吸附法思考!直接使用酶固定化酶与固定化细胞各有什么优缺点
酵母细胞的固定化(定)
作用： 将葡萄糖转化为果糖
如何改进？
特点： 酶稳定性好，可持续发挥作用
直接使用酶时的缺点： 酶溶于葡萄糖溶液后，就无法 从糖浆中回收，造成很大①反应柱能连续使用半 年，大大降低了生产成 本。
②提高了果糖的产量和 品质。
三、实验操作 （一）制备固定化酵母细胞 （二）用固定化酵母细胞发酵
（一）制备固定化酵母细胞 1、酵母细胞的活化：
1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放 置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？
在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化是指让 处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过 程。 操作提示
五、结果分析与评价
（一）观察凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色： 说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少； 如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：
说明海藻酸钠的浓度偏高。 二者都说明制作失败，需要再作尝试。
（二）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产 生了很多气泡，同时会闻到酒味
〖思考〗 1、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？ 酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。
〖思考〗 2、锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？ 酵母菌进行无氧呼吸产生的
本请 并
节 结
完 成 习
做 好 复
束题 习
！
谢谢！
〖思考〗为什么要将海藻酸钠冷却至室温？
以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌
操作提示 海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分， 使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
（5）固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加CaCl2 溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡 30min左右。
酶和细胞的固定化
交联法
交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶 分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化 方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添 加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定 化酶。
交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定 酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较 难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法 的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己 二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用 最广泛的是戊二醛。
共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定 化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载 体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先 用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某 些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价 键。
共价结合法的优缺点
共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢 固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前 研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较 其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更 加严重。
缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、 离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落， 并且污染催化反应产物。
离子结合法
离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载 体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换 树脂，如DEAE-纤维素 、AmberliteCG-50 、 XE-97和Dowex-50等。
物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物 理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸 附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电 作用等。
物理吸附法的优缺点
优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很 大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯 化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不 变，因此对酶的催化活性影响小。
如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化 酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于 条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。
固定化酶和固定化细胞
用寿命长，有时可以连续使用3个星期
吸附方法：
1.静态吸附，自然吸附、解吸、再吸附的固定化方法。 效率低，时间比较长，而且不完全。
2.电沉积，在载体附近加电极，酶移向载体表面的固 定化方法。需要酶在电场中不破坏，保持原来酶性 能。。
➢ 特点：操作简便、条件温和、不会引起酶变性失活， 载体廉价易得，可反复使用，但结合力较弱，酶与 载体结合不牢固易脱落。
物理吸附(氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载体上) 无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）
吸附量小、有些酶发生吸附变性 有机吸附剂（纤维素、胶原等）
吸附量略大(～50mg/g载体),不产生变性失活，比较 受重视。
吸附力弱，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓 度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。
可以改善的方法： 1.选择最佳条件操作（如温度、pH） 2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量
如烃基-琼脂糖衍生物吸附在酸性pH的酶(脲 酶)用亲和吸附剂 ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白
对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶+丙 烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联
避免影响酶的活性构型和相应基团
酶的偶联量: 单位载体上偶联酶的总量与“相对酶活力”之间的
平衡。
相对酶活力： 指固定化酶和蛋白量与相等的原酶的活力比。
由于固定化时，受到载体、方法、条件、酶反应系 统的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。
1.只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高。 2.超过一定的偶联量，酶过多集中于载体的局部， 造成空间位阻效应，部分酶无法表现活性。随酶偶联量上 升酶活性反而下降。
寻找二者平衡点关系，才能使固定化酶活性达到最高。
固定化酶与固定化细胞
世界上第一种工业化生产的固定化
酶 乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸
乙酰 -D — Ala
.
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
.
2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模
最大, 应用最为成功 的一种固定化酶。
.
固定化方法
吸附法
包埋法 共价结 交联法
物理吸附法 离子吸附法
合法
制备难易 易
易
较难 难
较难
结合程度 活力回收
弱
中等
高，酶易流失 高
强
强
强
高
低
中等
再生
可能
可能
不能 不能 不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
不变
.
不变 可变 可变
三 细胞的固定化方法
• 1.固定化细胞的分类 • 2.固定化方法
.
1.固定化细胞的分类
.
3.固定化原生质体
意义:
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩
散障碍，有利于氧的传递，营养成分
的吸收和胞内产物的分泌。
(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定
化后，由于载体的保护作用，稳定性
提高。
.
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 (二) 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法 .
直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的区别
缺点 中的酶很难回收，不能被 实践中，很多产物的 尤其是大分子物质，
再次利用，提高了生产成 本；③反应后酶会混在产 物中，可能影响产品质量
形成都是通过一系列 可能导致反应效率 的酶促反应才能得到 下降等
各种物质（大分子、 小分子）
优点
催化效率高、低
Hale Waihona Puke ①酶既能与反应物接触，又 能与产物分离;②固定在载体
耗能、低污染等 上的酶还可以被反复利用
一系列
小分子
成本低，操作 更容易
①对强酸、强碱、高温和 一种酶只能催化一种 固定后的细胞与反
有机溶剂等环境条件非常 敏感，容易失活；②溶液
化学反应，而在生产 应物不容易接近，
直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的区别
直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
酶的种类 常用载体 制作方法
一种或几种
一种
高岭土、皂土、硅 胶凝胶
化学结合法、物理吸附法
一系列酶
明胶、琼脂糖、海藻 酸钠、醋酸纤维素和 聚丙烯酰胺
包埋法
是否需要 营养物质
否
否
是
催化反应
单一或多种
单一
反应底物
各种物质（大分子、 小分子）
简述固定化酶的优点和不足
固定化酶的优点：
1.稳定性增强：固定化酶可以降低酶的降解，提高酶的稳定性，使
酶能够更长时间地保持活性。
2.反复使用：固定化酶可以在反应后分离出来，进行重复使用，从
而降低了生产成本。
3.方便操作：固定化酶可以方便地进行分离和纯化，减少了后续处
理的复杂性。
4.可控性高：通过控制固定化酶的条件，可以更好地控制反应条件，
提高反应的效率和产物的纯度。
5.适用范围广：固定化酶可以适用于不同类型的酶和不同的反应系
统，扩大了酶的应用范围。
固定化酶的不足之处：
6.酶活性的损失：在固定化过程中，酶的活性可能会受到一定的损
失。
7.物质传递限制：由于固定化载体和酶之间的传递阻力，可能会影
响反应速率。
8.载体材料的稳定性：一些载体材料在反应条件下可能会发生分解
或破坏，影响酶的稳定性和固定化效果。
9.成本较高：与游离酶相比，固定化酶的生产成本通常较高。
固定化酶与固定化细胞
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术方法，广泛应用于食品工业、医药工业、环境保护等领域。
通过这种技术，酶或细胞被固定在一种固体材料上，从而增强了它们的稳定性和重复使用性，提高了生产效率和产品质量。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、优势以及在不同领域的应用情况。
酶及细胞固定化技术的原理主要是通过将酶或细胞固定在一种固定载体上，使其能够稳定地存在于一定的环境中并保持其生物活性。
固定载体一般是多孔性的固体材料，如珠状树脂、活性炭、聚合物材料等。
在固定化过程中，酶或细胞通常会与载体表面发生物理或化学结合，从而实现固定化。
固定化后的酶或细胞能够在一定条件下发挥作用，实现对底物的转化或反应。
二、酶及细胞固定化技术的优势相较于游离态的酶或细胞，在固定化状态下具有以下优势：1.稳定性高：固定化后的酶或细胞能够更好地耐受环境变化，如温度、pH值等变化，从而提高其稳定性和长期使用的能力。
2.重复使用性强：固定化后的酶或细胞能够被多次使用，降低了成本，提高了生产效率。
3.易于分离：固定化后的酶或细胞与反应物之间的分离更加便利，便于后续操作和产品纯化。
4.改善环境适应性：固定化后的酶或细胞对不同环境条件的适应能力更强，可在复杂环境中发挥作用，适用范围更广。
5.抑制酶或细胞的不良反应：在固定化状态下，酶或细胞的不良反应如自身降解被抑制，更加稳定可靠。
酶及细胞固定化技术在食品工业中得到了广泛应用。
一些发酵产品的生产过程中，固定化酶或细胞能够提高发酵效率、缩短发酵周期，并且保证产品的稳定性和质量。
在乳制品工业中，利用固定化乳酸菌进行发酵能够保持产品的风味和质量，并且加速乳酸发酵的速度，提高了生产效率。
固定化酶还可以应用于酶解工艺，如利用固定化酶对淀粉、蛋白质等进行水解，得到高质量的发酵原料。
固定化技术还可以用于改善食品加工过程中的废水处理，通过固定化细胞去除废水中的有机物和重金属离子，净化废水，达到环保的目的。
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
课题3 酵母细胞的固定化
2．配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液 配制物质的量浓度为0.05mol/L的 0.05mol/L
思考： 、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液有什 思考：2、配制物质的量浓度为 的 么作用？ 么作用？
3．配制海藻酸钠溶液 ． 思考： 配制的海藻酸钠溶液具体作用是什么？ 思考：①配制的海藻酸钠溶液具体作用是什么？ 包埋酶或细胞 ②在加热的过程中，为什么要用小火，或者间断加热？ 在加热的过程中，为什么要用小火，或者间断加热？ 防止焦糊 4．海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 ． 5．固定化酵母细胞 ． 思考： 为什么刚形成的凝胶珠要在 思考：①为什么刚形成的凝胶珠要在CaCl2溶液中 溶液中 浸泡30min左右？ 左右？ 浸泡 左右 形成稳定的凝胶珠 ②如何检验凝胶珠的质量是否合格？ 如何检验凝胶珠的质量是否合格？
四．实验操作结果分析与评价
1．观察凝胶珠的颜色和形状问题思考： ．观察凝胶珠的颜色和形状问题思考： 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，则说明什么？ ①如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，则说明什么？ 如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明什么？ ②如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明什么？ 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色， 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠 的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少； 的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的 凝胶珠不是圆形或椭圆形， 凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏 高，制作失败，需要再作尝试。 制作失败，需要再作尝试。 2．观察发酵的葡萄糖溶液 ． 问题思考：当观察到哪些现象时，可说明实验获得成功？ 问题思考：当观察到哪些现象时，可说明实验获得成功？ 为什么？ 为什么？ 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精， 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了 很多气泡，同时会闻到酒味。 很多气泡，同时会闻到酒味。
酶的固定化方法及优缺点
酶的固定化方法及优缺点酶是一种能够促进化学反应的生物催化剂，具有高效、特异性和温和等优点，因此在许多工业生产和科学研究中得到广泛应用。
然而，酶的活性易受环境条件影响，如温度、pH值、离子强度等，因此需要进行固定化处理以提高其稳定性和重复使用性。
酶的固定化方法主要包括物理吸附、共价结合、交联固定等。
其中，物理吸附是将酶溶液直接吸附在载体表面上，通常采用多孔材料或纤维素等作为载体；共价结合是通过化学反应将酶与载体共价键结合，常用的交联剂有戊二醛、硫酸氢钠等；交联固定则是利用交联剂将酶与载体交联形成一种网状结构。
物理吸附法是一种简单易行的方法，不需要进行复杂的化学反应步骤，且操作方便。
但其缺点是稳定性较差，在长时间使用过程中容易脱落或失活。
共价结合法可以使酶与载体之间形成更牢固的化学键，因此稳定性较好，但其缺点是反应条件较为苛刻，易导致酶失活或降低活性。
交联固定法是一种中庸之道，既能保持酶的高活性，又能提高稳定性和重复使用性。
但其缺点是需要进行复杂的交联反应步骤，操作相对较为繁琐。
除了上述方法外，还有一些新型的固定化方法正在不断发展和探索中。
例如，在纳米技术领域中，利用纳米粒子作为载体可以提高酶的稳定性和催化效率；在材料科学领域中，利用多孔材料或金属有机框架等作为载体也具有很好的固定化效果。
总之，选择合适的固定化方法需要根据具体情况进行综合考虑。
在实际应用中，需要根据酶的特性、工艺要求、经济成本等因素进行权衡和取舍。
未来随着科技不断进步和创新发展，相信会有更加优异的固定化方法出现，并为酶在工业生产和科学研究中带来更广泛的应用前景。
酶的固定化方法及优缺点
酶的固定化方法及优缺点以酶的固定化方法及优缺点为标题，本文将详细介绍酶的固定化方法以及各种方法的优缺点。
一、酶的固定化方法1. 物理吸附法：将酶直接吸附在固体载体表面，如活性炭、硅胶等。
这种方法简单易行，不需要化学反应，但酶容易失活和流失。
2. 共价键结合法：通过化学手段将酶共价键结合在载体表面，常用的方法包括交联、酯化、酰胺化等。
这种方法能够稳定地固定酶，但可能会影响酶的活性和稳定性。
3. 包埋法：将酶包裹在多孔载体中，如凝胶、微胶囊等。
这种方法能够保护酶免受外界环境的影响，但可能会降低酶的反应速率。
4. 共聚物法：利用聚合物将酶固定在载体上，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇等。
这种方法可以提高酶的稳定性和反应速率，但可能会影响酶的活性。
二、各种固定化方法的优缺点1. 物理吸附法的优点是操作简单、成本低廉，但缺点是酶容易失活和流失，固定效果不稳定。
2. 共价键结合法的优点是能够稳定地固定酶，固定效果较好，但缺点是可能会影响酶的活性和稳定性。
3. 包埋法的优点是能够保护酶免受外界环境的影响，固定效果较稳定，但缺点是可能会降低酶的反应速率。
4. 共聚物法的优点是可以提高酶的稳定性和反应速率，固定效果较好，但缺点是可能会影响酶的活性。
在实际应用中，选择适合的固定化方法需要考虑多个因素，如酶的特性、反应条件、载体的稳定性和成本等。
不同的固定化方法适用于不同的酶和反应条件。
例如，对于温度敏感的酶，可以选择物理吸附法或包埋法；对于活性较强的酶，可以选择共价键结合法或共聚物法。
总结起来，酶的固定化方法有物理吸附法、共价键结合法、包埋法和共聚物法等。
每种方法都有其优缺点，选择适合的固定化方法需要综合考虑多个因素。
通过固定化方法，可以提高酶的稳定性、反应速率和重复使用性，从而在酶工业和生物催化领域具有广泛的应用前景。
高中生物 技术实践知识点总结 课题4 酵母细胞的固化
德钝市安静阳光实验学校盐城中学高中生物技术实践知识点总结课题4 酵母细胞的固定化苏教版选修12．固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。
一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。
这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
固定化酶优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。
固定化细胞优点：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化学反应。
实验步骤1。
细胞的活化称取lg 干酵母，放入50 mL的小烧杯中，加人蒸馏水10 mL，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右，使其活化。
【注】活化：让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态2。
配制物质的量浓度为0.05mo1/L的CaCl2溶液称取无水CaCl2 0.83g。
放人200mL 的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。
3。
配制海藻酸钠溶液称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中。
加人10mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10 mL。
注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。
4。
海藻酸钠溶液与酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加人已活化的醉母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。
【注】冷却至室温的目的：防止杀死酵母菌5。
固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。
将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右。
【注】CaCl2溶液的作用：使胶体聚沉6 使用固定化酵母细胞发酵a)将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。
b) 将150mL 质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发酵24h。
固定化酶的四种方法
1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。
通常有物理吸附法和离子吸附法。
常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。
因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。
通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。
物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。
从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。
该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。
离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。
该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。
采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。
2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。
常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
3载体结合法最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。
在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。
参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。
吸附法思考!直接使用酶固定化酶与固定化细胞各有什么优缺点
一种酶只能催化一种 化学反应，而在生产 实践中，很多产物的 形成都通过一系列的 酶促反应才能得到的。
固定后的酶或细胞与
成本低，操作更容易。
反应物不容易接近， 可能导致反应效果下
降等。
三、实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
1、酵母细胞的活化
思考： 关于酵母菌你知道哪些知识？ 什么是活化？ 怎样活化？ 应注意什么？
B、固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小
C、固定化细胞固定的是一种酶
D、将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细
胞技术
（二）固定化细胞技术
将酶或细胞固定化的方法
将酶（或细胞）包
包埋法
埋在细微网格里
将酶（或细胞）
化学结合法
相互连接起来 将酶（或细胞）吸
吸附法
附在载体表面上
课堂讨论：
1．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化 细胞技术哪一种方法更容易？
固定化细胞技术 2. 哪一种方法对酶活性的影响更小？
固定化细胞技术 3．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？
（一） 固定化酶的应用实例
阅读P49，并思考： 1、解决酶应用中存在问题的方法是？ 2、这种方法的优点是什么？ 3、什么是高果糖浆？使用它有何好处？ 4、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是
什么？这种酶有何特点？ 5、了解高果糖浆生产过程。
在生产实际中使用固定化酶技术 有无不足?如有不足,怎么办?
有 一种酶只能催化一种化学反应， 而在生产实际中很多产物的形成 都通过一系列的酶促反应才能进 行，所以操作比较麻烦。 可采用固定化细胞技术。
（二）固定化酵母细胞的发酵
冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲 洗2～3次。
文档：固定化酶的优缺点及应用
固定化酶的优缺点及应用1.固定化酶的优缺点固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：①极易将固定化酶与底物、产物分开；②可以再较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；③在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；④酶反应过程能够加以严格控制⑤产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；⑥较游离酶更适合于多酶反应；⑦可以增加产物的收率；⑧酶的使用效率提高，成本降低。
与此同时，固定化酶也存在一些缺点：①固定化时，酶活力有损失；②增加了生产的成本，工厂初始投资大；③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；④与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；⑤胞内酶必须经过酶的分离程序。
迄今为止已发现的酶有效千种之多，但由于应用的性质与范围、保存稳定性和操作稳定性、成本的不同以及制备的物理、化学手段、材料等不同，可以采用不同的方法进行酶的固定化。
一般要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的固定化方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原则：①必须注意维持酶的催化活性及专一性，保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点。
②固定化反应有利于生产自动化、连续化，为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。
③固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍与底物的接近，应不会引起酶的失活，以提高产品的产量。
制备固定化酶时所选载体应尽可能地不阻碍酶和底物的接近。
④酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用，因此，在制备固定化酶时，应使酶和载体尽可能的结合牢固。
⑤固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。
⑥固定化酶应易于产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用。
⑦固定化酶成本要低，需综合考虑固定化酶在总成本中的比例，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用。
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练习:
1、制备固定化酵母细胞的过程中错误的是（
）
A、取干酵母，加入蒸馏水，使其活化
B、配制海藻酸钠时，加热用大火，直到海藻酸钠溶化为止
C、将溶化好的Βιβλιοθήκη 藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵
母细胞
D、将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右
2、下列叙述不正确的是（
）
A、从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶容易
B、固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小
C、固定化细胞固定的是一种酶
D、将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细
胞技术
一种酶只能催化一种 化学反应，而在生产 实践中，很多产物的 形成都通过一系列的 酶促反应才能得到的。
固定后的酶或细胞与
成本低，操作更容易。
反应物不容易接近， 可能导致反应效果下
降等。
三、实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
1、酵母细胞的活化
思考： 关于酵母菌你知道哪些知识？ 什么是活化？ 怎样活化？ 应注意什么？
固定化细胞固定的是一系列酶 4．如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应 该选择哪种方法？ 固定化细胞技术
5．如果反应底物是大分子物质，又应该采用哪种方法？ 固定化酶技术
1、 对固定酶的作用影响较小的固定方法 是什么？
吸附法。
2、 将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵 过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、 细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固 定（酶、细胞）。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L 的CaCl2溶液
3、配制海藻酸钠溶液
应当注意什么问题？ 1、加热时要用小火，或者间断加热 2、海藻酸钠的浓度 浓度过高——将很难形成凝胶珠； 浓度过低——形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，
影响实验效果。
4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
为什么海藻酸钠溶液要冷却至室温？
（二）固定化细胞技术
将酶或细胞固定化的方法
将酶（或细胞）包
包埋法
埋在细微网格里
将酶（或细胞）
化学结合法
相互连接起来 将酶（或细胞）吸
吸附法
附在载体表面上
课堂讨论：
1．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化 细胞技术哪一种方法更容易？
固定化细胞技术 2. 哪一种方法对酶活性的影响更小？
固定化细胞技术 3．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？
直接使用酶、固定化酶与固定化细胞各有什么优缺点？
类型 直接使用酶
优点
不足
对环境条件非常敏感，
容易失活；溶液中的
催化效率高，低耗能、 低污染等。
酶很难回收，不能被 再次利用，提高了生 产成本；反应后酶会
混在产物中，可能影
响产品质量。
固定化酶 固定化细胞
酶既能与反应物接触， 又能与产物分离，同 时，固定在载体上的 酶还可以被反复利用。
（一） 固定化酶的应用实例
阅读P49，并思考： 1、解决酶应用中存在问题的方法是？ 2、这种方法的优点是什么？ 3、什么是高果糖浆？使用它有何好处？ 4、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是
什么？这种酶有何特点？ 5、了解高果糖浆生产过程。
在生产实际中使用固定化酶技术 有无不足?如有不足,怎么办?
有 一种酶只能催化一种化学反应， 而在生产实际中很多产物的形成 都通过一系列的酶促反应才能进 行，所以操作比较麻烦。 可采用固定化细胞技术。
5、固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。 将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右。
这一阶段成功与否呢？怎样评价？
观察凝胶珠的颜色和形状: 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏 低，固定的酵母细胞数目较少； 如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度 偏高，制作失败，需要再作尝试。
（二）固定化酵母细胞的发酵
冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲 洗2～3次。
发酵：150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞 →200mL锤形瓶→密封→25℃发酵24h。
1、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？
2、锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？
3、在利用固定化酶或固定化细胞进行生产的 过程中，需要无菌操作吗？