_高分辨熔解技术常用荧光染料的SNP基因分型能力比较
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
SNPs检测方法比较
一、定义单核苷酸多态性( single nucleotide olymorphisms ,SNPs)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。
二、SNPs的研究意义遗传标记具有已知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。
基因多态与疾病相关性研究SNPs 本身对机体的影响，尤其是疾病的易感性、个性化医疗。
三、SNPs检测方法的分类1、测序方法：常规测序，Pyrosequencing（焦磷酸测序），微测序(SNaPshot)2、基于杂交的方法：Taqman 探针法，Microarray 芯片法，3、引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC（变性高效液相色谱技术）4、以构象为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE5、溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)四、各方法概述与比较测序方法1、测序方法------ 一般测序和焦磷酸测序步骤：序列比对-- 引物设计-- DNA 提取-- PCR - 割胶纯化-- 直接测序或装克隆测序。
优点：SNP 分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。
缺点：每个样本的每个位点均需要经PCR 扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。
步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测。
2、测序方法------微测序方法（SNaPshot）微测序流程：1）.设计PCR 扩增含SNPs 位点的一段DNA2）.对PCR 产物进行纯化（去除引物和dNTP)3）.引物延伸4）.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）优势：类似普通测序，但10 个位点PCR 产物同时引物延伸，通量增加。
劣势：前处理等同普通测序：每个样品的每个位通过点都需要PCR预先扩增，跑胶，割胶，DNA 纯化。
不同是10 个位点可以同时测序，提高了测序效率，但对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6 个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。
高分辨率溶解曲线分析
高分辨率溶解曲线分析概述高分辨率溶解曲线分析是一种广泛应用于生物学领域的分析技术，特别适用于检测基因表达、基因多态性、SNP位点以及DNA结构等。
该技术通过对双链DNA在不同温度下的解离曲线进行测定和分析，可以用来定量评估样品中特定序列的数量和质量。
原理高分辨率溶解曲线分析的原理基于PCR扩增反应后的DNA解离动力学。
在PCR扩增过程中，双链DNA会在高温下解开成两条单链DNA。
随后，在降温过程中，两条单链DNA会重新结合形成双链DNA。
在这个过程中，如果样品中存在特定的序列差异（如基因多态性或SNP位点），它们的解离和结合过程会发生略微的差异，这些差异可以通过溶解曲线分析来检测和分析。
溶解曲线分析一般通过添加DNA染料（如SYBR Green）来实现，该染料可与DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应后，样品中的DNA会逐渐增加，溶解荧光信号也会随之增强。
在降温过程中，不同的PCR产物的解离过程会导致荧光信号发生变化。
通过监测溶解曲线上的荧光信号强度，可以得到不同PCR产物的解离温度，进而从中推断样品中的目标序列的数量和质量。
实验步骤高分辨率溶解曲线分析通常包含以下几个步骤：1.PCR扩增反应：根据需要扩增的目标序列设计引物，并进行PCR扩增反应。
PCR反应体系中添加SYBR Green或其他DNA染料。
2.热变性：PCR扩增反应后，将样品在高温下进行变性，通常为95°C。
3.降温：将样品温度降低到特定的温度范围，通常为60-95°C，并持续监测荧光信号的强度。
4.溶解曲线分析：根据荧光信号强度和温度的变化关系，绘制溶解曲线图。
通过比较样品中特定序列的解离温度，可以评估目标序列的数量和质量。
5.数据分析：根据溶解曲线图，可以使用特定的软件或算法对数据进行定量分析。
常见的分析方法包括计算解离温度、判断PCR产物的品质以及定量评估样品中的目标序列含量。
应用高分辨率溶解曲线分析在生物学研究中有广泛的应用。
高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法
高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法背景：DNA的发夹结构作为自身探针扩增用于PCR产物的分子分析。
在这之前实体分离或共价修饰的寡核苷酸荧光是必须的。
方法：我们用饱和染料LC Green做不对称PCR，40-45个循环，其中1条引物的5’端包括了一条尾巴，这条尾巴和其延伸引物互补，但这尾巴没有任何特别的共价修饰。
样品可以在LightsCycler的转子中快速的扩增，可以在96/384 模块加热PCR仪中进行高通量的扩增。
除了扩增扩增子的双链，通过引物尾巴的“弹回”及其延伸引物的杂交形成单链发夹结构。
在HR-1（毛细管）或Lightscanner（96/384孔板）上运行高分辨率熔解曲线。
结果：用弹回引物扩增的PCR产物在低温处显示两个发夹结构熔解峰，在高温处显示全部扩增子的熔解峰。
发夹结构的熔解温度与其长度（6-28bp）是线性相关，与环的大小成负相关。
我们可以轻松的将杂合突变和纯合突变进行基因分型。
用弹回探针对100个未知基因型的临床样本的F5 1691G>A进行基因分型，与之前的分型结果一致。
我们用2条弹回引物做不对称PCR，分析CFTR基因外显子10的2个范围，通过稀释产物形成分子内部杂合子进行基因分型，分出7种不同的基因型。
结论：弹回引物结合饱和染料基因分型的方法在闭管体系中，只用2条引物便可以提供一条特异的探针，此探针没有特殊的共价修饰。
在分子诊断学中，DNA的发夹结构是非常有用的工具，包括stem-loop探针和self-probing扩增。
stem-loop探针通常叫做“分子信标”，是一段共价修饰的核苷酸，一端末尾是荧光基团，另一端末尾是淬火剂。
self-probing扩增用于弹回单链构想多态性（SSCP）和蝎子引物。
弹回单链构想多态性SSCP逐渐用于在PCR产物中人工引入二级结构进行SSCP分析。
依赖于扩增序列，与引物尾巴互补的8-11bp序列弹回至其延伸产物上，形成了单链发夹结构，虽然弹回SSCP的引物没有共价修饰，电泳已经足够分离发夹结构。
高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料
高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料郭心灵;尤崇革【摘要】高分辨率熔解曲线技术(HRM)是近年来发展迅速的一项用于基因突变扫描与检测的新技术.由于具备快速、简便、价廉、高通量和闭管均相检测等优点,HRM已被广泛地应用于突变基因的扫描、基因分型、遗传配型以及法医学鉴定等领域,并受到越来越多的关注且发展迅速.本文就该技术常规应用时的相关仪器与荧光染料的发展及应用进行分析总结.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)001【总页数】4页(P50-53)【关键词】高分辨率熔解曲线技术;聚合酶链反应;荧光染料;PCR仪【作者】郭心灵;尤崇革【作者单位】兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030;兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030【正文语种】中文高分辨率熔解曲线技术（high resolution melting，HRM）是美国Utah大学Wittwer实验室在2003年首次提出的基于新型饱和荧光染料LC Green的发明而进行基因突变检测的新技术[1]。
其基本原理就是利用与荧光染料结合的双链DNA 在温度升高的过程中会发生减色效应的物理性质，通过检测双链DNA在熔解过程中释放的染料荧光信号所形成的特征熔解曲线，进行PCR产物中核苷酸差异的鉴别。
该技术的应用不仅需要饱和荧光染料，而且更需要能进行高分辨检测的定量PCR仪。
近年来用于HRM技术的仪器和染料都在不断更新，朝着操作简便化、试剂专业化的方向发展，在常规检测、疾病诊断、实验室研究、前沿问题研究等方面发挥着重要作用[2,3]。
目前HRM技术可用于基因突变扫描、遗传配型、细菌分型和多重基因分型等领域[4,5]。
本文就HRM技术的常规开展所需要的相关仪器与荧光染料进行综述。
1 HRM仪器常规定量PCR仪由于温控不够灵敏、分辨率不够高及其熔解曲线无法区分熔解温度上差异很小的序列（如单核苷酸多态性、单碱基插入/缺失等），所以不能用于HRM分析。
高分辨熔解技术常用荧光染料的SNP基因分型能力比较
高分辨熔解技术常用荧光染料的SNP基因分型能力比较尤崇革;李晓军;郜莉娜;李菲菲【摘要】目的评价LC Green、Syto 9和Eva Green 3种高分辨熔解(HRM)染料对单核苷酸多态性(SNP)基因分型的能力.方法以肿瘤坏死因子(TNF)基因启动子-857 C ＞T(rs1799724)位点为例,分别用上述3种荧光染料进行PCR-HRM检测,依据特征熔解曲线进行基因分型并测序验证.基因分型能力评价以野生型与纯合突变型PCR产物Tm值之差(△Tm)来表示.结果PCR-HRM检测到4种特征熔解曲线,经测序后发现第4条为双突变杂合,包含-863C＞A(rs1800630)位点.HRM染料LC Green,Syto 9,EVa Green的基因分型能力分别为(0.52±0.030)℃、(0.51±0.066)℃和(0.39±0.152)℃.其中Syto 9野生型(CC)和突变型(TT)的变异系数(CV)均为0.03％,为3种染料中最低.结论3种染料均能用于HRM技术进行SNP基因分型,Syto 9和LC Green分辨率优于Eva Green,其中Syto 9易用性最好、Eva Green性价比最高.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2011(029)008【总页数】3页(P575-577)【关键词】LC Green;Syto 9;Eva Green;高分辨熔解技术;单核苷酸多态性【作者】尤崇革;李晓军;郜莉娜;李菲菲【作者单位】南京军区南京总医院解放军临床检验医学研究所,南京210002;兰州大学第二医院中心实验室,兰州730030;南京军区南京总医院解放军临床检验医学研究所,南京210002;兰州大学第二医院中心实验室,兰州730030;兰州大学第二医院中心实验室,兰州730030【正文语种】中文【中图分类】Q75单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)作为第三代遗传标记被广泛用于疾病基因组学和药物基因组学以及分子诊断研究。
high resolution melting analysis -回复
high resolution melting analysis -回复什么是高分辨融解分析（High Resolution Melting Analysis, HRM）？高分辨融解分析（High Resolution Melting Analysis, HRM）是一种基于DNA的分析技术，用于检测DNA中的序列差异，如突变、多态性等。
它是一种快速、灵敏且经济高效的方法，通常用于基因突变筛查、SNP检测、基因分型等应用。
HRM利用DNA的特性，通过热反应中DNA双链解旋和再结合过程中的温度变化，来测定样品中的DNA序列。
这个过程涉及到将DNA样品在逐渐升高的温度下加热，随后监测染料的强度变化。
在整个过程中，DNA 会在特定融点温度下解旋形成单链DNA，再在高温下结合成双链DNA。
在温度梯度中，样品中的DNA序列相异点（突变、多态性等）会导致其在特定温度下有所不同的解旋和结合行为，从而导致曲线的形态和位置产生变化。
HRM的原理和步骤是什么？在HRM的实验中，需要进行一系列样品预处理、PCR扩增和融解分析。
首先，需要从样品中提取DNA，并对DNA进行质量和浓度的测定。
合适的DNA浓度对于反应的准确性和可靠性至关重要。
其次，进行PCR扩增反应。
在PCR反应中，根据待测序列的特点，选择适当的引物对DNA进行扩增，以增加待测序列（突变、SNP等）的相对丰度。
PCR反应中的温度梯度逐渐升高，使DNA经历一系列变性和重结合过程。
然后，在PCR扩增结束后，立即开始融解分析阶段。
在这个阶段，通过逐渐升高的温度，从低到高，融解PCR产物中的DNA双链结构。
同时，使用特定染料（通常是SYBR Green）来标记DNA，在特定温度下监测染料的荧光强度变化。
根据不同样本的DNA序列差异，特定的融点曲线形态和位置将发生变化。
通过分析融点曲线的形状、峰的位置和强度，可以判断样品中的DNA序列是否存在突变等差异。
HRM的优点和应用领域是什么?HRM具有以下几个优点：1. 高灵敏度和特异性：HRM可以检测到DNA序列中极小的差异，并能够区分相同长度但不同序列的DNA。
SNP分型技术简介
SNP分型技术简介
PCR- RFLP
由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出现，从 而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长度出现差 异，这种因内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异， 称限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP）。
SNP分型技术简介
等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
SNP分型技术简介
TaqMan 技术
原理：
TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告基团在探针的 5’末端，淬灭基团在3’末端。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探 针。PCR扩增时，探针酶切降解，报告基团和淬灭基团分离， 发出荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成， 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会影响其释放荧光 的强度，可以通过检测反应液中的荧光强度确定基因型
SNP分型技术简介
包括单个碱基的转换、 颠换、插入和缺失等 转换：同型碱基之间 A-G 腺嘌呤-鸟嘌呤 T-C 胸腺嘧啶-胞嘧啶 颠换：嘌呤与嘧啶之间 A-T、A-C、C-G、G-T
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SNP分型技术简介
人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可 能与SNP有关。 心脏病、癌症、糖尿病、精神病等复杂性疾病是遗传 和环境综合作用的结果。目前，发现这些多基因疾病 微效基因最有力的方法是对病例组和对照组等位基因 频率进行统计学比较，SNP是这种分析很好的一种标 记。
SNP分型技术简介
SNP分型技术简介
SNP分型技术简介
SNP分型技术简介
SNP分型技术简介
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。
它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。
HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。
在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。
然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。
同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。
当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。
而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。
根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。
HRM技术具有多个优点。
首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。
其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。
此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。
HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。
例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。
在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。
在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。
尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。
高分辨熔解技术在疾病关联SNP验证检测中的应用。
剂 盒 Ｑｕｃ Ｇｅ ｅ ｉ ｋ ｎ ＤＮＡ ｗｈ ｌ ｂｏ ｄｋｔ （ ｏｅ ｌｏ ｉ Ｓ 日本 Ｆ — ｕ
ｊｉ ｉｌ ｆ ｍ公 司） Ｐａｉｕ Ｔ ｑＤ ， ｌ ｎ ｍ ａ ＮＡ 聚合 酶 （ 国 ｌ— ｔ 美 ｎ ｖｔ ｇ ｎ公 司） Ｌ Ｇ ｅ ｎｐｕ 染 料 （ 国 Ｉ ａ ｏ公 ｉｏ ｅ ｒ ， Ｃ ｒｅ ｌｓ 美 ｄｈ
是 一 种 适 合 疾 病 关联 Ｓ ＮＰ验 证 和 临床 分子 诊 断 的 高通 量 、 成本 、 低 易操 作 、 闭管 均 相 检 测 新 方 法 。
关 键 词 ： 分 辨 熔 解 ； 核 计 酸 多 态 性 （ ＮＰ ； 因分 型 ； 光 染 料 高 单 Ｓ ）基 荧 中 图 分 类 号 ： ３ ４３ 文 献 标 志 码 ： Ｒ ９ — Ａ 文 章 编 号 ：６ 卜７ １ （Ｏ ２ ０ 一 １ －４ １７ ４ ４ ２ １ ） ２Ｏ ９０
关联 基 因验 证 和 临床 分 子诊 断 。高 分 辨熔 解 技 术
（ ｉｈｒｓ ｌｔ ｎｍｅｔ ｇ ＨＲＭ ） 诞 生 为 这 一 科 ｈｇ ｅ ｏｕ ｉ ｌｎ ， ｏ ｉ 的
室 一４ ℃贮 藏 的 临 床 确诊 类 风 湿 性关 节 炎 （ｈ ｕ Ｏ ｒｅ 一 ｍａｏｄａｔｒ ｉ， Ａ） 院患 者 血样 （ 橼 酸 钠 抗 ｔｉ ｒｈｉ ｓ Ｒ 住 ｔ 枸 凝 ）０ １ ０份 ， 患者 均知情 同意 ， 研究 经 兰州 大 学第 本
ｄ ｉ ｌ ． ９ ９ ｉｉｓ ． ７ — ４ ４ ２ ｌ 。 ２ ０ ６ ｏ ： Ｏ ３ ６ ／ ．ｓｎ １ １７ ｌ ． ０ ２ ０ ． ０ ６
Ａｐｐ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｉ ｈ Ｒ ｅ ｏ ｕ ｉ ｎ Ｍ ｅ ｔｎｇ ｉ ｌｄ ｔｏ ｌｃ ｔｏ ｆ Ｈ ｇ ｓ ｌ ｔｏ ｌｉ ｎ Ｖａ ｉ ａ ｉ ｎ
HRM应用实验设计及结果分析
HRM分析过程
原始曲线 随着DNA熔解，插入 DNA双链中的染料被 释放，荧光信号骤降
对PCR的扩增子进行加热，温度 从50℃逐渐上升到95℃。扩增子逐 渐解链，到达熔解温度（Tm）时， DNA双链完全分开。
初期，荧光强度很高，随着温度 升高，双链DNA逐渐减少，荧光强 度下降。通过检测器，记录荧光变 化的过程。对数据作图，就生成了 熔解曲线 。
三、反应体系
Component Diluent (Mol. Biol. Grade water) PCR Buffer MgCl2 dNTPs Forward primer Reverse primer SYTO®9 EvaGreen Taq DNA polymerase DNA Template Concentration 1X 1.5 mM 0.2 mM 300 nM 300 nM 1.5 µM 1-2X 1.25 U 3 x 109 copies/µL
扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突 变，就会改变DNA链的解链温度。 解链温度差异极小，零点几摄氏度，使用高分辨率的仪器才可以检测。
孔间温度差异（温度均一性：Tm的标准偏差为0.020-0.264℃），孔间温度均一性要达到 0.264 ℃以内才能保证HRM分析结果的准确性。大多数Real Time PCR仪的孔间温度差在 0.3-0.5℃，决定了无法胜任HRM 熔解速率（最低要求：0.1℃/秒） 数据密度（最低要求：10个数据点/℃）
导数图 “速率”曲线的最高 峰是分离速率最大的 点，即等于熔解温度
HRM应用主要基于两种技术的 进步：
• •
双链DNA嵌入型饱和荧光染料如 LC Green 具有精确控温装置和高密度数据 采集的仪器
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution melting curve）是一种广泛应用于基因分型、突变检测和SNP分析等领域的检测技术。
其基本原理是利用荧光染料与DNA双链结合，随着温度的升高，DNA双链会逐渐解旋，导致荧光强度的变化。
通过检测荧光信号的变化，可以获得一条关于温度的曲线，称为溶解曲线。
高分辨率溶解曲线分析的优势在于其高灵敏度和高分辨率。
它可以快速、准确地检测出不同DNA序列之间的差异，甚至能够区分相似度达到99.99%的DNA序列。
这使得高分辨率溶解曲线成为一种非常重要的基因分型和突变检测技术。
高分辨率溶解曲线的操作相对简单，通常包括以下几个步骤：1.样品准备：从生物样本中提取DNA，并进行纯化和扩增，以获得足够的DNA量。
2. PCR扩增：选择适当的引物，进行PCR反应，扩增目标DNA片段。
3.荧光染料加入：在PCR反应结束时，将荧光染料加入PCR体系中。
荧光染料可以与双链DNA结合，从而产生荧光信号。
4.温度梯度扫描：利用PCR仪器进行温度梯度扫描。
通过逐渐升高温度，将DNA片段逐渐解旋，并观察荧光信号的变化。
5.数据分析：通过对荧光信号进行分析，可以得到一条溶解曲线。
根据曲线的形状和荧光峰值的位置，可以判断样品中的DNA序列。
高分辨率溶解曲线的分析可以被广泛应用于许多领域，例如基因分型、突变检测、SNP分析等。
在基因分型中，通过对多个基因位点的高分辨率溶解曲线进行分析，可以确定个体的基因型。
在突变检测中，溶解曲线的形状和荧光峰值的位置可以指示是否存在DNA序列的突变。
而SNP分析则是通过溶解曲线的变化来检测单核苷酸多态性。
除了上述应用之外，高分辨率溶解曲线还可以被用于测定DNA的荧光特性和结构特点。
通过观察溶解曲线的形状和荧光峰值的位置，可以获得DNA的熔解温度、熔解曲线宽度等信息，进而了解DNA序列的稳定性和结构特点。
总之，高分辨率溶解曲线是一种重要的基因分型和突变检测技术。
高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术
高分辨率熔解曲线分析：一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术李东至【摘要】@@ 目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorplaism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性一高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质.【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》【年(卷),期】2011(003)002【总页数】3页(P1-3)【作者】李东至【作者单位】广州市妇女儿童医疗中心,产前诊断中心,广东,广州,510623【正文语种】中文目前，DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测方法有2种：一是针对特定的位点合成序列特异性探针，如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等，用于检测已知突变；二是以核酸的物理性质为基础的检测方法，如变性-高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等，此类方法可用作突变筛查，但无法明确突变性质。
这2种方法在应用上有其局限性，如成本高、操作繁琐、耗时、以及相对低通量。
DNA测序是突变／SNP检测的金标准，但不适于大规模突变筛查和流行病学研究。
2002年犹他大学和爱德华科技公司合作开发出突变／SNP检测分析的一项新技术—高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting，HRM）［1］。
这种技术不受突变碱基位点与类型的限制，可同时对扩增片段进行未知突变扫描和已知突变的基因分型。
因其操作简便、快速、高通量、低成本和真正实现了闭管操作而受到普遍的关注，成为近年来兴起的一种高通量突变扫描和基因分型技术。
常用法医学SNPs分型技术对比及应用
常用法医学SNPs分型技术对比及应用
陈丽伟;刘长晖;刘超
【期刊名称】《中山大学学报：医学科学版》
【年(卷),期】2008(0)S2
【摘要】本文就目前国内外法医学领域常用的SNPs分型技术:等位基因特异性杂交、引物延伸技术、寡核苷酸连接检测及寡核苷酸探针侵袭切割反应技术的原理、反应条件和实验步骤及其优缺点进行了对比综述报道。
【总页数】3页(P149-151)
【关键词】单核苷酸多态性(SNPs);降解DNA;法医DNA分型
【作者】陈丽伟;刘长晖;刘超
【作者单位】中山大学中山医学院法医学系;广州市刑事科学技术研究所
【正文语种】中文
【中图分类】D919
【相关文献】
1.核酸快速提取、等温扩增、多重靶标检测、高通量SNP分型等关键技术的研究与应用 [J], 府伟灵
2.31个SNP位点多重PCR扩增和芯片分型技术的建立及其法医学应用 [J], 李莉;李荣宇;李成涛;柳燕;林源;阙庭志;孙美倩;李瑶
3.SNP分型方法及在法医学等领域的应用 [J], 郭宏;畅晶晶;李莉
4.高分辨熔解技术常用荧光染料的SNP基因分型能力比较 [J], 尤崇革;李晓军;郜莉娜;李菲菲
5.SNP分型检测技术及其在畜禽遗传和育种中的应用研究进展 [J], 宋玉朴;孙永峰;冯自强;周宇轩;张磊;李晟毅;闫晓敏;许云鹏
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文章编号：1001-764X（2011）08-575-03·临床检验技术研究·高分辨熔解技术常用荧光染料的SNP基因分型能力比较*尤崇革1，2，李晓军1，郜莉娜2，李菲菲2（1．南京军区南京总医院解放军临床检验医学研究所，南京210002；2．兰州大学第二医院中心实验室，兰州730030）摘要：目的评价LC Green、Syto9和Eva Green3种高分辨熔解（HRM）染料对单核苷酸多态性（SNP）基因分型的能力。
方法以肿瘤坏死因子（TNF）基因启动子-857C＞T（rs1799724）位点为例，分别用上述3种荧光染料进行PCR-HRM检测，依据特征熔解曲线进行基因分型并测序验证。
基因分型能力评价以野生型与纯合突变型PCR产物Tm值之差（△Tm）来表示。
结果PCR-HRM检测到4种特征熔解曲线，经测序后发现第4条为双突变杂合，包含-863C＞A（rs1800630）位点。
HRM染料LC Green，Syto9，EVa Green的基因分型能力分别为（0．52ʃ0．030）ħ、（0．51ʃ0．066）ħ和（0．39ʃ0．152）ħ。
其中Syto9野生型（CC）和突变型（TT）的变异系数（CV）均为0．03%，为3种染料中最低。
结论3种染料均能用于HRM技术进行SNP基因分型，Syto9和LC Green分辨率优于Eva Green，其中Syto9易用性最好、Eva Green性价比最高。
关键词：LC Green；Syto9；Eva Green；高分辨熔解技术；单核苷酸多态性中图分类号：Q75文献标志码：AComparison of common fluorescent dyes for SNP genotyping in HRM technologyYOU Chong-ge1，2，LI Xiao-jun1，Gao Li-na2，Li Fei-fei2（1．Institute of Clinical Laboratory Medicine，PLA，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Nanjing210002，Jiangsu；2．Central Laboratory，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou730030，Gansu，China）Abstract：Objective To evaluate the capability of three high-resolution melting（HRM）dyes including LC Green，Syto9and Eva Green applied in HRM technology for single nucleotide polymorphism（SNP）genotyping．Methods TNF promoter-857C＞T （rs1799724）was selected to evaluate the above three fluorescent dyes and their capabilities for SNP genotyping in HRM analysis were determined on the basis of the differences of Tm value of PCR products between wild type and homozygous mutant type．Results Four kinds of characteristic HRM curves were observed and the PCR products of the four melting curves were sequenced．The fourth melting curve was verified to be a dual-heterozygote which contained another SNP of TNF promoter-863C＞A（rs1800630）besides-857C＞T．The Tm value of resolution for SNP genotyping by LC Green，Syto9and Eva Green dyes were（0．52ʃ0．030）ħ，（0．51ʃ0．066）ħand（0．39ʃ0．152）ħrespectively．In the three HRM dyes，Syto9showed the lowest coefficients of variation0．03%in both wild-type and mutant type．Conclusion All the three fluorescent dyes can be applied to HRM technology for SNP genotyping．Syto9and LC Green are better than Eva Green in detecting resolution while Syto9is the best ease-of-use dye and Eva Green is the highest cost-effective dye．Key words：LC Green；Syto9；Eva Green；high resolution melting；single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性（single nucleotide polymor-phisms，SNPs）作为第三代遗传标记被广泛用于疾病基因组学和药物基因组学以及分子诊断研究。
尽管作为经典技术的PCR-RFLP（polymerase chain reac-tion-restriction fragment of length polymorphism）和荧光标记探针法常被用于SNP分型，但前者的操作繁琐、易污染、灵敏度低和后者的成本昂贵使全基因组关联分析（genome-wide association studies，GWAS）的后续病例-对照研究工作困难重重。
2003年Wittwer 等［1］首次报道了用新型饱和荧光染料LC Green进行基因分型的高分辨熔解技术（high resolution melt-ing，HRM）；随后HRM功能qPCR仪（如rotor-gene 6000）也开发成功，加之新型荧光染料Syto9和Eva Green的出现使HRM技术成为基因突变筛查的新秀［2］。
然而这些染料基本都是商品化的Master Mix，影响因素较多。
本研究以自制PCR-HRM反应体系评价这3种荧光染料的SNP基因分型能力及其影响因素。
*基金项目：中国博士后科学基金资助项目（20080430239）。
作者简介：尤崇革，1968年生，男，主任技师，博士，研究方向为基因组学与分子诊断。
通信作者：李晓军，主任技师，E-mail：lixiaojun62@yahoo．com．cn。
1材料与方法1．1标本来源收集来自兰州大学第二医院中心实验室－40ħ保存的类风湿关节炎（rheumatoid ar-thritis，RA）患者全血样本（枸橼酸钠抗凝）100份，其中女性80例，男性20例，年龄12 76岁，均为临床确诊的RA住院患者。
1．2主要试剂与仪器全血基因组DNA提取试剂盒和QuickGene-Mini80核酸提取仪（日本Fujifilm公司），Eva Green染料（美国Biotium公司），Syto9染料和Platinum Taq DNA聚合酶（美国Invitrogen公司），LC Green染料（美国Idaho公司）。
Rotor-Gene 6000PCR仪（澳大利亚Corbett Research公司），Nano-drop2000微量蛋白核酸检测仪（美国Thermal scientific 公司），2F-258全自动凝胶成像系统（上海嘉鹏公司）。
1．3基因组DNA提取用QuickGene试剂盒柱提法提取。
取全血标本200μL，用裂解液裂解红细胞、白细胞后，经与其配套的QuickGene-Mini80核酸提取仪提取，通过正压使DNA与柱滤膜吸附，洗液洗涤3次后用200μL洗脱液洗脱基因组DNA，并分装于－40ħ保存。
用Nanodrop微量蛋白核酸检测仪进行浓度和纯度检测，3g/L琼脂糖凝胶电泳检测核酸完整性，PCR扩增鉴定其模板有效性。
1．4引物设计与合成以TNF基因启动子-857C ＞T（rs1799724）SNP位点为例，通过Pubmed-SNP 检索到其侧翼序列，用在线软件Primer3（http：// frodo．wi．mit．edu/primer3）进行引物设计。
上游：5'-AGACCTCTGGGGAGATGTGA-3'，下游：5'-CGTC CCCTGTATTCCATACC-3'，扩增片段长度为159bp；通过UCSC-PCR（http：//genome．ucsc．edu）验证其特异性后由南京金斯特公司合成，引物浓度调整到20μmol/L，于－40ħ保存。
1．5PCR-HRM检测反应总体系为15μL，包括30ng模板基因组DNA1μL，10ˑPCR buffer1．5μL，Platinum Taq DNA聚合酶（5U/μL）0．05μL，10mmol/L dNTP0．3μL，10μmol/L上、下游引物各0．45μL，1ˑLC Green/Syto9/Eva Green各1．5μL，1．5μL的MgCl2（其相应浓度分别为25/15/25 mmol/L），加灭菌重蒸馏水至15μL。
扩增条件：95ħ预变性2min，94ħ10s，60ħ30s，共40个循环；随后进行HRM分析，参数为96ħ30s，50ħ30s。
熔解曲线数据收集从83ħ到90ħ，温度上升率为0．05ħ/s。
依据熔解曲线峰型改变进行基因分型，各型选取2例送上海生工公司测序验证。
1．6基因分型能力评价3种HRM荧光染料的基因分型能力以野生型与纯合突变型PCR产物熔解曲线的熔解温度（Tm）值之差（△Tm）表示，△Tm数值越大则突变型与野生型熔解曲线峰差异越明显，基因分型越容易；其变异系数（CV）越小则同型样本熔解曲线峰的漂移越小，标准化曲线拟合越均一，软件自动分型率越高。
检测经测序验证的TNF启动子双SNP位点4种基因型标本（批内重复12次）并基因分型，记录每条熔解曲线的Tm值。