现代生物技术育种

（四）原生质体的培养
固体培养法（平板培养法）
Nagata 和 Takebe 采用1mm薄层固体培养基培养烟草 有利于定点观察单个原生质体的胞壁再生
浅层液体培养法
Kameya 1972年 用3-4ml培养液培养胡萝卜原生质体
双层培养法
Maletzki（1973 ）甘蔗和李文安（1979）黄花烟草培养 成功
拟 南
（三）原生质体的纯化
芥
（四）原生质体的培养
原
生
质
体
（二）原生质体的分离方法
机械分离法
高渗糖溶液预处理，原生质体收缩，机械破碎 Klercker 1982 分离藻类原生质体 可避免酶制剂对原生质体的破坏，但完整率不
高且仅对高度液泡化细胞适用
酶解分离法
Cocking 1960 常用：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、胼胝
生物技术应用于作物育种，可以解决传统育种的 一些特殊困难，扩大育种的基因来源，提高鉴定和选 择的可靠性，加快育种进程，加速繁殖，提高育种效 率等，对于解决新世纪人口与食物问题，以及生物能 源问题，具有十分重要意义。
现代生物技术发展简况
50年代：Watson & Click 发现 DNA双螺旋结 构，揭开生物遗传学分子结构和遗传信息之秘。
植物组织培养概况及其在园林 植物育种中的应用
1902 Haberlandt “植物细胞全能性”的提出 1904 Hanning 离体培养萝卜和辣根菜获得成功 1933 李继㣚发现3mm大小的银杏胚可以在离体培
养下正常生长
1934 White建立番茄根尖的无性系，获得突破，发 现了B族维生素和生长素的作用
奖） ，他完成了φ X 噬菌体 DNA 的全测序。
自 70 年代末以来，基因工程发展迅速。 1980 年，Kemp 和 Hall 将大豆种子的贮藏蛋白基因引入向日 葵中，得到“向日豆”（ sunbean ）。
Wilmut 研究小组继克隆羊多莉之后，将人的 AAT 蛋白基 因导入绵羊体内，使羊奶中含有人的 AAT 蛋白一头这样的 转基因羊，获得 50 万英镑。
70年代：DNA重组技术取得成功，细胞融合技 术、生物反应技术(生物反应器)取得突破性发 展，带来了一场深远的生物技术革命。
90年代：基因工程和分子生物技术取得了大批 应用成果——转基因植物及动物、基因工程药 物等。
1962 年，Arber 发现大肠杆菌对外 来侵入的 DNA 有限制作用，这是 由于菌体内有一种酶，对外来的 DNA 起切割、分解的作用，从而 预言DNA限制性内切酶的存在。
1966 年Weiss 和 Richardson 发现 了DNA 连接酶。
1968 年，Smith 分离出第一个内切 酶。
1971 年， Nathans 应用Smith 的内 切酶切割 SV-40 病毒的 DNA ，获 得了第一个 DNA 的内切图谱（通 称“物理图谱” physical map）。
输 通过组织培养提供生物技术育种的中间材料
(1)选择生长健壮的3cm～6cm 长的新芽作外植体。
(2)用消了毒的利刃将新芽从从 母体切下。
第三节 植物原生质体培养和细胞融合
一 、原生质体培养
原生质体（Protoplast）：指采用机械或酶解法 去掉细胞壁的裸露细胞 。
（一）原生质体的分离
（二）原生质体的分离方法
第八章 现代生物技术育种
主要内容
第一节 生物技术应用于育种的必要性 第二节 组织培养 第三节 植物原生质体培养和细胞融合 第四节 基因工程 第五节 分子标记及其在育种中的应用
第一节 生物技术应用于育种的必要 性
（一）生物技术的概念
以生命科学为基础，利用生物体的特性和 功能，设计、构建、培育具有预期性状的新物 种、新品种、新品系，以及与工程原理相结合， 进行加工生产，为社会提供商品和服务的综合 技术体系。
40-50年代，Skoog等人发现CTK可以控制芽分化 1958 Reinert和Steward分别报道胡萝卜愈伤组织-体
细胞胚-完整植株
经过40年的发展，园林植物育种中发展出：
利用茎尖等培养技术进行快繁和工厂化育苗 利用茎尖微芽培养获得无病毒植株 结合细胞和组织培养进行突变体的诱导和筛选 利用花药与花粉培养进行单倍体育种 利用胚乳培养获得三倍体植株 利用胚胎培养和体细胞杂交等克服远缘杂交障碍 利用离体培养进行种质资源的长期培养和远距离运
（二）生物技术应用于育种的必要性
➢人类二十一世纪面临的三大问题： 世界人口不断增加、石化能源的日趋枯竭、环境 污染的加剧
➢传统育种方法存在局限 ➢生物技术的创造性 • 打破自然生殖隔离，生物可共享一个基因库 • 有目的地进行基因重组，克服不良连锁 • 有效克服环境影响，选择更可靠
（三）生物技术在育种中应用的意义
第二节 组织培养
概念 是指在无菌条件下，将离体的植物材料培养于人工 培养基上，并给以适当的培养条件，使之形成完整 植株或生产出具有一定经济价值的生物产品的一种 技术。
内容及范畴 植株培养、茎尖培养、胚培养、胚珠和子房培养、 花药与花粉培养、离体器官培养、胚乳培养、细胞 培养、原生质体培养、离体授粉受精
质酶、EA3-867（上海植物生化所复合酶）
（三）原生质体的纯化
1、过滤-离心法
44-169μm的筛网去除大的组织碎片和残渣 900-4500r/min，2min，收集沉淀 简单，但沉积造成挤压易导致原生质体破碎
2、漂浮法
采用比原生质体比重大的高渗溶液，离心后去除下层残渣
3、界面法
采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面 之中
197百度文库 年的诺贝尔医学奖
1972 年，伯格（ Berg ）等人用这两种酶成功地进行了λ-噬 菌体与 SV-40 病毒 DNA 的体外拼接。 1977 年，基因工程正式宣布成功——吉尔伯特（ Gilbert ） 分别将编码胰岛素和干扰素（这是两种有用的药物）的 DNA 经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成 了胰岛素和干扰素。 1978 年的诺贝尔化学奖（其中吉尔伯特的获奖主要是因为 DNA 测序方法的研究）。同时获奖的还有桑格 Sanger（2度获