空题（本大题共5小题，每小题3分，总计15分）
1、染色体DNA、结构的大小差异
2、最快，最慢，中间
3、3.2
4、乳糖，操纵子
5、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度
6、电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应
7、等电聚焦（IEF）
二、简答题（本大题共4小题，每小题10分，总计40分）
1、如有一核苷酸序列A，未知其功能，请用至少一种方法对其进行初步地功能标示。
答：通过国际生物信息数据库，如美国国立生物信息中心，对未知序列A进行基本局部序列比对BLAST，找到与其同源性较高的序列，将其功能用来注释未知序列（6分）。
步骤如下：登录,点击BLAST网页，在序列对话框内粘贴序列A，点击BLAST按钮，等待其返回同源性结果，选择含有mRNA序列的GenBank文件，将其功能作为未知序列的功能（10分）。
2、简述SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。
答：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持介质的电泳方法。
在这种支持介质上，蛋白质样品可根据其分子大小、形状以及所带电荷多少等因素造成的电泳迁移率的差别而得到分离（4分）。
SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
在样品和凝胶中加入SDS
和还原剂后，强还原剂例如巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，
通过加热使蛋白质解离。
解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，在达到饱和的状态下，每克蛋白质约克结合1.4g SDS。
由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构像的改变。
（8分）蛋白质SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于长椭圆棒。
不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比的变化。
这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与蛋白质相对分子质量的相关。
因此，SDS-PAGE 不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率的大小测定蛋白质的分子量。
（10分）
3、列举RNA提取的最关键的3个实验步骤，并说明其技术要求及注意事项。
答：1）研磨，液氮速冻，研磨充分，成粉末状（2分）。
注意加粉末时速度要快，不要使其融解。
（4分）
2）吸上清，要小心（6分）。
注意不要搅动中间层，也不要吸到下层的有机层（8分）。
3）干燥，不要过度，室温5-10分钟即可。
注意不要让沉淀掉下来。
（10分）
4）冰上操作，所有操作及离心均应低温进行，防止Rnase的降解。
（10分）
以上只要答出3条即可，其它的关键步骤也可以。
4、如果经PCR反应后未获得目的长度片断或者特异性不强，从那几个方面调整PCR程
序以获得特异性强的目的片断？
答：1）如果PCR未获得目的片段，则应降低退为温度；适当提高模板量；最后如果未获得片段则重新设计引物，以获得特异性强的目的片段（5分）。
2）如果PCR后获得的目的片段特异性不强，则应提高退为温度；适应降低模板量；减少酶的用量；或者重新设计引物以获得特异性强的目的片段（10分）。
三、论述题（本大题共3小题，每小题15分，总计45分）
1、请设计克隆某一目的基因的主要实验过程并说明涉及的关键技术的原理及注意事项。
答：1）如果该目的基因为已知基因，且序列已知，则通过数据库查到基因序列，根据已知序列设计引物，PCR获得全长，凝胶回收后，与载体连接、转化、挑单克隆培养提取质粒DNA，测序验证。
（5分）
2）如果该目的基因为新材料中的基因，且序列未知，则可通过数据库进行同源基因序列搜索，比对分析，根据同源性高的部分设计引物，PCR获得片段，测序得到部分序列，根据已知的部分序列设计GSP引物，利用RACE分别获得5’及3’端序列，测序拼接成全长序列，再根据1）步的步骤获得该目的基因。
（10分）
关键技术：①引物设计，利用碱基互补原理，注意引物Tm值、GC%含量、发夹结构、引物二聚体、错配等。
②连接、转化，利用Taq酶反应加A的特性，与T载体可以互补，连接。
转化，则是利用α互补显色反应原理，对阳性克隆进行筛选。
注意连接时目的片段与载体的摩尔比为5：1-10：1,一般16度过夜连接，转化时注意感受态的制作和热激时间50s左右。
③质粒DNA提取则利用碱裂解法原理抽提，注意提取时蛋白要去除充分，RNA要消化干净。
④RACE原理，根据mRNA反转录时加入接头，利用GSP引物和接头引物将目的片段扩增出来。
注意引物设计要长，Tm值要高。
（15分）
2、请按照实验顺序写出Northern杂交的主要实验步骤并说明该步骤的注意事项。
答：1）RNA提取，注意RNA纯度要高，没有DNA污染，且无降解。
（2分）
东北林业大学
2005－2006学年第二学期考试试题答案2）浓度测定，注意分光光度计测定时要充分混匀。
3）凝胶电泳，上样量要一致，电压采用稳压电源，较低电压，长时间5小时左右。
（4分）
4）转膜，胶倒扣于滤纸上，膜和3MM滤纸比胶要稍小，放膜时要一次放好，胶周围用封口膜封好，让高盐缓冲液只能从胶中间透过。
（6分）
5）干燥、固定，膜放在50度烘干30分钟，然后短波紫外固定30秒。
（8分）
6）预杂交，用100度变性的鲑精DNA，50度预杂交1小时。
（10分）
7）杂交，注意杂交液中加入100度变性的探针，50度过夜杂交。
（12分）
8）洗膜，注意洗膜时要换器皿，用到tween 20的地方，要清洗掉后再进行下一步。
（14分）
9）显影，加入显色溶液CDP-STAR时要保持黑暗。
（15分）
3、试论述从原核表达质粒的构建到蛋白质诱导表达需要考虑的因素。
答：主要有以下方面：
1）用PCR扩增的方法进行目的基因分离，在合成PCR引物时，要在PCR产物的两端设计一定的限制性的酶切位点。
经酶切后克隆至用相同酶切的表达载体中。
但根据实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
（3分）
2）将外源基因插入到表达载体的多克隆位点上时，要一定在开放阅读框内防止移码。
（6分）
3）宿主菌：
克隆的宿主菌：DH5a、JM109。
特点：转化效率高，质粒产量高
表达的宿主菌：BL21(DE3)、DH5a等（9分）
4）培养条件：IPTG的浓度、生长温度、诱导的时间等。
IPTG浓度在0.01-5mmol/L范围，生长温度: 15-42℃。
（12分）
5）在其它方面如表达质粒的构建流程及诱导的原理等给予适当的分数。
对整个原核表达质粒的构建和蛋白质诱导表达的理解及整体的语言组织能力给予适当的分数。
（15分）。