逆境生理指标的测定

逆境生理指标的测定

要求：选三个指标

一、植物组织中超氧物歧化酶活性的测定

催化下列反应：

2 +2H + → H 2O 2 + O 2

反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。 原理

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 ， 可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除 从而抑制了蓝色化合物的形成。因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 试剂

L 磷酸缓冲液（）；

130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml ；

O 2

●

O 2●

O 2●

O 2●O 2●

750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；

100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml；20μmol/L核黄素溶液：取0.00753g核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml避光保存(当天配制)。

方法

1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取2~3ml于10000rpm下离心10分钟，上清液即为SOD粗提液。

2、显色反应取5ml试管（或指形管，要求透明度好）7支，3支试管为测定管，另4支为对照管，按表1加入各溶液。

混匀后将1支对照管置暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应20min （要求各管受光情况一致，反应室的温度高时反应时间可以缩短，温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。

表1 各溶液加入量

3、蛋白浓度的计算 蛋白浓度＝

W

a v

c ⨯⨯ 单位：mg 蛋白/g 样重 c －通过标准曲线查得的每管中蛋白含量（mg ） v －样液总体积（ml ）

a －测定时提取液体积用量（ml ）

W －样重（g ）

4、SOD 活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管作空白，在560nm 下分别测定其它各管的光密度值，SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD 活性。

SOD 总活性 =

a

W A V

A A ck E ⨯⨯⨯⨯-5.0)(ck 单位：酶单位/g 鲜重表示；

A ck ―照光对照管的光密度值； A E —样品管的光密度值； V —样液总体积（ml ）； a —测定时样品用量（ml ）； W

—样重（g ）； 二、氧自由基的测定 原理：

与羟胺反应生成NO 2- ，NO 2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红

色的偶氮染料，染料在λ530nm 有显著吸收，根据OD 530可以算出样品中的 含量。 步骤：

1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加1ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml 。取2~3ml 于10000rpm 下离心10分钟，上清液即为SOD 粗提液。

O

2

●

O 2●

2亚硝酸根标准曲线的制作：1ml系列浓度的NaNO2(0、5、10、15、20、30、40和50mol /L)分别加入l m1对氨基苯磺酸和lmlα-萘胺，于25℃中保温20min，然后测定OD550，以[NO2-]和测得的OD530值互为函数作图，制得亚硝酸根标准曲线。

3 O2-含量测定：0.5m1样品提取液中加入0.5m150mmo1/L磷酸缓冲液，1m1的1mmo1／L盐酸羟胺，摇匀，于25℃中保温l h，然后再加人l m117mmo1/L

O2●

对氨基苯磺酸(以冰醋酸：水＝3：1配制)和1m1 7mmol/Lα-萘胺(以冰醋酸：水＝3：1配制)，混合，于25℃中保温20min，取出以分光光度计测定波长530nm的OD值。

根据测得的OD530，查NO2—标准曲线，将OD530换算成[NO2-]，然后依照羟胺与的反应式：NH2OH十2O2十H+ NO2-十H2O2十H2O从[NO2-]对[O2]进行化学计量，即将 [NO2-]乘以2，得到[O2]根据记录样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，可求得产生速率(nmo1min-1mg-1蛋白)。

三、植物体内游离脯氨酸含量的测定

植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

原理

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其光密度成正比。

试剂

3%磺基水杨酸水溶液；甲苯；

%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3d有效；

脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液。

方法

1．标准曲线制作

（1）取7支具塞刻度试管按表1加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。

（2）取出、冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。