一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法

说明书摘要

本发明涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，属于分子标记技术领域，所述的一组PCR特异性鉴别引物的核苷酸序列分别为CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。

摘要附图

1．一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：所述的一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；

CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。

2．根据权利要求1所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：其构建的具体步骤为：

1）提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；

2）以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增；

3）对步骤2）的PCR扩增产物进行测序；

4）使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；

5）利用primer premier 5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物。

3．根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM 10×PCR Taq buffer （Mg2+plus）、10mM dNTP、上下游引物各10μM、1U DNA Taq 聚合酶、1μL DNA 模板、ddH2O补足25μL。

4．根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环。

5．一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：具体步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；

2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进

行PCR扩增；

3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。6．根据权利要求5所述的一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：步骤2）中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环。

一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法。

背景技术

重楼属(Paris L.) 是百合科多年生草本植物,《中国植物志》英文版中记载重楼属植物全世界约有39 个物种, 主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用, 其中滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.)Hand.- Mazz.)及华重楼[P. polyphylla var. chinensis(Franch.) Hara.] 收载于2005 年版《中国药典》, 是云南白药等多种中药的重要原料之一。

然而重楼植物分类复杂, 由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。近年来，随着对重楼需求量的增大，野生重楼资源急剧减少，采集野生滇重楼不能满足市场需求,更破坏了生态环境和滇重楼资源，寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。有关重楼植物鉴定，已有形态学、细胞学(包括核型和染色体多态性)和RAPD、AFLP 等DNA分子标记方面的研究，这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而位点PCR 技术直接利用DNA 序列进行物种的鉴定，具有独一无二的可重复性，为药用植物鉴定带来了新的机遇。

目前，运用DNA 分子标记技术对重楼属植物进行鉴定上，有学者运用过对滇重楼（P. polyphylla var. yunnanensis）、南重楼（Paris vietnamensis）与华重楼（P. polyphylla var. chinensis）等11个物种，比较几种片段各序列扩增和测序效率、种内和种间变异(朱英杰,陈士林,姚辉,谭睿,宋经元,罗焜,鲁静.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究[J]. 药学学报. 2010(03) )。也有学者采用扩增叶绿体

psbA-trnH 序列计算种内和种间遗传距离，构建邻接树( neighbor-joining tree) 进行滇重楼及其同属物种的鉴定(刘涛，赵英良，杨莹等.滇重楼的psbA-trnH 条形码分子鉴定研究[J].天然产物研究与开发，2015，27:758-762)。

上述技术显示了DNA条形码在滇重楼药材真伪鉴别应用的可能性，本发明利用特异性位点PCR的技术，克服了传统鉴别方法中样品量大，主观性大等问题，将之和南重楼、长柱重楼、大理重楼等进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义，且操作简单、鉴别快速。

为实现上述目的,本发明是通过如下技术方案实现的：

一组PCR特异性鉴别引物为：

CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；

CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。

进一步地，一组PCR特异性鉴别引物的构建步骤为：

1）提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；

2）以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR 扩增；

3）对步骤2）的PCR扩增产物进行测序；

4）使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找