真菌α-淀粉酶的研究和应用
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选实验项目性质：设计性涉及的知识点：无菌技术、浓缩培养、纯种子分离、淀粉酶特性和酶活性测定。
计划学时：8学时一、实验目的1.掌握从环境中采集样本并从中分离纯化某些微生物的完整操作步骤。
2.巩固之前所学的微生物学实验技术。
3.掌握产酶微生物的筛选方法。
二、实验原理α-淀粉酶是一种液化淀粉酶。
其产生菌芽孢杆菌广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉的土壤样品中。
从自然界筛选菌株的具体方法大致可分为以下四个步骤：取样、增殖培养、纯种子分离和性能测定。
1、采样：即采集含菌的样品在收集含有细菌的样本之前，你应该调查和研究你打算筛选的微生物分布在哪里，然后你可以开始做各种具体的工作。
几乎所有种类的微生物都可以在土壤中找到，因此土壤可以说是微生物的基础。
在土壤中，细菌数量最多，其次是放线菌、第三种霉菌和酵母。
除土壤外，各种物体上都有相应的优势微生物。
例如，枯枝、腐叶、腐土和腐木中的纤维素分解细菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中的淀粉分解细菌较多，水果和蜜饯表面的酵母较多；植物奶中含有较多的乳酸菌，油田和炼油厂附近的土壤中含有较多的石油分解菌。
2、增殖培养（又称丰富培养）增殖培养是在采集的土壤和其他含有细菌的样本中添加一些物质，并创造一些其他有利于待分离微生物生长的条件，以便能够分解和利用这些物质的微生物能够大量繁殖，以便我们从中分离出这些微生物。
因此，增殖培养实际上是选择性培养基的实际应用。
3、纯种分离在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。
通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。
纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
4.业绩衡量分离得到纯种这只是选种工作的第一步。
所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。
α-淀粉酶
α-淀粉酶在结构上的相似性使人们相信它们具有相似的 催化机制。McCarter、Davies均提出α-淀粉酶的催化过 程包括三步，共发生2次置换反应。第一步，底物某个 糖残基要先结合在酶活性部位的-1亚结合位点，该糖基 氧原子被充当质子供体的酸性氨基酸(如Glu)所质子化;第 二步，-1亚结合位点的另一亲核氨基酸(如Asp)对糖残基 的Cl碳原子进行亲核攻击，与底物形成共价中间物，同 C 时裂解Cl-OR键，置换出底物的糖基配基部分;第三步， 糖基配基离去之后，水分子被激活(可能正是被刚去质 子化的Glu所激活)，这个水分子再将Asp的亲核氧与糖残 基的C1之间的共价键Cl-Asp水解掉，置换出酶分子的Asp 残基，水解反应完成。在第二次置换反应中，如果进攻 基团不是水分子，而是一个带有游离羟基的糖(寡 糖)ROH，那么酶分子的Asp残基被置换出后，就发生了 糖基转移反应而非水解反应。
在米曲霉的Taka-淀粉酶A(TAA)中，在活性部 位发现有三个酸性氨基酸残基，Asp206， Glu230，Asp 297，定点突变研究发现它们 是催化所必需的氨基酸。研究发现TAA中这 三个催化所必需的氨基酸在其它的α-淀粉酶 以至于α-淀粉酶家族中也是共有的。
Tonozaka(1993)通过对不同来源的37个α-淀粉酶基因分支酶基因，异 淀粉酶基因等进行同源序列的比较，微生物与动物和植物产生的α-淀 粉酶的氨基酸序列之间的同源性不超过10%，但发现这些淀粉酶有 ABCD四个区域有高度的保守性，推测这些保守区域与其底物的结合 或催化中心有关。 尽管不同来源的α-淀粉酶在氨基酸序列上是不同的，但它们却共同拥 有相同的基本次级结构，如(β/α)8结构(亦称之为TIM－桶)——由8个螺 旋包围8个β-折叠组成的筒状结构。该结构被认为具有催化能力的结 构。 YJanec k，S.通过对α-淀粉酶家族研究发现大部分α-淀粉酶除了含有 八个(β/α)桶状结构的催化中心(domain A)外，还包括domains B、C和 D。其中domain B具有三个β折叠和三个α螺旋，长度和结构随来源的 不同而变化。Domain C区是催化区域后面的区域，主要由β折叠组成， 该区被认为有保护催化中心疏水氨基酸的稳定性的作用。 另外，有一些α-淀粉酶包含一个没有催化功能的淀粉结合位点(starchbinding domain)。 此外，几乎所有α-淀粉酶都是金属酶，每个酶分子至少含有一个钙离 子，钙离子使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定 性。
α淀粉酶在畜禽生产中的作用机理及应用进展
α-淀粉酶在畜禽生产中的作用机理及应用进展摘要随着近代酶技术及生物技术的发展，高效能生物活性物质——酶制剂已能大规模地工业化生产，并被应用于饲料工业中，许多实验和实际应用结果都表明，饲用酶制剂作为一种饲料添加剂能有效地提高饲料的利用率、促进动物生长和防治动物疾病的发生，与抗生素和激素类物质相比，具有卓越的安全性，引起了全球范围内饲料行业的高度重视。
饲用酶种类繁多，淀粉酶作为其中的一种，在畜禽生产中取得了相当好的效果。
本文主要介绍淀粉酶的组成、基本性质以及在畜禽生产中的应用。
关键词：α-淀粉酶畜禽生产作用机理应用进展正文：1、α-淀粉酶的简介1.1 α-淀粉酶的定义淀粉酶是一类能分解淀粉糖苷键的酶的总称，广泛存在于动植物和微生物中，是利用最早、用途最广、工业产量最大的酶制剂品种。
按照水解淀粉酶的方式，淀粉酶主要可分为四大类：α-淀粉酶（α-amylase）、β-淀粉酶（β-amylase）、葡萄糖淀粉酶（glucoamylase）和异淀粉酶（isoamylase）。
［1］其中，α-淀粉酶（α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶，EC3.2.1.1）多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的α-1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。
［2］-［3］1.2 α-淀粉酶的分类和结构依α-淀粉酶产物不同可将它们分为糖化型和液化型两种：液化型α-淀粉酶，能将淀粉酶快速液化，其终产物为寡聚糖和糊精：糖化型α-淀粉酶有较强的酶切活性，在水解可溶性淀粉时，随着水解时间的延长而产生寡聚糖，麦芽糖直至葡萄糖。
按照其使用条件可以分为低温型、中温型、高温型、耐酸耐碱型。
按产生菌不同又可以分为细菌、真菌、植物和动物淀粉酶。
［4］研究表明所有α-淀粉酶均为分子量在50ku左右的单体，由经典的三个区域（A、B、C）组成：中心区域A由一个（β/α）8圆筒构成；区域B由一个小的β-折叠突出于β3和α3之间构成；而C-末端球型区域C则由一个Greek-key 基序组成，为该酶的活性部位，负责正确识别底物并与之结合。
α-淀粉酶在工业上的应用
固体发酵的优点
• SSF也有许多优于SmF的优点，包括先进的生产 能力，更简单的技术，较低的资本投资，较低的 能量需求和较少的污水排量，更好的产品回收和 不产生泡沫，另外，据报道称其是对发展中国家 最适合的方法。
淀粉酶的纯化
• 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结 晶或制剂。
• 酶的提取:使用盐溶液、酸溶液、碱溶液、有机溶剂等 • 沉淀分离:盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合
耐高温 α-淀粉酶
• 耐高温 α-淀粉酶适合于高温（105~110℃ ）下液化 淀粉, 不仅反应快,淀粉不易形成难溶性颗粒, 而且杂 质容易过滤清除, 液化淀粉一步即可完成,钙离子用量 少, 有利于糖化液精制。
• 耐高温α-淀粉酶在酒精生产的应用中，中温蒸煮、较 高温蒸煮用汽量减少30%左右， 糖化酶减少20-30u/g， 发酵质量在酒度、酸度、挥发酸、还原糖、总糖等方 面均好于高温蒸煮，甲醇含量低，原料出酒率， 淀粉 出酒率提高， 降低酒精成本。
其中耐热性淀粉酶在工业中已经大规模的使用耐高温淀粉酶耐高温淀粉酶适合亍高温105110下液化淀粉不仅反应快淀粉不易形成难溶性颗粒质容易过滤清除液化淀粉一步即可完成钙离子用量耐高温淀粉酶在酒精生产的应用中中温蒸煮较高温蒸煮用汽量减少30左右糖化酶减少2030ug収酵质量在酒度酸度挥収酸还原糖总糖等方面均好亍高温蒸煮甲醇含量低原料出酒率淀粉出酒率提高降低酒精成本
耐碱性α-淀粉酶
• 许多种微生物都能产生碱性 α-淀粉酶. 这些 α-淀粉酶的最 适反应 pH 分别在8 ~ 11的范围内, pH稳定范围也基本在 6.0~11的碱性环境中。
• 对于加酶洗涤剂, 不耐高pH值的酶种是其不能广泛应用的 限制性因素, 矛盾在于绝大多数洗涤剂配方为碱性条件下 洗涤效果好, 但此时酶活力损失大, 不能充分发挥酶助剂的 功能, 中性条件下酶活力虽然保持较高水平, 但洗涤效果差。
α淀粉酶
6制药和临床化学分析
已有报道，基于α一淀粉酶的液体稳定试剂已应用于全自动生化分析仪(CibaComingExpress)临床化学系统。
二α—淀粉酶的研究现状
1国内α一淀粉酶研究现状
1965年，我国开始应用淀粉芽孢杆菌BF一7658生产一淀粉酶，当时只有无锡酶制剂厂独家生产。1967年杭州怡糖厂实现了应用α一淀粉酶生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7％～10％，提高出糖率10％左右。1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。l979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用，取得了良好的经济效益。
2淀粉的液化作用和糖化作用
α一淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。淀粉被转化为高果糖玉米糖浆(HFCS)。由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的α一淀粉酶。α一淀粉酶在淀粉液化上的应用工艺已经相当成熟，而且有很多相关报道。
3纤维脱浆
由于α一淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。国内有代表性的研究单位有：四川大学，主要研究α一淀粉酶的生产菌株及其培养条件；江南大学，主要研究α一淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性；西北大学，主要研究α一淀粉酶的变性机理以及环境对α一淀粉酶的影响；华南理工大学，主要研究α一淀粉酶的固定化和动力性质；还有华中农业大学，中国科学院沈阳应用生态研究所，天津科技大学，南开大学生命科学学院，中国农业科学院，中国科学院微生物研究所等多家研究机构对多种α一淀粉酶生产菌的一淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。国外有代表性的研究单位有：加拿大的UniversityofBritishColumbia，他们对人胰腺的一淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦的Carlsberg实验室主要研究大麦α一淀粉酶结构域与结合位点；美国的WesternRegionalResearchCenter主要研究大麦的α一淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦α一淀粉酶的活性位点。
a-淀粉酶概述及应用
面包等焙烤食品储存一定时间后逐渐变干变硬，易碎，风味变差，这些都是 由于面包的陈化造成的，每年由于面包老化造成巨大的损失。传统的用于抑制老 化，提高焙烤食品质地和风味的添加剂主要有化学试剂，食糖，奶粉，糖酯，卵 磷脂和抗氧化剂等，近几年，酶 制剂越来越多的作为面团改良剂和抗老化剂用在 焙烤工业中，包括α-淀粉酶、分支酶、去分支酶、β-淀粉酶和普鲁兰酶等，其 中将α-淀粉酶和普鲁兰酶联合使用可以有效的延迟焙烤食品陈化，提高产品的货 价期。但是 ，在使用α-淀粉酶时，对其加入量要求比较严格，稍微过量就会导 致面包等焙烤食品粘度的增加。因此，最近人们逐渐使用中温α-淀粉酶，由于其 最适作用温度在 50℃～70℃左右，所以其在淀粉糊化时具有活性，而在焙烤过程 中则会逐渐失活，最终在焙烤完成时活性丧失。而且，在加工过程中α-淀粉酶会 水解淀粉生成聚合度在 4～9 的糊精，这些糊精也具有抗老化性。但是，现在中温 α-淀粉酶仅能从极少的一些微生物中提取[9-10]。
4.α-淀粉酶的工业应用
α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早 的商业化应用在 1984 年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。现在，α-淀粉酶已 广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业等。
4.1 在焙烤工业中的应用
各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史，最近几十年α-淀粉酶广 泛地应用于焙烤工业中焙烤工业中使用的酶制剂有很多，如蛋白酶、脂肪酶、普 鲁兰酶、木聚糖酶、纤维素酶、糖化酶等，但没有一种酶能取代α-淀粉酶在焙烤 食品中的应用。α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高 面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而 稳定的面包外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感； 延长面包心储存过程中的保鲜期。
α-淀粉酶
根据淀粉酶对淀粉的水解方式不同，可将其分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶等。
其中，α-淀粉酶（α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的α-1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。
α-淀粉酶来源广泛，主要存在发芽谷物的糊粉细胞中，当然，从微生物到高等动、植物均可分离到，是一种重要的淀粉水解酶，也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取。
不同来源的α-淀粉酶的性质有一定的区别，工业中主要应用的是真菌和细菌α-淀粉酶。
目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶。
如在淀粉加工业中，微生物α-淀粉酶已成功取代了化学降解法；在酒精工业中能显著提高出酒率。
其应用于各种工业中对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。
相对地，关于α-淀粉酶抑制剂国内外也有很多研究报道，α-淀粉酶抑制剂是糖苷水解酶的一种。
它能有效地抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，降低人体糖份吸收、降低血糖和血脂的含量，减少脂肪合成，减轻体重。
有报道表明，α-淀粉酶可以帮助改善糖尿病患者的耐糖量。
α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在1984年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。
现在，α-淀粉酶已广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业和造纸工业。
在焙烤工业中的应用：α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期在啤酒酿造中的应用：啤洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加α-淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较大的场合，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖含量，提高麦汁率，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩短了整体糊化时间。
生物化学实验
-
1
α-淀粉酶分离提纯技术研究进展
2
α-淀粉酶分离提纯的研究历史
3
α-淀粉酶的研究现状
生物化学实验
α-淀粉酶，系统名称为1,4-α-D-葡聚糖 葡聚糖水解酶，别名为液化型淀粉酶、液 化酶、α-1，4-糊精酶。黄褐色固体粉末 或黄褐色至深褐色液体，含水量5%~8%。 溶于水，不溶于乙醇或乙醚
α-淀粉酶分离提纯技术研究进展
具有反应速度快、效率高、成本低等优势
2
α-淀粉酶分离 提纯的研究历史
α-淀粉酶分离提纯的研究历史
1991年中科院北京微生物研究所孔显良等将米曲霉 (Aspergillur oryzae)突变株6-193的麦麸固体培养物，经水 浸泡其中α-淀粉酶活力为每克于曲600单位 以此来研究其性质，对其与可溶性淀粉溶液作用后的产物经 薄层色谱分析，根据扫描结果，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、 麦芽四糖分别占6.4%、32.3%、37.1%、10.9% 米曲霉α-淀粉酶作为面包添加剂比细菌α-淀粉酶耐热性低， 避免面包在制造过程中造成过度液化现象，而使生产的面包 发粘，在当时此酶是目前较理想的面包食品类的添加剂
1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄 糖工艺的研究
与传统的酸法相比可以提高收率10%，降 低成本15%以上
1967年杭州怡糖厂实现了应用α-淀粉酶 生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7%~10%， 提高出糖率10%左右
1979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺 的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风 制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用， 取得了良好的经济效益
另外我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨酸 发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、 酱油制造、醋生产等方面也已经研究成功 并投入生产
面粉中常用的酶制剂的作用机理及应用方法
（3）真菌α-淀粉酶作用淀粉产生的糊精，又对改良面包外皮色泽已有良好的效果。
3、细菌α-淀粉酶
细菌α-淀粉酶一般是耐热的枯草杆菌α-淀粉酶在作用机理上与真菌α-淀粉酶有一定的差别。同样以可溶性淀粉作底物时，真菌α-淀粉酶的水解终产物主要是麦芽糖和麦芽三糖；而细菌α-淀粉酶的终产物主要是短链糊精。两者的性质差异也很大。其最适pH值为5.0最适温度为80℃～90℃。
因此，优良的面包制造，必须添加适量的α-淀粉酶。
在面包生产中添加α-淀粉酶，使面包变得柔软，增强伸展性和保持气体的能力，容积增大，出炉后制成触感较好的面包，此外，由于α-淀粉酶作用淀粉所生成的糊精，对改良面包外皮色泽已有较好的效果。
2、真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶简称FAA,来源于米曲霉，作为传统酶制造，是第一个应用于面包制作的微生物酶，它取代了麦芽是由于麦芽中的淀粉酶含量不稳定，而且含有蛋白水解酶，真菌α-淀粉酶具有更稳定的活性而不含蛋白质酶活性，所以此酶应用十分广泛。
由于其较高的耐热性，在烘培是仍有酶活性，从而产生过多的可溶性糊精，结果使得最终制品发粘而不是和在面包中大量使用。但与真菌α-淀粉酶相比，它能产生很好的抗老化效果。而对面包的弹性和口感都优于真菌α-淀粉酶，因而小规模的使用及如何解决其耐高温而造成最终产品发粘的问题是十分重要的。
α-淀粉酶具有仿腐抗老的能力，其机理是此酶将淀粉分解生成地分子量糊精火地分子量的分支淀粉，能干涉支链淀粉的重结晶。产生的糊精会干涉面包中膨胀淀粉粒与蛋白质网络结构的相互作用，而且支链淀粉和支链淀粉中裂开的键有助于支链淀粉-脂肪复合物的形成。
面筋蛋白由麦谷蛋白和麦醇蛋白组成，面筋蛋白中的半胱氨酸是面筋的空间结构和面团形成的关键。蛋白质分子间的作用取决于二硫键－S－S－的数目和大小。二硫键可在分子内形成（麦醇蛋白），也可以在分子间形成（麦谷蛋白）
α-淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究
安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。
选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。
１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。
仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。
用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。
取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。
以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。
，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。
酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。
、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。
１．４．２酶学性质的研究。
１．４．２．１酶反应最适温度的确定。
设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。
１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。
用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。
１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。
在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。
２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。
采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。
图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。
淀粉酶的应用及研究进展
淀粉酶的应用及研究进展淀粉酶是一种能够分解淀粉类物质的酶，在多个领域具有广泛的应用。
随着科技的不断进步，淀粉酶的研究和应用也在不断深入。
本文将详细介绍淀粉酶的应用领域和研究进展，以期为相关领域的研究提供参考。
淀粉酶是一种水解酶，能够将淀粉分解成相对较小的分子，如葡萄糖、麦芽糖等。
根据酶的来源不同，可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。
其中，α-淀粉酶广泛存在于高等植物和微生物中，而β-淀粉酶则主要存在于高等植物和某些微生物中。
淀粉酶在自然界中分布广泛，扮演着重要的角色，尤其是在食品、生物制药和环境治理等领域具有广泛应用。
食品领域在食品领域中，淀粉酶主要用于制作糖浆、葡萄糖等淀粉类食品。
通过使用不同种类的淀粉酶，可以控制糖类的生成量和生成速度，从而获得所需的食品品质。
淀粉酶还可以用于改善食品的口感和外观，如用α-淀粉酶处理小麦粉可以使其变得更加松软。
在生物制药领域中，淀粉酶主要用于药物的制备和生产。
例如，β-淀粉酶可以用于制备免疫抑制剂、抗炎药等药品的有效成分。
淀粉酶还可以用于生物柴油的生产，提高生物柴油的产率和质量。
随着生物技术的不断发展，淀粉酶在生物制药领域的应用前景将更加广阔。
在环境治理领域中，淀粉酶主要用于水处理和农业废弃物的处理。
β-淀粉酶可以用于降解农业生产中的纤维素类废弃物，将其转化为可利用的糖类，从而实现农业废弃物的资源化利用。
淀粉酶还可以用于水处理中的污泥减量，提高污水处理效率。
新一代淀粉酶的研发随着科技的不断进步，新一代淀粉酶的研发工作正在不断深入。
目前，新型淀粉酶的研究主要集中在提高酶的稳定性、降低成本以及优化生产工艺等方面。
例如，通过基因工程手段，可以培育出具有更强水解能力和稳定性的淀粉酶。
利用合成生物学方法，还可以构建出更加高效的淀粉酶生产系统，为淀粉酶的应用提供更加可持续的解决方案。
除了新型淀粉酶的研发外，淀粉酶基因改造也是当前研究的热点之一。
通过基因改造手段，可以改变淀粉酶的活性、热稳定性等关键性质，从而优化其在不同领域的应用效果。
黑曲霉发酵生产α-淀粉酶微生物实验报告
黑曲霉发酵生产α-淀粉酶前言：α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。
耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。
自从日本研究者YasujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。
通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。
初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。
整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。
在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。
最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。
正文：一、实验目的1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。
2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法二、实验原理1.蒸汽系统：蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。
2.温度系统：(1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。
(2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。
(3) 发酵过程自动控温系统3.空气系统：空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。
5.在线控制系统6.进出料系统：进料口（接种口）、出料口（取样口）7.管道：包括水流通管道和气流通管道水流通：冷却用水：水经过进水管道发酵罐夹套出水口保温用水：关闭进出水管道阀门（水注满后）进入夹套气流通：蒸汽发生器蒸汽管道空气过滤器/发酵罐进入罐内空气：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐三、方法与注意事项㈠原则1.通蒸汽前先关闭所有阀门2．粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。
α-淀粉酶抑制剂的研究进展剖析
目录摘要 (1)关键词 (1)Abstract (1)Key words (1)引言 (2)1 α-淀粉酶抑制剂的介绍 (2)1.1 α-淀粉酶抑制剂的来源 (2)1.2 α-淀粉酶抑制剂的特性研究 (3)2 α-淀粉酶抑制剂的制备 (4)2.1 来源于天然植物的α-淀粉酶抑制剂 (4)2.11 豆类植物 (5)2.12 麦类植物 (5)2.13 齿苋类植物 (6)2.14 其他植物 (7)2.2 来源于微生物的α-淀粉酶抑制剂 (7)3 α-淀粉酶抑制剂的分离纯化 (8)4 α-淀粉酶抑制剂的检测方法 (9)4.1 碘比色法 (9)4.2 3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法 (9)5 α-淀粉酶抑制剂的筛选方法 (10)6 α-淀粉酶抑制剂的研究进展 (11)6.1 国内外研究概况 (11)α淀粉酶抑制剂的研究进展摘要：α-淀粉酶抑制剂是一种糖苷水解酶抑制剂。
抑制糖类消化吸收药物，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂含量，还可作为抗虫基因。
目前在医学和农业上具有广泛的用途。
本文对α-淀粉酶抑制剂的制备、检测、筛选方法、特性以及发展进行了综述，并对其前景作了展望。
关键词：α-淀粉酶抑制剂，制备，检测，筛选方法，特性Research progress of α-amylase inhibitor Abstract:α-amylase inhibitor is a kind of glycoside hydrolase inhibitor, It can be potentially use as medicines of diabetes owing to inhibiting glucose from being absorbed in the digestive tracts. Which can reduce ingestion of sugar and blood fat contet and has hypoglycemic activity, and its gene can be used as insect-resistant genes in crops breeding. There is comprehensive, application in agriculture and medicine . The preparation、detection、screening methods、characteristics and development of the α-amylase inhibitors were reviwed in this paper, and the prospects were forecasted. Key words:α-amylase inhibitor, preparation, detection, screening methods, characteristics .引言α-淀粉酶抑制剂属于糖苷酶抑制剂的一种，是一种纯天然生物活性物质，主要存在于植物种子、胚乳和微生物代谢产物中，目前在医药和农业上具有广泛的用途。
α-淀粉酶
保藏菌种
斜面活化
摇瓶种子 培养
厚层通风 发酵
种子罐扩 大培养
粗制品 沉淀 收集滤液 过滤
烘干 抽提 麸曲
离心
洗涤沉淀
风干
粉碎
精制品
α淀粉酶的发酵生产及应用
22
固体发酵缺点
限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较 受限，一般较适合于真菌。 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题， 尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针
α淀粉酶的发酵生产及应用 20
深层发酵法生产α-淀粉酶 • 停止补料后6～8小时罐温不再上升，菌体衰老， 80％形成空泡，每2～3小时取样分析一次，当酶 活不再升高，可结束发酵。而后向发酵液中添加 2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，50～55℃加热处理 30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而 易于过滤。冷却到35℃，加入硅藻土为助滤剂过 滤。滤液加2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真 空浓缩数倍后，加（NH4）2SO4盐析，盐析物加 硅藻土后压滤，滤饼于40℃烘干，磨粉而成。按 此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为70％。
α淀粉酶的发酵生产及应用
10
• 作用温度范围60~90℃，最适宜作用温度60~70， 作用pH值范围为5.5~7.0，最适pH值为6.0。 Ca2+具有一定的激活、提高淀粉酶活力的能力， 并且对其稳定性的提高也有一定效果。可催化水 解a-1,4糖苷键，但只能催化水解直链淀粉，生成 a-麦芽糖和少量葡萄糖。 • 主要存在于人的唾液和胰脏中，也存在于麦芽、 芽孢杆菌、枯草杆菌、黑曲霉和米曲霉中。可由 米曲霉、嗜酸性普鲁士蓝杆菌、淀粉液化杆菌、 地衣芽孢杆菌和枯草杆菌分别经发酵、精制、干 燥而得。 α淀粉酶的发酵生产及应用
α-淀粉酶结构
α-淀粉酶结构引言：α-淀粉酶是一种重要的酶类蛋白，广泛存在于生物体内。
它在食物消化、工业生产和医学应用等方面具有重要作用。
本文将主要介绍α-淀粉酶的结构特点和功能。
一、α-淀粉酶的基本结构：α-淀粉酶是一种酶类蛋白，它由多肽链组成，具有复杂的三维结构。
其结构特点主要包括以下几个方面：1.1 氨基酸序列：α-淀粉酶的氨基酸序列决定了其空间结构和功能。
通过测序技术可以确定α-淀粉酶的氨基酸序列，从而进一步研究其结构和功能。
1.2 二级结构：α-淀粉酶的二级结构主要包括α螺旋和β折叠。
这些二级结构的排列方式决定了α-淀粉酶的立体结构和稳定性。
1.3 三级结构：α-淀粉酶的三级结构是指其氨基酸链的空间排列方式。
它由多个不同的结构域组成，包括催化结构域、结合结构域等。
这些结构域相互作用形成具有特定功能的酶活性中心。
二、α-淀粉酶的功能：α-淀粉酶作为一种消化酶，在生物体内起着关键的作用。
它的功能主要包括以下几个方面：2.1 淀粉消化：α-淀粉酶能够将淀粉分解成糊精和糊精酶。
糊精酶进一步将糊精分解成葡萄糖，提供能量给生物体。
2.2 食物消化：α-淀粉酶在胃和小肠中发挥作用，帮助人体消化食物中的淀粉，使其转化为可供人体吸收利用的简单糖类。
2.3 工业生产：α-淀粉酶在工业生产中也有重要应用。
它可以用于酿造、制糖、制醋等过程中，促进淀粉的降解和转化，提高产品质量和产量。
2.4 医学应用：α-淀粉酶在医学上也具有一定的应用价值。
它可以用于治疗胃肠道疾病、辅助食物消化和促进营养吸收等方面。
三、α-淀粉酶的研究进展：随着科学技术的不断发展，对α-淀粉酶的研究也取得了许多重要进展。
3.1 结构解析：通过X射线晶体学和核磁共振等技术，研究人员对α-淀粉酶的结构进行了深入解析，揭示了其复杂的三维结构。
3.2 功能研究：通过对α-淀粉酶的功能及其活性中心的研究，人们对其催化机理和底物特异性有了更深入的了解。
3.3 应用拓展：近年来，研究人员还通过工程菌株和蛋白工程等手段，改造和改良α-淀粉酶，使其在工业生产和医学应用中发挥更大的作用。
α-淀粉酶最适条件
α-淀粉酶最适条件α-淀粉酶是一种重要的酶类，它在生物体内起着关键的作用。
本文将以α-淀粉酶的最适条件为主题，详细介绍α-淀粉酶的最适条件以及其在生物体内的功能。
让我们来了解一下α-淀粉酶的基本特点。
α-淀粉酶是一种能够降解淀粉的酶类，它主要存在于许多生物体中，如人体、动物和植物等。
α-淀粉酶能够将淀粉分解为较小的分子，如葡萄糖和麦芽糊精，从而提供能量和营养物质给生物体使用。
接下来，我们将介绍α-淀粉酶的最适条件。
α-淀粉酶的最适温度一般在50-60摄氏度之间。
在这个温度范围内，α-淀粉酶的活性最高，能够高效地降解淀粉。
同时，α-淀粉酶的最适pH值在5-7之间。
当环境的pH值在这个范围内时，α-淀粉酶的活性也能够得到最大化。
除了温度和pH值，α-淀粉酶的最适条件还与其他因素有关。
例如，α-淀粉酶的最适离子浓度通常在0.1-0.2摩尔/升之间。
此外，α-淀粉酶的最适条件还与底物浓度、反应时间等因素有关。
那么，为什么α-淀粉酶在这些最适条件下能够发挥最佳作用呢？这是因为温度、pH值和离子浓度等因素会影响α-淀粉酶的空间结构和电荷分布，从而影响其与底物结合和催化反应的能力。
在最适条件下，α-淀粉酶的活性中心能够充分暴露并与底物结合，从而实现高效的淀粉降解。
除了最适条件外，α-淀粉酶还受到其他因素的调控。
例如，一些离子、金属离子和辅因子等物质可以作为α-淀粉酶的辅助因子，提高其活性和稳定性。
另外，一些抑制物质或抑制因子也可以调控α-淀粉酶的活性，从而对其功能产生影响。
让我们来了解一下α-淀粉酶在生物体内的功能。
α-淀粉酶在人类和动物的消化系统中起着重要的作用，能够将进食的淀粉分解为可被吸收利用的小分子糖类。
此外，α-淀粉酶还在植物的生长和发育过程中发挥着关键的作用，能够调节植物的淀粉代谢和能量平衡。
α-淀粉酶的最适条件是50-60摄氏度的温度和pH值在5-7之间。
在这些条件下，α-淀粉酶能够发挥最佳的催化作用，降解淀粉为小分子糖类。
α-淀粉酶a
实验：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测生科2班第一组一、背景知识酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。
但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。
固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶作用下转变为产物。
固定化酶技术的优点：使酶既能与反应物接触，又易与产物分离；固定在载体上的酶可以被反复利用。
固定化酶：1、固定化酶技术即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。
2、固定化酶技术的优点：（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（2）固定在载体上的酶可以被反复利用。
（3）稳定性显著提高(热稳定性，对各种试剂的稳定性等)3、天然酶的缺点（1）天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活（2）溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本（3）反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用4.固定化酶方法固定化酶：就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
固定化的方法：对蛋白质有高度的吸附能力、有不引起蛋白质变性且能保持一定的酶活性，如：活性炭，多空玻璃，石英砂，有机硅等。
主要有以下四种，本实验所用的是第一种吸附法。
（1）吸附法物理吸附法：将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂有机载体如纤维素，无机载体如活性碳、多孔玻璃等（酶与载体形成范德华力）备注：范德华力也叫分子间力。
分子型物质能由气态转变为液态，由液态转变为固态，这说明分子间存在着相互作用力，这种作用力称为分子间力或范德华力。
分子间力有三种来源，即色散力、诱导力和取向力。
色散力是分子的瞬时偶极间的作用力，它的大小与分子的变形性等因素有关。
一般分子量愈大，分子内所含的电子数愈多，分子的变形性愈大，色散力亦愈大。
a-淀粉酶
4 医药中的应用 由于黑曲霉a-淀粉酶具有耐酸 性，故可用来制造帮助消化一类的药物，开 发适合于胃酸性环境的耐酸性a-淀粉酶，用 于制备消化助剂。 5饲料中的应用 在饲粮中添加外源a-淀粉酶可 以帮助幼龄动物消化利用淀粉，其生长性能 与饲料转化率十分有益。肉鸡日粮中添加产 a-淀粉酶的活大肠杆菌培养物可以起到抗生 素生长促进剂的作用，改善肠道形态，提高 生产性能。
a-淀粉酶的应用
1 食品工业 a-淀粉酶具有液化作用和糖化 作用，在饮料工业中常常用作甜味剂。在 冷饮中，使冷饮黏度降低，流动性增高， 保证高淀粉冷饮的口感。在面制品行业中 作为安全、高效的改良剂，可改良面包品 质。另外耐高温 a-淀粉酶作为一种新型液 化酶制剂，大量应用于发酵行业，其热稳 定性是由蛋白质本身的热稳定性决定的， 所以广泛应用于啤酒酿造和酒精工业等
收集发酵液，高速冷冻离心机离心，弃沉淀收集上清液 ↓ 硫酸铵沉淀，置于4℃下静置过夜，离心，收集沉淀 ↓ 少量醋酸缓冲液溶解沉淀，透析除盐，超滤浓缩酶液 ↓ DEAE Sepharose 离子交换层析，分管收集，测酶活将酶 活较高的各管合并，超滤浓缩 ↓ 相应的缓冲液溶解，Sephacry S-200凝胶层析，分管收集， 测酶活将最高管收集，超滤浓缩 ↓ SDS-PAGE电泳进行酶纯度检测
a-淀粉酶在30~90 ℃ 时都有活力,最适反应 温度为55 ℃ ，在40~70 ℃有较高活力， >70 ℃时活力较低。在PH 6.0~9.0 有较高 的活力，
钙离子、锰离子、钴离子对酶活有强烈激活 作用，EDTA部分抑制淀粉酶活性
a-淀粉酶的分离纯化
发酵产a-淀粉酶的过程中，发酵液中除了含有a淀粉酶外还有其他杂质，所以要对发酵液进行 目标蛋白质的提纯。 对a-淀粉酶的分离纯化 最常用的方法就是： 预处理→硫酸铵沉淀→脱盐→层析分离
α-淀粉酶(中温)使用方法及作用
α-淀粉酶（中温）使用方法及作用导读：α-淀粉酶（中温）是采用优良菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）经液体深层发酵、精制而成的高效生物制剂，广泛应用于啤酒等生产中。
产品特性淀粉酶为水解酶类，能在较高温度下随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的α-1.4葡萄糖苷键，产生可溶性糊精和少量低聚糖，使得胶状淀粉溶液的粘度迅速下降，过度水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。
酶活力单位的定义1mL液体酶，于60℃、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位，以u/mL表示。
作用条件温度： PH值：最适温度范围：70℃～75℃；最适pH范围：5.0～6.0；有效温度范围：60℃～85℃。
有效pH范围：5.0～7.0。
作用功效使淀粉液化更彻底，醪液分层更明显，色度低，缩短糊化和过滤时间，提高设备和原料利用率；可实现无麦芽糊化操作，以提高辅料比例，从而降低啤酒生产成本，改善啤酒品质，提高经济效益。
规格及标准淀粉酶为浅褐色液体制剂，酶活力≥3,000u/mL，因发酵原料、周期等因素的影响，颜色会稍有差异，但不会影响使用功效。
本产品符合国家标准GB8275-2009《食品添加剂α-淀粉酶制剂》。
本产品符合食品安全国家标准GB2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》和GB25594-2010《食品安全国家标准食品工业用酶制剂》的相关规定。
使用量在啤酒酿造过程中，使用辅料时，推荐加量为辅料干重的0.04~0.08%（即每吨辅料加入0.4~0.8L），与α-淀粉酶（耐高温）搭配使用效果更佳；然而，由于糖化原料组成及工艺参数的差异，本品的最佳添加量应通过在糖化车间中进行不同添加量的试验来确定。
如果工艺中需调整料液的pH，请在调整完成后再加入酶液。
使用安全酶制剂是蛋白质，吸入灰尘或悬浮微粒可能会产生过敏作用，导致人们产生过敏反应。
如果长时间接触某些酶，可能会刺激皮肤、眼睛和粘膜；飞溅和强烈搅动可能造成可吸入的粉尘。
a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验方案
实验：α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用背景资料一、酶酶（enzyme）催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。
绝大多数酶的化学本质是蛋白质。
具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。
1．高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；2．专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；因此在食用酵素当今在功能上，主要有四种：高浓缩SOD酵素如复方天然酵素主要用于乳腺瘤、子宫肌瘤、卵巢囊肿等肿瘤方面；长生酵素直接补脾补肾补气血，全面调理；纤体酵素专门转化脂肪减肥；肠毒清酵素则专门清理肠皱褶的毒素。
3．多样性：酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。
4．温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的，因此，纯正酵素是中性的，温和的，不存在副作用，或“好转反应”。
对于有刺激性而必然存的“好转反应”，除了本身腐败以外，也有可能有药品的添加。
5．活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。
6.易变性：大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏；7.有些酶的催化性与辅助因子有关。
酶与无机催化剂的比较但酶易受环境影响而失活，包括温度、PH值等，例如一般来说动物体内的酶最适温度在35到40℃之间，植物体内的酶最适温度在40-50℃之间；细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70℃。
动物体内的酶最适PH大多在6.5-8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.8，植物体内的酶最适PH大多在4.5-6.5之间。
另外，反应中反应产物和酶的分工和回收困难等缺点限制了酶在工业上的广泛应用。
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真菌α-淀粉酶的研究和应用16120901 20092348 王德美摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。
α-淀粉酶在现代淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制及生料酒精等行业已得到广泛的应用。
随着现代制糖工业与发酵工业的发展及其对真菌α-淀粉酶的使用需求，使得真菌α-淀粉酶在现代工业酶制剂中占有重要地位。
对真菌α-淀粉酶的研究和利用，为满足国内市场需求、调整我国酶制剂工业结构和带动相关食品或发酵行业的发展等具有重要意义。
关键词：真菌α-淀粉酶，可发酵性糖，固态发酵，冷冻沉析，食品应用1.真菌α-淀粉酶的结构及其催化机制1.1真菌α-淀粉酶的结构与大多数α-淀粉酶类似，真菌α-淀粉酶通常含有三个结构域，分别称为A、B和C。
结构域A为酶的催化反应中心区域，其典型结构为（a/b）8TIM-桶状结构，结构域B和结构域C基本上位于结构域A得到对立两端【1】。
其中，Ca2+的保守结合位点位于结构域A和结构域B之间的表面区域，而大多数情况下Ca2+的存在对于α-淀粉酶家族保持其酶活力和稳定性是必须的。
结构域B位于TIM-桶状结构域的第三个β-折叠和第三个α-螺旋之间，该区域富含不规则的β-片层结构，在不同的淀粉酶中的大小和结构差异较大，被认为与α-淀粉酶的第五特异性有关。
同时，通过定点突变或随机突变结果表明，该部位在淀粉酶中核能相对比较脆弱，与α-淀粉酶的总体稳定性关联密切，其中部分氨基酸的改变对酶的pH稳定性和热稳定性影响较为显著。
结构域C形成α-淀粉酶蛋白质羧基端，并含有α-淀粉酶家族所特有的希腊钥匙β-sandwich结构，通常认为其通过将结构域A的疏水区域与溶剂相隔离以稳定催化区域或TIM桶状结构【2】。
1.2真菌α-淀粉酶的催化机制通过X-射线晶体结构、化学修饰和定点突变等手段，表明Asp206、Glu230和Asp2973个氨基酸可能是α-淀粉酶、家族的核心催化位点【3】。
在α-淀粉酶的催化过程中，酶首先固定住异头物(α-构象)，然后通过双替换反应进行催化。
在第一个替换过程中，酶的酸性基团(Glu230)使糖苷中的氧原子质子化，并使碳和氧的链接键断裂，形成一种鎓盐转换状态，继而在第二个替换过程中由蛋白的亲质子酸性基团对糖的异头物中心进行攻击，形成β-糖基和酶复合的一种临时状态，继而底物的糖基配基离开活性位点。
2.真菌α-淀粉酶的分类在目前已报道的文献中，各种真菌来源的α-淀粉酶可以粗略的按酶学性质或作用条件将真菌α-淀粉酶分为3种类型：2.1中性真菌α-淀粉酶与细菌α-淀粉酶不同，真菌α-淀粉酶的来源相对较少，大多数真菌α-淀粉酶的作用温度和pH都比较温和，如最适作用pH在5.0~5.5之间，最适作用温度为50~55℃左右，当温度超过60℃酶开始失活。
目前商品化生产最多、应用也最为广泛的来源于米曲霉(变种)的α-淀粉酶即属于这一酶种。
2.2耐热或耐酸性真菌α-淀粉酶此类酶在pH2.5~4.5之间，作用温度在超过60℃时仍具有良好的热稳定性。
与中性真菌α-淀粉酶相比，具有耐热或耐酸性真菌α-淀粉酶可以简化液化、糖化过程，减少制糖等淀粉深加工过程中染菌几率并降低相应生产成本【4】。
这部分酶种目前工业上已经开始生产使用，且具有很大的开发利用潜力。
2.3具有生淀粉酶活力的真菌α-淀粉酶该酶除具有水解可溶性淀粉或其他糊化淀粉能力外，还具有生淀粉水解能力，在生料酒精行业的同步糖化发酵(SSF)中，与糖化酶配合使用，可以大幅度提高淀粉的利用速率和效率，并有效提高酒精产率【5】。
3.产淀粉酶的真菌的分离筛选及初步鉴定生淀粉酶能将未经蒸煮糊化的生淀粉直接转化成葡萄糖等可发酵性糖供微生物生长与代谢，其比传统的高温蒸煮糖化节约25%~30%的能耗。
因此，在生料酒精发酵、酿酒、酿造调味品以及饲料蛋白生产等领域有着巨大的应用价值。
据有关资料报道【6】，很多微生物诸如黑曲霉、根霉等真菌具有直接降解生淀粉的能力，生料发酵具有可行性，其关键是选育出生淀粉分解能力强的菌株。
朱文优等人醋曲、大曲及酿造厂附近土壤样品中，筛选出Y14、Y15、Y19、Y18和Y22等5株具有较强生淀粉分解能力的菌株，并对其进行了初步鉴定。
富集培养基为玉米淀粉40g，麸皮10g，酵母膏3g，K2HPO41g，MgSO4•7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，氯霉素0.005g，pH5.5~6.0，定容1L后灭菌。
分离培养基为玉米淀粉20g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4•7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂粉13g，氯霉素0.005g，定容1L中，pH5.5~6.0。
制备时，将除玉米淀粉以外的成分于121℃灭菌30min，冷却到45℃，红薯淀粉用甲醛熏蒸2h灭菌，再经105℃干热2h，最后两者混合。
初选培养基为玉米淀粉15g，酵母膏1.5g，K2HPO41.0g，NaNO31.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂粉13g，定容1L中，pH5.5~6.0。
制备时，将除玉米淀粉以外的成分于灭菌，冷却到45℃，玉米淀粉用甲醛熏蒸2h灭菌，再经105℃干热2h，最后两者混合。
复选培养基为麸皮12.5g，水为12.5mL，装于300mL三角瓶中灭菌进行粗酶制备时向复选培养基中接入3~4环菌株，然后置于30℃恒温培养箱中培养72h，培养期间每隔24h翻动一次。
经初步鉴定，这5株有较强生淀粉分解能力的菌株，分解能力分别为31.87%、30.04%、29.15%、23.98%和23.6%。
菌株Y14和Y18为米曲霉，菌株Y15为少根根霉，菌株Y19和Y22为黑曲霉。
上述5株真菌作为出发菌株，通过诱变育种和混株发酵研究，以期获得可工业化应用的复合生料糖化曲【7】。
4.真菌α-淀粉酶固态发酵条件研究真菌α-淀粉酶热稳定性较差，65℃以下就已失活，不会造成面团心发粘的质量问题。
因此近年来，在我国面粉生产企业中，真菌α-淀粉酶已逐步得到推广与应用，并取得了良好的经济与社会效益。
而且除了在面粉工业中的应用外，真菌α-淀粉酶在淀粉糖工业和酿造工业中也有非常广泛的用途【8】。
真菌α-淀粉酶也成为一个引人关注的高效新型工业酶种，引起了许多研究者的关注【9】。
刘仲敏等人通过对米曲霉ZLF13固态发酵生产真菌α-淀粉酶的培养基要求及发酵工艺条件进行研究，采用500L固体发酵罐进行放大试验，最终确定发酵生产真菌α-淀粉酶的培养基配比、工艺条件和工艺参数，为该酶的批量生产提供了可靠的工艺技术依据。
在完成工艺研究的基础上，又对真菌α-淀粉酶的酶学性质进行了试验研究，了解和掌握了该酶的相关酶学性质，为真菌α-淀粉酶的应用提供了参考依据【10】。
结果表明，以麸皮和适量淀粉为主要原料，添加1号复合无机盐，保持培养基水体积分数为60%～65%，控制培养温度30～34℃，发酵周期65～70h。
中试平均酶活力1283U/g。
通过对其酶学性质的研究发现，米曲霉ZLF13所产真菌α-淀粉酶最适作用温度为55℃，最适作用pH值为4.8～5.4；65℃以上迅速失活【11】。
5.真菌α-淀粉酶制剂的提纯及保存方法酶制剂作为一类重要的催化剂和添加剂,其物理性状应满足应用行业的加工工艺要求。
固态发酵生产的真菌α-淀粉酶粗制品(发酵曲)虽然在酶学作用方面可以满足相关应用行业的需要,但由于粗制品的杂质多,导致其在部分食品工业中的应用受到限制。
目前国内尚不能工业化批量生产真菌α-淀粉酶,对于该酶的分离、提纯方面所做的研究工作也甚少。
近年来，刘仲敏等人在完成了真菌α-淀粉酶高产菌株诱变选育和固态发酵工艺及酶学性质研究的基础上,开展了真菌α-淀粉酶的分离、提纯工艺研究和产品保存研究,确定了以浸提、压滤、超滤浓缩和冷冻沉析为主的工艺技术路线和工艺条件,形成了一套完整的真菌α-淀粉酶分离提取工艺技术。
并采用该工艺技术开发生产了食品级精制真菌α-淀粉酶制剂。
同时,通过试验研究,确定了食品级真菌α-淀粉酶制剂的保存方法。
通过对真菌α-淀粉酶提取工艺条件的研究和优化试验,其最佳提取工艺条件为:培养好的发酵曲采用40℃温水,pH值7.5左右,加水比为1：4,浸泡3h。
压滤滤液经超滤浓缩后,在10—15℃,pH6.0—6.5,加入食用酒精至体积分数为70%,静置过滤,40℃鼓风干燥。
采用该工艺条件,产品综合回收率稳定在70%以上,最高达到74%,产品酶活力最高达25416u/g,平均达16608u/g。
经过对精制酶保存方法的研究,确定了一种可有效保存真菌A-淀粉酶的稳定剂配方,用于精制酶的保存,半年的酶活力保存率可达到95%以上,1年的保存率达到90%以上,产品经国家轻工业食品质量监督监测郑州站检测,完全符合中华人民共和国行业标准(QB180511)1993工业用A-淀粉酶制剂)食品级要求【12】。
6.α-淀粉酶的应用由于真菌α-淀粉酶所特有的性质，如反应温度温和，作用pH偏中性等，使得真菌α-淀粉酶在实际应用中主要应用于淀粉的糖化。
与细菌α-淀粉酶相比，真菌α-淀粉酶的应用主要集中在食品应用领域。
6.1高麦芽糖浆的生产麦芽糖浆是以淀粉质为原料，经酶或酸酶结合的方法水解而成的以麦芽糖为主的糖浆，根据麦芽糖的含量不同大致可以分为饴糖(麦芽糖含量20%－30%)、高麦芽糖浆(麦芽糖含量40%－60%)、超高麦芽糖浆(麦芽糖含量大于70%)和结晶麦芽糖等。
高麦芽糖浆的甜度低而温和，可口性强，在高温和酸性条件下比较稳定，具有熬煮温度高、不易发生美拉德反应等优点。
在食品行业，对面包、糕点及烘焙食品等加工过程具有防止淀粉老化、保湿和延长保质期等作用;在蜜饯、方便食品、酱油、糖果、口服液、保健饮品、麦乳精和冷冻食品等食品行业作为营养甜味剂、填充剂得到广泛应用;在医药行业，可添加至多种中药中使用，具有润肺、补虚、止咳及治疗腰痛等作用。
此外，超高麦芽糖浆在加氢氢化后可生成麦芽糖醇。
麦芽糖醇是一种甜度与蔗糖相当而热量值较低的甜味剂，也是制备另一种功能性食品原料麦芽糖酮糖和低聚异麦芽糖的原料。
6.2焙烤制品美国和英国分别在1955年和1963年确定了真菌α-淀粉酶为一般视为安全的(GRASstatus)添加剂，并允许在面包焙制过程中使用。
目前，在全世界范围内均得到不同程度的应用。
由于中性真菌α-淀粉酶不耐热等特点，在面团发酵过程中容易通过加热使之失活，利于控制面团的发酵速度和程度，以免作用时间过长产生大量糊精以致面包心发黏。
真菌α-淀粉酶可水解面粉中的受损淀粉生成小分子糊精，通过酵母的进一步发酵产生醇类物质和二氧化碳，从而使面包体积增大。