重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
蛋白质的分离纯化(1)
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
蛋白质分离纯化
2. 3 等电聚焦
依据：在pH梯度中的平衡位置。
用两性电解质，多乙烯多胺与丙烯酸的同系多异构体 混合物。在电场作用下，形成连续平滑的pH梯度， 而酶样品在其中也形成相同的等电点pH梯度。 分辩率高，pI相差0.01 pH的酶与蛋白质可分离 。
注意：在pI附近蛋白质容易沉淀，影响分离的数量和 质量。
1 蛋白质的分离方法
（1）以大小或质量为依据： 离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、
Bio-Gel交联聚丙烯酰胺）、透析、超过滤
（2）以电荷为依据： 离子交换色谱（低离子强度、适当pH） DEAE-
Sephadex、 CM- Sephadex、 DEAE-纤维素、CM-纤维 素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）、纤维素粉末、 淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置）
（3）以溶解度变化为依据
3.1 盐析--改变pH(等电点沉淀法) 3.2 盐析--改变离子强度 3.3 PEG沉淀法
3.1 改变pH (等电点沉淀法)
调整pH至酶的等电点。
原理： 溶解度随分子引力加大而减小，其他条
件相同，当pH在等电点附近时,分子引力最大， 蛋白质就沉淀。
一般不单独使用，配合其他方法使用。
3.2 改变离子强度
• 盐溶现象：加入离子有助于分散大分子上 所带的电荷而使溶解度提高。
• 盐析：离子强度提高到超过某一数值，带 电分子将会沉淀下来。
1. 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质 的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐 析。 2. 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 3. 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 4. 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究
论文分类号 Q816单 位 代 码 10183密 级 公开研究生学号**********吉林大学硕士学位论文重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究The conditions on purification and lyophylization ofrecombinant proteins作者姓名：王俪波专业：生物化学与分子生物学导师姓名王丽颖及职称：教授学位类别：理学硕士论文起止年月：2006年9月至2008年6月重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究吉林大学王俪波吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI 系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。
□博士学科专业：生物化学与分子生物学论文题目：重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：吉林省长春市吉林大学白求恩医学院分子生物学教研室 130021作者联系电话：135****4493作者姓名 王俪波 论文分类号 Q816保密级别 公开研究生学号 2006712039学位类别 理学硕士授予学位单位 吉 林 大 学专业名称生物化学与分子生物学培养单位（院、所、中心）白求恩医学院研究方向基因工程及疾病的分子免疫学研究学习时间2006年9月至2008年6月论文中文题目 重组蛋白的纯化工艺及冻干条件研究论文英文题目 The conditions on purification and lyophylization ofrecombinant proteins关键词(3-8个)重组蛋白、纯化、活性、冷冻干燥姓 名 王丽颖职称 教授导师情况学历学位 博士工作单位吉林大学论文提交日期 20 年 月 日 答辩日期20 年 月 日 是否基金资助项目 否 基金类别及编号如已经出版，请填写以下内容出版地（城市名、省名）出版者（机构）名称出版日期 出版者地址（包括邮编）提要纯化和冷冻干燥是重组蛋白质生产中的两种关键工艺。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定在生物医学领域中，重组蛋白质凭借其广泛的应用前景成为了研究热点。
然而，要想获得高纯度的重组蛋白质，并对其结构进行准确的鉴定，需要经历一系列复杂而细致的实验步骤。
本文将从表达、纯化和结构鉴定三个方面介绍重组蛋白质的研究过程。
一、表达重组蛋白质的表达是研究重组蛋白质最初的关键步骤之一。
通常采用大肠杆菌（Escherichia coli）作为表达宿主。
首先，需要将目标基因克隆至表达载体中，确保其与启动子、转录因子等相互配合，并携带一定的标签，如His 标签、GST 标签等。
接着，将修饰好的表达载体转化至大肠杆菌中，采用选择性培养基筛选出目标菌株。
最后，将筛选得到的菌株进行大规模培养，促使目标基因在细胞内表达。
二、纯化获得表达目标蛋白的菌株后，需要将蛋白从细胞中纯化出来。
首先，采用超声波或高压颠破细胞壁，释放出蛋白质。
接着，通过离心等手段将蛋白质与其他细胞组分分离。
此时，可以利用目标蛋白质特异性的亲和层析柱，如镍柱、葡聚糖柱等，吸附目标蛋白质，并通过逆向洗脱等方法，得到高纯度的目标蛋白质。
三、结构鉴定获得纯度较高的重组蛋白质后，需要对其结构进行进一步的鉴定。
常用的结构鉴定方法包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）、电子显微镜等。
X射线晶体学是目前应用最广泛的方法，通过将蛋白质结晶并进行X射线衍射实验，得到蛋白质的高分辨率结构。
NMR则通过测量蛋白质中核自旋的相对位置和相互作用关系，获取蛋白质的三维结构信息。
电子显微镜是一种能够获得蛋白质高分辨率结构的技术，主要应用于研究大分子复合物和纤维形态的蛋白质。
除了上述常用技术外，近年来还涌现出一些新的结构鉴定方法，如质谱联用技术、光学显微镜成像、负染电镜等。
这些方法的出现，为蛋白质结构鉴定提供了更多的选择和便利。
由于篇幅所限，本文仅对重组蛋白质的表达、纯化和结构鉴定进行了简要介绍。
事实上，研究重组蛋白质的过程还包括目标基因的设计与合成、蛋白质的功能分析等环节。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必需在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
重组蛋白分离与纯化技术 ppt!!!
影响盐析的因素
1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般 可在室温中进行。
2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最 低。
周质蛋白质浓缩
收集菌体，重溶细胞沉淀于 30mM Tris-HCl pH8.0 20%的蔗糖中。加入EDTA, pH8.0（终浓度 为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分 钟。
离心收集细胞，去除上清液。 加入预冷的5mM MgSO4 中彻底重溶沉淀，在冰上
缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓 冲液中。 收集上清以备活性分析
注意： 处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、 超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎
蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐 浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此
称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不 同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
蛋白质技术专题
重组蛋白分离与纯化技术
Mcstone
重组蛋白的富集
原核表达（pET载体）
诱导时间 诱导体积（溶氧量） 温度 IPTG用量 转速
酵母表达
温度 时间
分泌蛋白质浓缩
指溶质 从半透 膜的一 侧透过淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐 析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。
蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常 数。
蛋白质分离纯化的目的
毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
巴 斯 德 毕 赤 酵 母 （Pichia pastoris）是 在 酿 酒 酵 母 表达体系的基础上， 用其他的酵母菌株构建的、可 高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养
型 酵 母 （Methy-lotrophicyeast）表 达 系 统 [1]。 作 为 第 2 代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统 不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌 到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥 补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、表 达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具 有 其 他 酵 母 表 达 系 统 无 法 比 拟 的 优 越 之 处[2]。
亲 和 层 析 （Affinity Chromatography，AFC）是 利 用
2009 年第 3 期
高炳淼等：毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
35
偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附 目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。 它具 有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要 一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的 混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持 较 高 的 活 性[15]，是 分 离 纯 化 以 及 分 析 生 物 大 分 子 尤 其 是 蛋 白 质 的 有 力 工 具 。 自 从 1967 年 Axen 等[16]用 溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法成功 制 备 了 固 定 化 酶 ，此 后 亲 和 层 析 在 20 世 纪 70 年 代 有了迅速的发展，目前已得到广泛应用。
2 主要纯化的方法
重组蛋白的分离纯化与传统方式相似，也是利 用其物理和化学性质的差异，即分子的大小、形状、 溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和 性 等 性 质 建 立 起 来 的 （表 1）[7]。 从 表 1 可 看 出 ，高 纯 度的蛋白质主要是依靠色谱法技术得到的。 由于重 组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存 在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成 的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离 出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一 套综合的分离程序，以获得较高纯度的蛋白产品。
重组蛋白纯化基本策略
重组蛋白纯化基本策略捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。
中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。
分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。
总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。
处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。
如上样体积、浓度等。
速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。
回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。
样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。
第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。
2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。
3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。
4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。
重组蛋白分离纯化的方法策略及案例介绍
肽配体结合为基础。同时，带有 GST 的蛋白与配体结合是可逆的，能够在温和，非变性的条件下通过加入还原型 谷胱甘肽被洗脱下来。
材料 BL21 感受态细胞 PGEX 表达载体 LB 培养基 Amp（氨苄青霉素） IPTG 蛋白酶抑制剂 缓冲液 1（100mmol/L Tris，PH 8.5，500mmol/L NaCl） 缓冲液 2（100mmol/L NaAc，PH 4.5，500mmol/L NaCl） PBS 缓冲液（100mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4） 洗脱缓冲液（50mmol/L Tris，PH 8.0,10mmol/L GSH） 微量紫外分光光度计 超声波破碎仪 高速冷冻离心机 GST 柱
由上表可知选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可避免破碎细胞的步骤，而且细胞外和周质空间内的 蛋白种类较少，目的蛋白易纯化；而在细胞质内表达重组蛋白时，重组蛋白通常是可溶性表达，但也易形成包涵体。 可溶性蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离且纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白质却变得相当困 难，通常需要对聚集的蛋白进行变，复性，而通常情况下活性蛋白的得率比较低。德泰生物凭借多年的蛋白表达服 务操作经验和相关的技术，可以提供可溶性重组蛋白保证型服务和更高纯度的上清蛋白。
分离纯化原则总结： 1 应尽可能利用蛋白质不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同技术多次纯化； 2 不同的蛋白在性质上有很大区别，每一步纯化步骤都应当充分利用目的蛋白和杂质成分物理性质差异； 3 在纯化早期阶段要尽量减少处理体积，方便后续纯化； 4 在纯化后期阶段，再使用造价高的纯化方法，有利于纯化材料的重复使用，减少再生复杂性。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March分离纯化蛋白质的方法及原理（一）利用分子大小1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：如何加快透析过程（1）加大浓度差，及时更换透析液（2）利用磁力搅拌器常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。
而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来（二）利用溶解度差别4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。
5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析（三）根据电荷不同6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。
电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。
所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。
重组蛋白亲和层析方法
重组蛋白亲和层析方法重组蛋白亲和层析方法（Recombinant Protein Affinity Chromatography）引言：重组蛋白是一种在基因重组技术的帮助下人工合成的蛋白质。
在过去的几十年中，重组蛋白已成为生物科学研究的重要工具，用于诊断、治疗和基因工程等领域。
而亲和层析是一种常用的分离纯化蛋白质的方法。
在重组蛋白纯化过程中，亲和层析常常被用于分离特定的重组蛋白，并以高纯度进行后续研究。
原理：重组蛋白亲和层析的原理依赖于蛋白质与其特异性结合物质之间的亲和力。
一般来说，亲和层析主要分为两个步骤：亲和树脂的制备和重组蛋白的分离纯化。
亲和树脂的制备通常包括两个关键步骤：首先，树脂选择。
树脂的选择应基于目标蛋白的特异性结合，通常是通过蛋白质与特定分子的化学键合实现。
其次，树脂修饰。
进行化学修饰可以调整树脂表面的性质，提高亲和层析的选择性和纯度。
常用的树脂包括：亲和树脂（如青蛋白树脂、GSH-Sepharose 树脂等）、离子交换树脂（如阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等）和柔性多色树脂（如 GST树脂等）。
亲和树脂的制备后，开始进行蛋白的分离纯化。
这一步骤通常涉及到样品预处理、样品加载、非特异性结合物的洗脱和目标蛋白的洗脱。
样品预处理有时需要去除杂质、浓缩样品以及调整pH和离子强度等。
样品加载是将样品加载到亲和树脂上，通过和树脂上的结合物发生亲和作用而保留目标蛋白质。
非特异性结合物的洗脱可以采用缓冲溶液的洗脱，使其与树脂脱离。
目标蛋白的洗脱可以通过减少亲和性配对或者改变条件，从而使其与亲和树脂解离。
优势：重组蛋白亲和层析是一种高选择性和高效的纯化方法。
相比于其他方法，它具有以下优势：1. 高纯度：由于亲和层析是一种特异结合的方法，因此可以非常有效地分离纯化目标蛋白，得到高纯度的蛋白样品。
2. 高产量：使用亲和层析可以在一次操作中纯化大量目标蛋白，从而提高蛋白的产量。
3. 高效性：亲和树脂具有高结合容量，可以吸附大量目标蛋白，从而在短时间内完成蛋白的分离纯化。
重组蛋白的表达与分离纯化
基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。
先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。
然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。
表达蛋白可经SDS-PAGE检测。
实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。
单元四：重组蛋白的分离纯化及检测
实验报告题目:单元四:重组蛋白的分离纯化及检测指导老师:王磊日期:2013/11/7-201311/9一．实验目的：1、学习亲和层析的原理；2、掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作；3、了解和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；4、掌握SDS-PAGE分离蛋白质组分的操作方法；5、了解Western blotting的原理及其意义，掌握Western blotting的操作方法；6、应用Western blotting 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上的重组蛋白。
二．实验原理：(1)亲和层析：以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。
蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。
已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。
过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。
在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。
金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。
本实验用IPTG诱导表达的蛋白质GFPuv是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：由丙稀酰胺单体（acrylamide)和交联试剂N，N’－甲叉双丙稀酰胺（N,N-methylene bisacrylamide)在催化剂存在的情况下聚合而成的三维网状结构的凝胶，改变单体的浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径大小的凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：①化学聚合－催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），通常控制这两种溶液的用量使聚合在1h内完成；②光聚合－催化剂：核黄素，通过控制光照时间和强度可控制聚合时间。
重组蛋白分离纯化的流程
重组蛋白分离纯化的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!重组蛋白分离纯化是生物技术领域中的一项重要技术，主要用于获取高纯度的目标蛋白质。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。
盐析法的特点是成本低,不需要特别设备，操作简单、安全,对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少,缺点是选择性不强。
1.2 有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，降低水的活度，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。
其特点是：选择性高；其次，沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发即可除去。
但是有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用，因而常常需在低温下进行操作。
1.3 等电点沉淀法其原理是通过调节溶液的pH值，使两性电解质在溶液pH值处于等电点时，分子表面净电为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，两性电解质的溶解度下降，从而沉淀析出。
1.4 变性沉淀法利用生物大分子物质对物理、化学等外部环境因子敏感性的差异而选择性地使一种组分发生变性形成沉淀，而另一些组分保持不变，从而达到分离、除杂和提纯的目的。
此方法包括：热变性沉淀分离；酸碱变性沉淀分离；利用表面活性剂或有机溶剂引起变性沉淀分离；利用酶进行变性分离。
2 液液萃取技术液液萃取技术是常用分离技术之一，在生物化工中也有广泛的应用。
然而，大部分生物物质是有生物活性的，需要在低温或室温条件下进行分离纯化，而采用传统萃取技术无法完成。
双水相萃取技术是近年来发展很快的一种生物分离方法，与传统的液液分离方法相比，双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势：蛋白质在其中不易变性；分相时间短，一般只需5～15 min ；易于放大和进行连续性操作；萃取环境温和，生物相容性高；聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等[3]。
近年来一些学者将双水相萃取技术与膜分离技术结合起来，较好地解决了生物大分子在两相界面的吸附和乳化作用并且加快了萃取速率。
还有一些学者利用亲和反应的高度专一性，在萃取剂上接上一定的亲和配基，使得双水相萃取体系不仅具有处理量大的特点，而且具有专一性，提高了萃取效率。
液液反胶团(Reversed Micelles ,RM) 体系萃取技术是90 年代以来发展较快的另一种萃取技术, 是依赖表活剂液液萃取技术的一个分支 [4]。
反胶团是离子型表面活性剂分散在非极性溶液中形成的,由表活剂的极性头向内形成一个围绕“水核”的纳米级微团[5]。
在这微团中由于表活剂极性头的保护，可使包溶的的蛋白质不易变性。
此外反胶团萃取体系还具有操作条件温和，对目标蛋白选择性好，容量大和易于扩大再生产的优点。
当然反胶团体系萃取技术也有其不足之处，以往采用单一表活剂AOT 或季氨盐的反胶团萃取体系易受溶液pH、温度、离子强度和离子种类等因素的影响。
目前为了克服这些缺点，往往在反胶团体系中加其它表活剂作助剂或者采用阴、阳和非离子复合型表活剂的反胶团体系的方法来解决[6]。
3 层析法3.1 离子交换层析原理是用离子交换剂作为吸附剂，将溶液中的离子依靠静电引力吸附在吸附剂上，同时从吸附剂上置换出另一种离子，然后用适当的溶液将吸附物从吸附剂上置换下来，进行浓缩富集，从而达到分离的目的。
其吸附作用来自离子间的静电作用。
蛋白质为两性物质，不同的pH，所带的电荷也不同。
不同的pH和不同的离子强度下，蛋白质在不同的离子交换树脂上的吸附程度也不同。
如果能够选择适当的条件，对蛋白质的分离纯化能起到事半功倍的效果。
多数蛋白对酸碱不太稳定，因此对蛋白来说多用弱离子交换树脂。
有一类特殊的商品化离子交换树脂，Sigma产品目录上成为聚缓冲液交换剂。
先用某一pH缓冲液平衡聚缓冲液交换剂，再用另一pH缓冲液平衡，就能在这种离子交换剂上建立一个pH梯度。
上样后，用一种具有pH梯度的聚缓冲液洗脱树脂时，被吸附样品中的蛋白质就能按照他们的等电点次序被依次洗脱。
在这个过程中，同时产生聚焦作用，致使个蛋白质分级变得很窄，样品高度浓缩，整个分离过程也呈现出很高的分辨率，称为层析聚焦技术[7]。
3.2 疏水层析蛋白质内部有疏水部分，蛋白质表面常存在非极性氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸）形成疏水区、蛋白质的疏水程度取决于暴露的或埋藏的氨基酸的疏水性之和。
疏水性氨基酸的数目、疏水性及他们的分布形成了蛋白质的特性。
不同的蛋白质分子的疏水性强弱有较大差异。
疏水层析就是利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质分离纯化的方法。
在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，暴露出疏水部位，疏水性相互作用增大。
故蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度（离子强度）的提高而增大。
因此，疏水层析中蛋白质的吸附需在高浓度盐溶液中进行，而洗脱则主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。
由于疏水层析分析纯化蛋白质的原理与离子交换层析完全不同，因此疏水层析与离子交换层析互补短长，用于离子交换层析难以分离的蛋白。
周维国等人以Octyl Sepharose 4 Fast Flow为层析介质分离硫酸铵分步沉淀法制备的重组蛋白MSH-Ang粗纯化样品，,回收率达85%,重组蛋白MSH-Ang纯度达65%以上[8]。
3.3 反相层析反相层析利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性（疏水性）的差别进行蛋白质的分离纯化。
与疏水层析相似，反相层析中溶质也是通过疏水性相互作用分配于固定相表面。
但是反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性，必须采用极性有机溶剂（如甲醇、乙腈等）或水溶液进行溶质的洗脱分离，多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。
反相层析主要用于相对分子量较小的蛋白质的分离纯化。
其中运用最广泛的是反相液相色谱。
Boyes等报道了用连续 RPLC 对细菌原液中的重组人淀粉状蛋白前体多肽片段进行分离[9]。
3.4 亲和层析许多生物活性物质具有与其他某些物质可逆结合的性质，生物物质的这种结合能力成为亲和力。
生物亲和力具有高度的特异性，即一种生物物质只能与另一种特定的物质结合。
亲和层析是将有亲和力吸附作用的物质分子（配基）偶联在固体介质（载体）上作为固定相，用以分离纯化目的蛋白的方法。
亲和层析具有高度的选择性、分辨率和载量优的特点，只需要一步处理便可从一个混杂有多种高浓度无关蛋白质的复杂材料中纯化出少量的目的蛋白，纯化系数可达数千倍，回收率很高，并且对纯化物有浓缩效果，是分离纯化蛋白质的有力工具。
根据配体与生物大分子之间相互作用体系的不同，可以把亲和层析分为以下四种类型。
3.4.1.生物亲和层析利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。
典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。
陈嫚用交联琼脂糖为载体,三聚氯氰为活化剂,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基,制备亲和填料，再用此亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体( reteplase，r-PA )，得到高纯度的r-PA[10]。
林敏等将编码有一个血吸虫谷胱甘肽S转移酶(GST)基因的pGEX表达载体与重组基因进行融合表达,其表达产物易为GSTrapTM亲和层析柱中的GST单体特异性吸附,洗脱,浓缩后经5%NaHCO3特殊处理而获得高纯度的重组融合蛋白[11]。
GST柱具有纯化条件温和、蛋白回收率高的优点,但它的非特异性吸附过高,如对纯度要求不高时,可作为较好的选择。
3.4.2.免疫亲和层析利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析。
许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体。
目前,利用抗体-抗原模式,有可能得到每一种目标蛋白的单抗,然后以单抗为配基,通过亲和层析技术分离纯化重组蛋白。
此种方法的纯化倍数、活性回收率非常高。
FLAG融合标签是由八个氨基酸(AspTyrLysAspAspAspAspLys)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的免疫吸附纯化。
利用FLAG融合标签可以建立一个基于融合多肽的高效检测和纯化系统。
FLAG标签结构短小,且与融合蛋白质之间含有一个肠激酶切割位点,可以通过肠激酶切割被除去。
现已发展出了M1、M2和M5三种抗-FLAG单克隆抗体,FLAG融合抗原标签技术已经广泛用于重组蛋白质的纯化[12]。
陈登鸿就用单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素[13]。
3.4.3.固定化金属离子亲和层析利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。
目的蛋白质表面裸露的供电子氨基酸残基,如组氨酸的咪唑基,半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基,十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合。