一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法
滇重楼辣椒轻斑驳病毒分离物的鉴定及全基因组序列分析
滇重楼辣椒轻斑驳病毒分离物的鉴定及全基因组序列分析作者：杨林毅陈潞陈泽历来源：《湖北农业科学》2020年第13期摘要：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是多年生草本植物，其药用部位为地下根茎，是一种重要的中药材。
为明确侵染滇重楼的病毒病原，对采自云南省曲靖市的滇重楼进行透射电镜观察、DAS-ELISA和RT-PCR技术检测。
在透射电镜下观察到杆状病毒粒子，大小为（200～300） nm×（20～36） nm。
对采集到的7份病样进行DAS-ELISA检测，结果表明，其中5份病样呈阳性。
通过RT-PCR技术扩增、克隆获得1个全长为6 357 bp的曲靖分离物PMMoV-QJ的全基因组序列。
将PMMoV-QJ的全基因组序列与国内外已经报道的10个PMMoV分离物进行同源性分析比对，其同源性为99.42%～99.81%。
基于全基因序列的系统发育分析表明，PMMoV-QJ与韩国分离物亲缘关系密切。
本研究明确了该分离物的亲缘关系，从分子水平鉴定该分离物，为后续滇重楼病毒病的预防提供理论依据。
关键词：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）;辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）;鉴定;序列分析Abstract： Paris polyphylla var. yunnanensis is a perennial herb， and its medicinal part is underground rhizomes. It is an important chinese medicinal material. In order to clarify the viral pathogens infecting the Paris polyphylla， the transmission electron microscopy， DAS-ELISA and RT-PCR techniques were performed on the Paris polyphylla collected from Qujing， Yunnan province. Baculovirus particles were observed under transmission electron microscopy and were （200～300）nm ×（20～36）nm in size. The results of DAS-ELISA on 7 samples collected showed that 5 of them were positive. A whole genome sequence of a 6 357 bp Qujing isolate （PMMoV-QJ， accession number MK784568） was cloned by RT-PCR amplification. The homologous sequence of PMMoV-QJ were analyzed by homology with 10 PMMoV isolates reported at home and abroad， and the homology was between 99.42% and 99.81%. Phylogenetic analysis based on the whole gene sequence showed that PMMoV-QJ was closely related to Korean isolates.This study clarifies the genetic relationship of the isolate， and identifies the isolate from the molecular level， which provides a theoretical basis for the prevention of the subsequent viral disease.Key words： Paris polyphylla var. yunnanensis; pepper mild mottle virus（PMMoV）; identification; sequence analysis滇重樓（Paris polyphylla var.yunnanensis）又称独角莲，属延龄草科重楼属（Paris）多年生草本植物，其药用部位为地下根状茎，分布于亚欧大陆温带和热带地区，在中国主要集中在西南地区，其中以云南省滇中、滇东和滇东北、滇西和滇西北为主[1]。
应用SS-PCR技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇
应用SS-PCR技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇【摘要】本研究利用SS-PCR技术设计了种特异性引物，实现了对瓜实蝇的快速鉴定。
首先介绍了SS-PCR技术的原理以及设计特异性引物的方法，然后详细阐述了快速鉴定瓜实蝇的步骤和结果。
实验结果表明，设计的引物能够准确鉴定瓜实蝇，具有较高的特异性和灵敏度。
讨论部分对实验结果进行了分析和解释，并指出SS-PCR技术在瓜实蝇鉴定中的优势和应用前景。
结论部分总结了本研究的意义，指出SS-PCR技术可用于快速鉴定瓜实蝇，并展望了未来的研究方向。
本研究为瓜实蝇的鉴定提供了一种快速、准确的方法，具有重要的应用意义和发展前景。
【关键词】SS-PCR技术, 种特异性引物, 瓜实蝇, 快速鉴定, 实验结果, 讨论, 应用前景, 研究展望.1. 引言1.1 研究背景瓜实蝇是一种害虫，在农业生产中造成了严重的危害。
它主要危害瓜类作物，如西瓜、甜瓜等，导致果实腐烂变质，影响农作物的生长和产量。
传统的鉴定方法存在一定的局限性，不能快速、准确地鉴定瓜实蝇的种类，给防治工作带来了一定的困难。
随着分子生物学技术的不断发展，引物PCR法已经成为一种快速、灵敏的鉴定方法。
SS-PCR技术是一种种特异性PCR技术，可以通过设计特异性引物来快速鉴定目标物种。
本研究旨在应用SS-PCR技术设计种特异性引物，实现对瓜实蝇的快速鉴定，为瓜实蝇的防治提供更为有效的手段。
通过对SS-PCR技术的介绍和设计种特异性引物的原理进行研究，我们可以更好地了解如何利用这一技术快速鉴定瓜实蝇。
这将为瓜实蝇的快速鉴定和防治提供重要的理论支持和技术手段。
1.2 研究目的瓜实蝇是一种危害瓜类作物的重要害虫，给农作物的生长发育带来严重威胁。
目前针对瓜实蝇的鉴定方法主要以显微镜观察形态特征为主，存在着鉴定时间长、操作复杂、易出现误判等问题。
本研究旨在利用SS-PCR技术设计种特异性引物，实现对瓜实蝇的快速、准确鉴定。
通过研究，旨在提高瓜实蝇的鉴定效率，减少误判的发生，为农民提供更加便捷、有效的瓜实蝇防控技术。
【CN109943650A】一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光PCR方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910386731.7(22)申请日 2019.05.10(71)申请人 太原市食品药品检验所地址 030031 山西省太原市小店区龙城大街85号(72)发明人 杨宝 李忠华 郑巍 马宁 李燕玮 (74)专利代理机构 太原晋科知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 14110代理人 王瑞玲 翟冲燕(51)Int.Cl.C12Q 1/6888(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光PCR方法(57)摘要本发明属中药及中药材鉴定技术领域，为解决目前乌鞘蛇检测方法容易出现假阳性结果，无法应用于市场快速检测等问题，提供一种采用特异性引物鉴定乌梢蛇中药材真伪的实时荧光PCR 方法，用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的特异性引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；探针序列如SEQ ID NO：3所示。
通过DNA快速提取、实时荧光PCR特异性扩增，即可完成对样品真伪的鉴别。
本发明具有引物探针双重特异性其特异性更高、荧光检测灵敏度更高、无需电泳过程方法检测时间短，药典检测方法需要4小时左右，本方法仅需1.5h、所需仪器设备少可应用于快检车服务市场等优点。
权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图3页CN 109943650 A 2019.06.28C N 109943650A权 利 要 求 书1/1页CN 109943650 A1.用于鉴别乌鞘蛇中药材真伪的特异性引物和探针，其特征在于：所述引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述探针序列如SEQ ID NO：3所示，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
关于滇重楼内生真菌抗菌活性的筛选和菌株鉴定研究
227学术论丛关于滇重楼内生真菌抗菌活性的筛选和菌株鉴定研究代娇 宋秋玲 田甜曲靖医学高等专科学校摘要：采用实验分析的方法，依靠实验进一步分析了滇重楼的真菌抗菌活性及其菌株鉴定结果。
从实验结果来看，滇重楼中的金黄色葡萄球菌具有理想的抗菌活性，并且菌株鉴定结果显示，该菌株为墙粘鞭霉，因此应该得到相关人员的关注。
关键词：滇重楼；内生真菌抗菌活性；菌株鉴定前言：滇重楼是一种广泛分布于云南、贵州等地区的药材，其根茎可以用药，具有良好的清热解毒、消肿止痛的功能，在临床上常被用于治疗咽喉肿痛、毒蛇咬伤等症状，其效果显著。
内生真菌是指生活在植物组织内部而不影响植物组织明显症状的真菌，内生真菌可以分泌毒素或者抗菌物质，影响了药物的临床应用。
1.实验与材料分析1.1原材料的选择在本次研究中，选取10株滇重楼为研究对象，所选药物均为当地化学与生物技术学院保存的菌种。
本次研究中的培养基为：PDA(马铃薯培养基)、NB(牛肉蛋白胨培养基)与固体发酵培养基。
1.2对原材料的处理将本组10株滇重楼发酵物用95%乙醇浸泡之后，超声处理30min，并用纱布做好过滤；之后取菌丝体，将其加入到80%的丙酮中进行浸泡处理，在经真空泵抽取之后，做好过滤。
此时向滤液中添加100ml 的乙醇乙酯，之后萃取乙酸乙酯层，并将其与萃取液合并在一次。
之后萃取液在经过40℃的减压蒸馏之后，可以干燥处理，这样就能获得粗提取物浸膏。
最后，提取100mg 的提取物浸膏，并通过1ml 无水乙醇完全溶解之后，将最终处理的后获得的抗菌实验样品为实验品。
1.3发酵物的抗菌活性检测采用滤纸片扩散法进行发酵物的抗菌活性检测，将试菌培养液均匀涂抹在抗菌实验样品上，之后在NB 平板上的适当位置粘贴蘸取了待测菌种发酵物乙醇提取物的滤纸片，同时选取100μg /ml 无菌水与青霉素进行对照，在37℃环境下来培养1d 时间，观察细菌的生长情况，并按照交叉法来测量抑菌圈的变化，评估抑菌效果。
应用SS-PCR技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇
应用SS-PCR技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇【摘要】本文旨在利用SS-PCR技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇。
首先介绍了SS-PCR技术的原理和设计种特异性引物的方法，然后详细描述了研究方法和实验设计。
结果分析显示，通过SS-PCR技术成功鉴定了瓜实蝇。
实验过程中，应用SS-PCR技术鉴定瓜实蝇的具体步骤也被阐述。
结论部分探讨了SS-PCR技术在瓜实蝇鉴定中的应用意义，同时展望了未来的研究方向。
本研究为瓜实蝇的鉴定提供了一种快速、准确的方法，有助于瓜实蝇病虫害防控工作的开展。
【关键词】SS-PCR技术、种特异性引物、瓜实蝇、鉴定、实验设计、结果分析、应用、意义、展望1. 引言1.1 背景介绍瓜实蝇（Bactrocera cucurbitae）是一种重要的农业害虫，广泛分布在全球各地的瓜类作物上，给瓜果生产造成了严重的经济损失。
传统的瓜实蝇鉴定方法主要是基于形态学特征，但是这种方法存在操作复杂、耗时长、准确性低等缺点。
随着分子生物学技术的不断发展，SS-PCR技术成为一种快速、高效的种特异性引物设计和鉴定方法。
SS-PCR技术通过特异性引物与目标基因特异结合，实现种间差异性快速鉴定。
应用SS-PCR技术设计种特异性引物来快速鉴定瓜实蝇，具有重要的理论和实践意义。
本研究旨在探讨应用SS-PCR技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇的方法，为瓜实蝇的准确鉴定和有效防控提供技术支持，同时为相关领域的研究提供参考和借鉴。
1.2 研究目的The purpose of this study is to utilize the SS-PCR technology to design species-specific primers for the rapid identification of the melon fly. The melon fly, also known as the Bactrocera cucurbitae, is a devastating agricultural pest that causes extensive damage to melon crops. Current methods for identifying this pest are time-consuming and labor-intensive, making it difficult for farmers to detect and manage infestations in a timely manner.2. 正文2.1 SS-PCR技术原理SS-PCR技术（Sequence-Specific PCR）是一种基于PCR扩增技术的方法，通过设计种特异性引物来扩增特定序列的DNA。
pcr鉴定流程
pcr鉴定流程PCR鉴定流程可是个很有趣的东西呢！PCR就是聚合酶链式反应，这名字听起来就很厉害的样子。
那它的鉴定流程到底是怎样的呢？一、样本采集。
咱们做PCR鉴定啊，首先得有样本。
这样本的来源可就多啦。
比如说，如果你要鉴定某种细菌，那你就得从可能有这种细菌的地方采集样本，像土壤里、水里或者是生病的动植物身上。
要是鉴定人的基因相关的东西，那就得采集人的血液、唾液或者组织之类的。
这采集样本可不能马虎，就像你找宝藏，你得找对地方才能挖到好东西呀。
采集样本的时候呢，一定要注意保持样本的纯净，不能让其他杂质混进去，不然就像做菜的时候把沙子混进米里，后面肯定得出问题。
二、提取核酸。
有了样本之后，就要把里面的核酸提取出来。
这就像是从沙子里淘出金子一样不容易呢。
核酸是DNA或者RNA，这可是非常非常小的东西。
我们得用专门的试剂和仪器，把样本中的细胞打破，然后把核酸分离出来。
这个过程有点像给细胞做个小手术，要很小心很小心。
有时候，一个小失误，可能就导致提取出来的核酸量不够或者质量不好。
这就要求我们做这个步骤的时候，要像对待自己心爱的小宠物一样细心，严格按照操作步骤来，不能急急忙忙的。
三、设计引物。
引物就像是一把特殊的钥匙，它能找到我们想要鉴定的那段核酸序列。
这可需要一定的知识和技巧啦。
你得知道你要鉴定的目标序列的特点，然后根据这些特点来设计引物。
这就好比你要开一把锁，你得做出合适的钥匙形状。
引物设计不好的话，就像钥匙和锁不匹配，那后面的PCR反应就没法好好进行啦。
这个过程有时候可能会很折磨人，试了一次又一次，但是当你终于设计出合适的引物的时候，那种感觉就像打游戏通关了一样爽。
四、PCR反应。
这是整个鉴定流程的核心部分啦。
把提取出来的核酸、设计好的引物，还有一些其他的试剂，像酶啊、缓冲液之类的，都放在一个小管子里。
然后把这个小管子放到PCR仪里面。
PCR仪就像一个魔法小盒子，它会让里面的反应按照我们设定好的程序进行。
鉴别重楼属属级植物的方法、试剂及应用
鉴别重楼属属级植物的方法、试剂及应用一、鉴别重楼属属级植物的方法重楼属的植物都长得有点像，要鉴别它们还真有点像玩侦探游戏呢。
首先我们可以看叶子，有些重楼属植物的叶子形状很特别，比如有的叶子是长椭圆形的，边缘还可能有小锯齿。
就像我们看人的脸一样，不同的叶子形状就是它们的特征之一。
再就是看花朵，重楼属植物的花朵颜色、大小、花瓣的数量和形状都可以成为鉴别的关键。
有的花朵是白色的，有的可能带点紫色，花瓣可能是细长的，也可能是比较圆润的。
这就好比每个人的发型不一样，花朵的这些特点也是它们的“发型”标识。
二、鉴别重楼属属级植物的试剂1. 化学试剂方面可以使用一些染色试剂，像碘液之类的。
碘液可以和植物细胞内的某些物质发生反应，不同的重楼属植物可能会有不同的反应结果。
比如说，有的重楼属植物细胞经碘液染色后会呈现出比较深的蓝色，而有的可能是浅蓝色或者其他颜色。
这就像是给植物细胞做了个特殊的“标记”，通过这个标记来区分它们。
酸碱试剂也能派上用场。
有些重楼属植物对酸碱的反应不一样。
把植物的部分组织放在酸碱溶液里，观察它们的变化，比如颜色变化或者组织的软化、硬化等情况。
就像不同的人对不同的环境有不同的反应一样，植物对酸碱环境的反应也能帮助我们鉴别。
2. 生物试剂可以利用一些特异性的抗体试剂。
如果能够找到针对重楼属植物特定蛋白质的抗体，那么当这种抗体和植物组织中的蛋白质结合时，就会产生特定的现象，比如沉淀或者颜色变化等。
这就像是一把专门开某把锁的钥匙，只有对应的植物才会有这种反应。
三、鉴别重楼属属级植物的应用1. 在药用方面的应用准确鉴别重楼属植物对于中药材的质量控制非常重要。
因为不同的重楼属植物可能含有不同的药用成分，功效也可能有所差异。
如果把错误的重楼属植物当成药用重楼使用，可能就达不到治疗的效果，甚至可能对患者有不良影响。
就像你生病要吃对药一样，中药材也得是正确的才行。
在新药研发中，了解不同重楼属植物的特性有助于开发出更有针对性的药物。
三种植物EST-SSR引物在滇重楼上的通用性分析
三种植物EST-SSR引物在滇重楼上的通用性分析杨维泽;许宗亮;杨绍兵;杨美权;左应梅;杨天梅;张金渝【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2014(027)004【摘要】为了筛选适合用于滇重楼种质资源整理、评价和遗传研究的SSR标记,首次利用百合(35对)、延龄草(10对)、薯蓣(5对)的EST-SSR标记对5份滇重楼材料进行PCR扩增,分析3种植物引物在滇重楼中的通用性.结果显示,40对引物在滇重楼中能有效扩增,占引物总数的80.0％,其中32对引物具有多态性,占引物总数的64.0％,引物通用率较高;利用15对具有多态性的引物对35份滇重楼材料进行多态性检测,等位基因数(A)、有效等位基因数(Ae)、Nei's基因多样性(H)、Shannon 指数(I)及多态位点百分比(PPB％)分别为1.9955、1.2634、0.1811、0.3075和99.5％,滇重楼显示出较为丰富的遗传多样性.3种植物的EST-SSR引物在滇重楼中具有较高的通用性,通过对3种植物EST-SSRs引物的开发,有助于重楼属在遗传多样性、基因定位、连锁图谱的构建及比较基因组学等方面的研究.【总页数】5页(P1686-1690)【作者】杨维泽;许宗亮;杨绍兵;杨美权;左应梅;杨天梅;张金渝【作者单位】云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明650231;昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明650504;云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明650231;云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明650231;云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明650231;云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明650231;云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明650231;云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明650231;昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明650504【正文语种】中文【中图分类】S567【相关文献】1.小麦SSR和EST-SSR引物对无芒雀麦的通用性分析 [J], 程雪妮;王颖;庞玉辉;陈新宏;武军;赵继新2.山核桃EST-SSR引物的筛选及通用性分析 [J], 黄少勇;张智俊;罗淑萍;李疆3.猕猴桃EST-SSR引物筛选及通用性分析 [J], 廖娇;黄春辉;辜青青;曲雪艳;徐小彪4.鹅掌楸EST-SSR引物开发及通用性分析 [J], 胥猛;李火根5.冰草EST-SSR引物和小麦EST-SSR引物在黑麦属基因组的通用性分析 [J], 李飞;代明;段清清;杨燕萍;车永和;张锦鹏;鲁玉清;李秀全;杨欣明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种特异性引物及中药材乌梢蛇的PCR鉴别方法[发明专利]
![一种特异性引物及中药材乌梢蛇的PCR鉴别方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/81e4ffeeeff9aef8951e06be.png)
专利名称：一种特异性引物及中药材乌梢蛇的PCR鉴别方法专利类型：发明专利
发明人：曹晖,周娜娜,张英,吴孟华,何倾,马志国
申请号：CN201811523650.9
申请日：20181213
公开号：CN109439660A
公开日：
20190308
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种特异性引物及中药材乌梢蛇的PCR鉴别方法，该特异性引物是cyt
b‑05‑F和cyt b‑‑05‑R，其序列分别如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示。
一种中药材乌梢蛇的PCR 鉴别方法包括以下步骤：提取中药材的基因组DNA作为模板，加入权利要求1所述的引物进行PCR反应；反应结束后，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在200bp处有单一条带的为乌梢蛇正品。
本方法操作简单、易于掌握、准确性高，可准确鉴定乌梢蛇药材真伪。
申请人：暨南大学
地址：510632 广东省广州市天河区黄埔大道西601号
国籍：CN
代理机构：广州市华学知识产权代理有限公司
代理人：郭炜绵
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高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法[发明专利]
![高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/965c6166e53a580217fcfe2c.png)
专利名称：高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法
专利类型：发明专利
发明人：黄璐琦,冯成强,唐晓晶
申请号：CN200410006374.0
申请日：20040301
公开号：CN1560272A
公开日：
20050105
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明是利用DNA分子遗传标记技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法。
设计了一对高特异性鉴别引物，通过高特异性聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别中药材乌梢蛇与市场上常见的伪品：滑鼠蛇、黑眉锦蛇、红点锦蛇、王锦蛇、赤链华游蛇、玉斑锦蛇、赤链蛇、灰鼠蛇、眼镜蛇、三索锦蛇。
使用此方法鉴别乌梢蛇的真伪，只通过简单的乌梢蛇及其伪品的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测三步即可完成对药材真伪的鉴别。
操作简单、易于掌握、准确性高。
申请人：中国中医研究院中药研究所
地址：100700 北京市东直门内南小街16号
国籍：CN
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适用于不同产地半夏药材的特异性引物PCR鉴定分析方法
适用于不同产地半夏药材的特异性引物PCR鉴定分析方法陈蓉;吴成丽;邓赟;卞金辉【摘要】目的:通过特异性引物PCR技术,建立不同产地半夏药材通用的聚合酶链式反应(PCR)鉴别法.方法:提取不同产地半夏药材的基因组DNA,利用特异性引物对基因组DNA进行扩增,通过琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行分析.结果:所设计的引物能够特异性地扩增出半夏的目的DNA,并适用于全国9个主要不同产地半夏药材的检测.结论:该方法具有较强的特异性和普适性,适用于半夏药材的真伪性鉴别.【期刊名称】《中药与临床》【年(卷),期】2015(006)006【总页数】2页(P14-15)【关键词】半夏;特异性引物;PCR【作者】陈蓉;吴成丽;邓赟;卞金辉【作者单位】成都中医药大学民族医药学院,四川成都611137;成都中医药大学民族医药学院,四川成都611137;成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地,四川成都 611137;成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地,四川成都 611137【正文语种】中文【中图分类】R284.1半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata （Thumb.）Breit.的干燥块茎，中医认为半夏具有降逆止呕，燥湿化痰，消痞散结的功效，目前被应用于藿香正气水、藿香正气液等藿香正气系列产品中，具有良好的临床疗效［1，2］。
由于商业需求量大，加之巨大经济利益的驱使，目前中药市场上充斥着大量半夏的混伪品如虎掌半夏、水半夏、天南星［3］等。
由于天南星科植物缺乏特征的理化特性，利用传统的化学分析方法难以鉴别半夏药材及其混伪品。
随着分子生物学技术的发展，李萍等利用RFLP技术成功地将川贝母和其他贝母类药材进行了鉴别［4，5］，Peng Xiaoxiao等建立了PCR-RFLP鉴别金银花的DNA分子鉴定方法［6］，《中国药典》也收录了乌梢蛇和蕲蛇的特异性引物聚合酶链式反应（PCR）鉴别法［7］。
中药材品种高特异性PCR鉴别原理及其应用前景
中药材品种高特异性PCR鉴别原理及其应用前景
王义权;周开亚;徐璐珊;徐国钧
【期刊名称】《中草药》
【年(卷),期】1999(30)8
【摘要】中药材品种高特异性ＰＣＲ鉴别是新近报道的一种具有实用价值的中药
材品种分子遗传标记鉴别方法。
概述了中药材品种高特异性ＰＣＲ鉴别的原理，归纳了鉴别引物的设计原则，展望了该方法在中药材品种鉴定中良好的应用前景。
【总页数】3页(P628-630)
【关键词】PCR鉴别;生药鉴定;中药材
【作者】王义权;周开亚;徐璐珊;徐国钧
【作者单位】南京师范大学遗传资源研究所;中国药科大学生药学研究室
【正文语种】中文
【中图分类】R282.710.3
【相关文献】
1.高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品 [J], 唐晓晶;冯成强;黄璐琦;钱忠直;崔光红;张继
2.中药材五灵脂特异性PCR鉴别方法的研究 [J], 马德源;谭晴晴;陈力群;刘艳艳;葛付存;王佩仪;步迅;陈雪燕;张全芳
3.用雄性特异性抗体和雄性特异性引物PCR技术鉴别胚胎性别的实际应用展望 [J], K.Utsumi;张健
4.中药材蕲蛇及其常见混伪品的特异性PCR鉴别 [J], 宋文成;宋社吾;刘道芳;顾静;刘海兵;宋礼华
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说明书摘要本发明涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，属于分子标记技术领域，所述的一组PCR特异性鉴别引物的核苷酸序列分别为CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。
采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。
本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。
摘要附图1．一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：所述的一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。
2．根据权利要求1所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：其构建的具体步骤为：1）提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；2）以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的PCR扩增产物进行测序；4）使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；5）利用primer premier 5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物。
3．根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM 10×PCR Taq buffer （Mg2+plus）、10mM dNTP、上下游引物各10μM、1U DNA Taq 聚合酶、1μL DNA 模板、ddH2O补足25μL。
4．根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环。
5．一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：具体步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。
6．根据权利要求5所述的一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：步骤2）中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环。
一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法技术领域本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法。
背景技术重楼属(Paris L.) 是百合科多年生草本植物,《中国植物志》英文版中记载重楼属植物全世界约有39 个物种, 主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。
该属植物在国内多做药用, 其中滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.)Hand.- Mazz.)及华重楼[P. polyphylla var. chinensis(Franch.) Hara.] 收载于2005 年版《中国药典》, 是云南白药等多种中药的重要原料之一。
然而重楼植物分类复杂, 由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。
近年来，随着对重楼需求量的增大，野生重楼资源急剧减少，采集野生滇重楼不能满足市场需求,更破坏了生态环境和滇重楼资源，寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。
有关重楼植物鉴定，已有形态学、细胞学(包括核型和染色体多态性)和RAPD、AFLP 等DNA分子标记方面的研究，这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。
而位点PCR 技术直接利用DNA 序列进行物种的鉴定，具有独一无二的可重复性，为药用植物鉴定带来了新的机遇。
目前，运用DNA 分子标记技术对重楼属植物进行鉴定上，有学者运用过对滇重楼（P. polyphylla var. yunnanensis）、南重楼（Paris vietnamensis）与华重楼（P. polyphylla var. chinensis）等11个物种，比较几种片段各序列扩增和测序效率、种内和种间变异(朱英杰,陈士林,姚辉,谭睿,宋经元,罗焜,鲁静.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究[J]. 药学学报. 2010(03) )。
也有学者采用扩增叶绿体psbA-trnH 序列计算种内和种间遗传距离，构建邻接树( neighbor-joining tree) 进行滇重楼及其同属物种的鉴定(刘涛，赵英良，杨莹等.滇重楼的psbA-trnH 条形码分子鉴定研究[J].天然产物研究与开发，2015，27:758-762)。
上述技术显示了DNA条形码在滇重楼药材真伪鉴别应用的可能性，本发明利用特异性位点PCR的技术，克服了传统鉴别方法中样品量大，主观性大等问题，将之和南重楼、长柱重楼、大理重楼等进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。
发明内容为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义，且操作简单、鉴别快速。
为实现上述目的,本发明是通过如下技术方案实现的：一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。
进一步地，一组PCR特异性鉴别引物的构建步骤为：1）提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；2）以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR 扩增；3）对步骤2）的PCR扩增产物进行测序；4）使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；6）利用primer premier 5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物（CL-F，CL-R）。
进一步地，步骤2）中，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM 10×PCR Taq buffer（Mg2+plus）、10mM dNTP、上下游引物各10μM、1U DNA Taq 聚合酶、1μL DNA模板、ddH2O补足25μL。
进一步地，步骤2）中，PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环。
一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，具体步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。
进一步地，步骤2）中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环。
本发明的有益效果：本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，打破了依赖植物开花期作为滇重楼及物种鉴定的局限，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义；本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势，非常有利于中药的快速鉴别。
附图说明图1为滇重楼及其混淆品总DNA的电泳检测图谱；图2为滇重楼及其混淆品通用引物ITS2扩增的电泳检测图谱；图3为滇重楼及其混淆品鉴别引物的电泳检测图谱。
图中，1.滇重楼Paris polyphyllavar. yunnanensis (Franch) Hand. -Mazz；2.毛重楼Paris aireiLeveille；3.多叶重楼Paris polyphylla Smith in Rees；4.七叶一枝花(长狭叶)Paris polyphyllavar. chinensis (Franch.) Hara；5.大理重楼Paris daliensisH. Li & V. G. Soukup；6.南重楼Parisietnamensis (Takhtajan) H. L ；7.长柱重楼Paris forrestii (Takht.) H. Li；8.七叶一枝花Paris polyphyllavar. chinensis (Franch.) Hara ；9.五指莲重楼Paris axialis H. Li ；10.阴性对照。
具体实施方式引物设计提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA，选择通用引物ITS2对滇重楼和混淆品进行扩增，扩增后样品送至上海生工生物公司测序。
滇重楼以及其伪品ITS2片段测序所得结果使用BioEdit软件进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点，发现滇重楼变异位点较多，190bp处滇重楼为A，七叶一枝花-长狭叶为T，而其他混淆品为C，203bp处为C，而其他混淆品均为T，206bp 处滇重楼为G，而其他混淆品均为C，275bp处滇重楼为A，而其他混淆品均为C，276bp处滇重楼为G，而其他混淆品均为C，320bp处滇重楼为A，而其他混淆品均为G，331bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，363bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，389bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，391bp 处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，利用primer premier 5.0软件，选择203bp和331bp处的位点设计1对特异性PCR引物（CL-F,CL-R），其核酸序列分别如下：ITS2F：5’—ATGCGATACTTGGTGTGAAT—3’ITS3R：5’—GACGCTTCTCCAGACTACAAT—3’CL-F:：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。