蛋白表达纯化实验步骤

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重组蛋白质的表达与纯化

重组蛋白质的表达与纯化

重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中,使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。

这项技术应用广泛,被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。

下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。

一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。

常用的表达宿主包括大肠杆菌(E. coli)、酵母(yeast)、哺乳动物细胞等。

不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。

例如,大肠杆菌是最常用的表达宿主之一,具有高表达水平、易操作、成本低等特点。

2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。

常用的表达载体有质粒、病毒载体等。

质粒是最常用的表达载体,它可轻松被细菌胞内扩增,并在细胞内产生大量目标蛋白。

3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中,实现转染。

转染有多种方法,如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。

转染后,宿主细胞会开始表达目标基因,合成目标蛋白。

4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度,需要对表达条件进行优化。

常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。

二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起,需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。

细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。

分离方法包括离心、电泳、柱层析等。

2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一,它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。

常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。

3.其他纯化方法除了柱层析外,还有许多其他的纯化方法可供选择。

例如,凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。

这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质,以获得纯度更高的重组蛋白质。

三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛,涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。

例如,通过重组蛋白质技术,可以生产用于治疗疾病的药物,如人胰岛素、白介素等。

蛋白质的表达纯化

蛋白质的表达纯化

完全紧贴。)正常安装则会形成一个密闭的容
器。
蛋白质的表达纯化
5.将底座的开关打开, 并向外拨动透明的架子, 使中间空隙增大,放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压(约1~2mm),使底面 完全接触。
蛋白质的表达纯化
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内,加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
• 3. 细胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流 出液。
• 4.洗脱杂蛋白:用50mL洗涤缓冲液UWB以10-15mL/h流速洗柱, 分别取10ul洗涤开始与结束时的样品用于SDS-PAGE 分析。
• 5.洗脱目标蛋白:用10mL洗脱缓冲液洗柱,每管0.5-1 mL, 共收集6-10管,分别取1蛋0白u质l样的表品达纯用化于SDS-PAGE 分析。
蛋白质的表达纯化
实验步骤
• 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 • 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌
BL21菌株于5mL LB液体培养基中 (含100ug/mL 氨苄 青霉素),37℃震荡培养过夜。 • 2. 转接1mL过夜培养物于100mL(含100ug/mL 氨苄青霉 素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600 = 0.6 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 • 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. • 4. 12,000rpm 离心10 min, 弃上清,菌体沉淀保存于20℃或-70℃冰箱中。
蛋白质的表达纯化
• 3.制浓缩胶:按所需的浓度配制4%的浓缩胶,配
方如下:
30%Arc- Tris-HCl H2O
Bis

蛋白表达纯化的实验原理

蛋白表达纯化的实验原理

蛋白表达纯化的实验原理蛋白表达与纯化是生物学实验中常用的技术,可以用来研究和生产各种蛋白质。

本文将一步一步回答关于蛋白表达纯化实验的原理和步骤。

第一步:蛋白表达系统的选择蛋白表达系统是指用来制备和表达目标蛋白质的细胞或病毒载体。

常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。

选择表达系统时需要考虑目标蛋白的性质、需求量和表达效率等因素。

第二步:构建表达载体表达载体是将目标蛋白的基因序列插入到细胞或病毒载体中,以实现蛋白表达的工具。

通常采用的方法是将目标基因通过限制性内切酶切割,然后与适当的载体连接。

第三步:细胞转染或感染将构建好的表达载体转染到细胞中,使目标蛋白基因在细胞内进行表达。

对于真核细胞(如哺乳动物细胞)可以通过转染的方式传递质粒DNA,而对于原核细胞(如大肠杆菌)可以通过热激转化或电穿孔等方法进行具体的转染。

第四步:培养表达细胞转染或感染后,需要将细胞培养到合适的条件下,以促进目标蛋白表达。

培养条件包括适宜的培养基、温度、氧气供应和营养物等。

此外,可以考虑添加特定的诱导剂或抑制剂,以调控蛋白表达的级别。

对于细菌目标蛋白表达,通常将细胞培养在含有抗生素的培养基上以选择表达带有目标基因的细菌。

第五步:蛋白表达检测为了确定目标蛋白是否在细胞中表达,可以使用多种方法进行检测。

常用的方法包括Western blot、ELISA、原位杂交、荧光染色等。

同时,可以通过调整培养条件或表达载体的构建来提高蛋白表达的水平。

第六步:蛋白纯化蛋白纯化是从表达系统中提取和纯化目标蛋白的过程。

纯化步骤的选择取决于目标蛋白的性质和所需的纯度。

常见的纯化方法包括亲和纯化、凝胶过滤、离子交换、大小排除层析、亲水性层析等。

此外,还可以使用亲和标签(如His标签、GST标签等)来辅助蛋白质的纯化。

第七步:蛋白质的鉴定和定量通过蛋白纯化后,需要对目标蛋白进行鉴定和定量。

可以使用SDS-PAGE、Western blot、质谱分析等方法来确定蛋白质的分子量和纯度。

MBP 蛋白纯化

MBP 蛋白纯化

1 诱导
预表达
5mlLB+100μL菌,37℃摇到OD=0.4~0.6(约2到3小时);
加IPTG(1M IPTG一般2.5μL,可多设几个浓度);
取样0h,2h,4h,6h,过夜;每次1ml
离心菌液,加20μL loading,沸水煮,跑胶检测
大量表达后菌液处理
12000rpm,2min,4℃,收集菌体;
CB洗1~2两次,10000 rpm,2min,4℃,
加CB重悬(100ML菌液一般2ML,可根据自己菌的多少和所需蛋白的浓度改变);
然后超声或者冻融:
10000 rpm,20min,4℃,上清就是你要的啦(如果是第一次做可留一点检测上清中是否有你的蛋白,不要全部纯化啦)
MBP 蛋白纯化
一、溶液:
CB (Column buffer):50ml
配方:
1M Tris-HCl pH 7.4 1ml
NaCl 0.585g
0.5M EDTA 100ul
Elution buffer:
50ml CB + 0.158g麦芽糖
二、纯化步骤
1、200ul beads 短离心,弃上清(15s)
2、用1ml CB 重悬,洗两次10000rpm
3、重悬在200ul CB中
4、加入200ul 粗提蛋白(上清)
5、4℃混匀60min,离心1min,弃上清
6、用1ml CB 重悬洗一次。

7、加入elution buffer,4℃混匀30 min
8、离心1min,取上清。

9、重复1次。

三、回收beads
1、水3倍体积
2、0.1% SDS 3倍体积
3、水1倍体积
4、CB 3倍体积
保存在20% 乙醇,4℃.。

简述蛋白质表达的主要操作流程

简述蛋白质表达的主要操作流程

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His标签蛋白纯化实验步骤

His标签蛋白纯化实验步骤

His标签蛋白纯化实验通过实验,学习和了解 His-Tag 融合蛋白的表达、纯化原理和方法,掌握相关仪器设备的操作使用。

一、实验原理金属螯合离子亲和色谱(IMAC)是常见的亲和纯化方案之一,主要利用介质配体螯合的金属离子吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。

His-tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性。

Ni IDA Beads 可以用于各种表达来源(如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞)的组氨酸标签(6xHis-tagged)蛋白的纯化。

它是以 4%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联了三配位的亚氨基二乙酸(IDA),螯合镍离子(Ni )后,可以形成比较稳定的平面四边形结构,从而有更多的位点与组氨酸标签上的咪唑环继续配位,达到结合目的蛋白的效果(产品化学结构见图 1.1 所示)。

二、实验准备试剂菌种、LB 培养基、氨卞青霉素、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、His-Tag 蛋白纯化试剂盒实验仪器和设备移液器、恒温振荡箱、超声破碎仪、离心机、紫外检测仪、冰箱三、实验步骤第一步、菌体制备1、取 2 支 4ml LB 培养基试管,超净台中操作。

每管加入 4ul 菌种,4ul 氨卞青霉素。

放入 37 度恒温振荡箱 180rpm,过夜培养,16 小时。

2、将菌种加入 800ml LB 培养基,800ul 氨卞青霉素,放入 37 度恒温振荡箱 180rpm培养 4 小时,OD600 约 0.6-0.8。

3、加入 IPTG 800ul,放入 37 度恒温振荡箱 180rpm 培养 4 小时。

4、离心 8000rpm 离心 10min 收集菌体,-80 度保存菌体。

第二步、菌体破碎1、将菌体取出,加入 50ml Lysis Buffer 磁力搅拌悬浮,待无明显块状即可。

2、超声 4s 停 6s,36°保护温度,超声 30min。

3、将破碎好的裂解液离心取上清(11000rpm ,20min ,4℃),准备上样。

目的蛋白表达与纯化protocol

目的蛋白表达与纯化protocol

目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试:1、挑一单克隆到3ml LB(含抗生素)中,370C,220rpm振荡培养10h~12h。

2、保种:700μl菌液+400μl 80%灭菌甘油,充分混匀后置于-800C保存。

3、扩大培养:以1:100接菌,即取50μl菌液到5ml LB(含抗生素)中,370C,220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。

4、对照取样:取1ml菌液,12000rpm离心1min,弃尽上清,-200C保存。

对照5、另取1ml菌液于一新的试管中,加1/1000 IPTG(终浓度为1mM),370C,220rpm振荡培养3h后收菌:12000rpm离心1min,弃尽上清,-200C保存。

370C样品6、其余约3ml菌液于160C,220rpm继续振荡培养1h后,加0.5/1000 IPTG(终浓度为0.5mM),160C,220rpm振荡培养12~24h(通常18h)后收菌:12000rpm 离心1min,弃尽上清,-200C保存。

160C样品7、Bugbuster分别处理上述三个样品,取20μl总蛋白,其余离心后分离上清和沉淀,进行SDS-PAGE电泳鉴定,上样顺序为:对照370C样品160C样品总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀若目的蛋白在上清中有表达,则可以进行大量表达与纯化,具体操作如下。

大量表达:1、挑一单克隆到7.5ml LB(含抗生素)中,370C,220rpm振荡培养10h~12h。

注意:此步用50ml离心管摇菌!2、扩大培养:以1:100接菌,即取将上述7.5ml菌液全部接到750ml TB(含抗生素)中,370C,220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。

3、对照取样:取1ml菌液,12000rpm离心1min,弃尽上清,-200C保存。

(对照)4、其余约菌液于160C,220rpm继续振荡培养1h后,加0.5/1000 IPTG(终浓度为0.5mM),160C,220rpm振荡培养12~24h(通常18h)后收菌:6000rpm、40C离心10min,弃尽上清,取一点沉淀做表达鉴定(160C样品),其余-200C 保存。

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分,对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。

蛋白质纯化是一个关键步骤,可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质,并去除杂质。

下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。

一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前,首先需要准备样品。

样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。

样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度,避免蛋白质的降解和杂质的污染。

二、离心将样品进行离心,以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。

离心过程中,可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件,如转速、离心时间等。

三、初步分离将离心后的上清液取出,进行初步分离。

可以采用一些常用的分离技术,如离子交换色谱、凝胶过滤等。

这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离,从而使目标蛋白质得到部分纯化。

四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术,通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。

亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等,可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。

五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术,通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移,根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。

凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质,同时也可以用于纯化蛋白质。

六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术,通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析,实现蛋白质的分离和纯化。

柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂,如离子交换柱、凝胶过滤柱等。

七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术,通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。

透析可以用于去除一些小分子杂质,如盐类、小分子药物等。

八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术,通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。

常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等,可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。

九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后,需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。

蛋白纯化CSM-昆虫细胞中蛋白表达与纯化

蛋白纯化CSM-昆虫细胞中蛋白表达与纯化

14.2 His 标签蛋白表达纯化1、把His 标签蛋白表达质粒,进行转化,转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中,冰上放置30min,加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h,然后涂板,于37℃培养箱中进行过夜培养。

2、第二天,小心地挑取培养菌落中的单克隆,加入到10mL 的加有适当抗性的LB液体培养基中,放在37℃的摇床中培养过夜。

3、把过夜培养的菌液倒入800mL 加有适当抗性的LB 液体培养基中,于37℃摇床中摇到大约OD600 值在0.6~0.8 之间,就可以拿出,把菌液放置于4℃冷却菌液20~30min。

4、在超净台中,加入诱导剂IPTG 至终浓度0.1mM,诱导蛋白表达,于18℃摇床中培养6-8h。

5、诱导完成以后,8000 rpm 离心10min,沉淀收集菌体。

6、在沉淀后的细菌菌体中,加入lysis buffer(10 mM 咪唑,300 mM NaCl,50 mMNaH2PO4,用NaOH 调节pH 值至8.0,蛋白酶抑制剂)中重悬,1g 湿重的菌体沉淀用5mL 的裂解缓冲液,进行超声破碎,然后12000rpm 离心20min,离心后取上清。

7、在上清中加入1 mL Ni-NTA beads 到4 mL 裂解液中,于4℃冰箱中轻轻地混合60 min 左右。

8、加入4 mL 的wash buffer(300 mM NaCl,20 mM 咪唑,50 mM NaH2PO4,用NaOH 调节pH 值至8.0,蛋白酶抑制剂),在冰上洗4 次,每次孵育10min。

9、加入elution buffer(250 mM 咪唑,300 mM NaCl,50 mM NaH2PO4,用NaOH调节pH 值至8.0,蛋白酶抑制剂)洗脱重组蛋白4 次,每次用500μl。

14.3 GST 融合蛋白的表达与纯化1、把GST 标签蛋白表达质粒,进行转化,转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中,冰上放置30min,加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h,然后涂板,于37℃培养箱中进行过夜培养。

his蛋白纯化操作步骤全

his蛋白纯化操作步骤全

His蛋白的纯化一目的蛋白样液的收集1:-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌2:菌种复苏,将5ul P26菌种加入到5ml K+ LB培养基中(1:1000加入卡纳抗生素的LB培养基),以未加菌的K+ LB培养基作空白对照,37度摇床培养12-16h。

3:扩大培养,将5ml过夜培养的P26菌液按照1:100的比例接种到500ml K+ LB培养基中,摇床培养至OD值为0.6(2h左右)4:诱导表达,扩培后的菌种中加入1mg/ml iptg,使iptg最终浓度1ug/ml(1mmol/l ) 37度摇床培养4h,置-70度保存或立即进行下步操作5:收集包涵体,离心,5000r 15min,弃去上清液(可置于-20度保存)6:溶解包涵体,用PBS重悬细胞沉淀(约每毫升沉淀加5mlPBS),放在冰上用超声波细胞粉碎机破菌(有效时间30-40min,超5s,停10s,及时换冰防止温度过高使蛋白质变性)7:蛋白提取液的收集,离心,5000r 15min取上清(可4度保存),菌体保存,测菌体中目的蛋白含量大小使用8:介质处理,取出底帽滴出多余液体,柱子顶部朝上直立固定好,蒸馏水洗涤一次,再用2倍树脂体积的1*binding buffer平衡柱子,最后用1*binding buffer配置成50%的树脂。

9:介质与核酸结合,从柱子上部加入蛋白提取液,4度旋转混匀1h,收集流出液(若需要流出液再重新过柱一次,以最大限度提高结合力)10:取10ml 1*binding buffer洗树脂,洗2次,流出液标记洗涤顺序保存11:样品的收集,取10个1.5mlEP管分别标记1,2,3……10,每次取1ml 1*elution buffer加入树脂内滴入标记1-10的EP管内每管6滴(第8管的目的蛋白含量已经很低,10管即可,若需要可适当增加)12:树脂的保存,若样品体积大于柱子体积,树脂10倍体积的PBS重新平衡后可马上使用,若不使用可用蒸馏水洗涤树脂,加入20%乙醇10ml -20度保存(一种蛋白树脂可重复使用,注意不要超过树脂的结合能力)二检测收集的样品中目的蛋白量的大小13:取13个1.5mlEP管,分别标记1#,2#,3#……10#,A,B,C从1号EP 管内取30ul样液于1#号EP管内,依次移取至10号于10#号,取30ul 10步中第一次收集的流出液于标记 A 的EP管中,取30ul第二次收集的流出液于标记 B 的EP管中,将7步中保留的菌体用少量pbs稀释并取30ul于标记C的EP管内。

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)

第一天1、配置LB培养基:酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g,定容至3000ml。

调节PH至7.4(2M NaOH),高压蒸汽灭菌20分钟,37℃保存。

分装成15瓶(每瓶200ml)。

2、接种(超净台要提前杀菌通风)取4瓶上述培养基,每瓶加200µlAMP(1:1000)、60µl菌液。

37℃过夜。

第二天1、扩大培养(超净台)4瓶扩至16瓶,每瓶培养基加200µlAMP,摇床培养1小时左右。

2、诱导(超净台)加40µlIPTG,加完后去除封口的除牛皮纸,扎口较松。

25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体4℃,8000rpm离心25分钟。

注意配平。

4、超声波破碎菌体离心后去上清,向沉淀加入(600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF)。

将菌液转入2个烧杯中,冰浴超声波破菌,400W,75次,每次6秒,间隔2秒。

离心收集上清液。

600mlPB裂解液:20mM/L PB,10mM/L EDTA,5%甘油,1mM/L DTT,调节PH至7.4。

超声波破碎:首先用去离子水清洗探头,再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中,冰水界面略高于菌液面即可。

探头浸没于菌液中,不可伸入过长。

注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤(双层滤纸)洗胶(GST)。

将上述上清液抽滤,滤液与GST胶混合,磁力搅拌过夜。

第三天1、抽滤蛋白-胶混合液,滤液取样20µl,留电泳。

2、洗杂蛋白,用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml,洗脱若干次,用移液枪吸去上层泡沫(杂蛋白),至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白,洗脱液加50ml,分3次进行(15+15+15),每次加入后间歇搅拌,自然静置洗脱15分钟,抽滤,勿使胶干,合并洗脱液,取样20µl,留电泳。

用洗脱液调零,测OD280。

(OD值达到1.5为佳)4、将洗脱液置于透析袋中(透析袋应提前煮好),将透析袋置于2L透析液1中,加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上,4小时后换为透析液2。

蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程

蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程

蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程2010年02月27日星期六09:02丁香园chrispp作品。

一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp,终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃,250rpm培养过夜。

2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中,37℃,250rpm,3.5h (大量培养至OD600=0.6左右)。

3、取出1mL菌液为未诱导的电泳对照,剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L,继续振荡培养4h。

4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比,SDS-PAGE检测。

结果如下:图11:pET-32aA3未诱导,2:pET-32aA3未诱导,3:pET-32aA3诱导后,4:pET-32aA3诱导后二、表达的情况,是可溶还是沉淀1、将上述的37℃诱导菌液离心(4℃,12000g,5min),弃上清(LB培养液),沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。

2、将重悬于0.9%NaCl的菌体溶液离心(4℃,12000g,5min),弃上清(0.9%NaCl洗菌液),得菌体,称菌体重量,重悬于8mL PBS(pH7.0)缓冲液,缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。

3、超声破菌:冰浴条件下,超声波破碎大肠杆菌,超声设置如下功率:400W,工作:15s,间隔:45s,全程时间:30min(30次左右)以菌液由白变透明,且不粘稠为依据(少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错,而且简单,但是DNA 出来后会粘稠,可能加dna酶后会好些,那样好离心,我是用接近最高转速离心的(没加dan酶),不然分不开)4、将超声波破碎的菌液离心(4℃,12000g,15min),分别收集上清和沉淀,各取1mL,加入1mL2×上样缓冲液,沸水浴10min,SDS-PAGE检测。

结果如下:图21:pET-32aA3诱导上清,2:pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有上述实验结果可知,目标蛋白在上清也有表达,即存在可溶性的表达,但是量很少,大部分也包涵体的形式存在(沉淀中),而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高,上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化,所以可通过探索可溶表达条件,最终来加大上清蛋白的含量,以利于下一步实验的进行。

蛋白表达纯化步骤

蛋白表达纯化步骤

一证明目的蛋白有表达1 挑取一单菌落接种于含(AMP,终浓度为100g/ml)的3ml液体LB培养基中37℃,250rpm 培养过夜。

2 将过夜培养菌液以1:100转接于含抗生素的100ml液体LB中,37℃,250rpm 3.5h(大量培养至OD600=0.6左右)3 取出1ml菌液为未诱导的电泳对照,剩余培养物加入IPTG至终浓度为1mmol/L。

继续震荡培养4h。

4 以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液做对比,SDS-PAGE检测。

结果如图一1未诱导2未诱导3诱导后4诱导后二表达的情况,是可溶还是沉淀1 将上述的37℃诱导的菌液离心(4℃,12000,5min),弃上清(LB培养液),沉淀重悬于0.9% NaCl溶液洗菌。

2 重悬于0.9% NaCl溶液的菌体离心,(4℃,12000,5min),弃上清(0.9% NaCl溶液),得菌体,称菌体重量,悬于8ml PBS(PH7.0)缓冲液,缓冲液用量根据50~100mg/ml的菌液终浓度。

3 超声波破菌:冰浴条件下,超声波破碎大肠杆菌,超声波设置如下:功率:400W 工作:15min 间隔:45s 全程时间:30min(30次左右)以菌液由白变透明,且不粘稠为依据(少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错,而且简单,但是DNA出来后会粘稠,可能加DNA酶会好些,那样好离心,我是用接近最高转速离心的(没有加DNA酶),不然分不开)4 将超声波破碎的菌液离心(4℃,12000,5min),分别收集上清和沉淀,各取1ml,加入1ml 2×上样缓冲液,沸水浴10min,SDS-PAGE检测。

结果如图2三探索可溶表达条件有上述结果可知,目标蛋白在上清也有表达,即存在可溶性表达,但是量很少,大部分以包涵体的形式存在(沉淀中),而包涵体的存在也证明蛋白的表达量很高,上清可溶性蛋白的可操作性等因素的干扰优于对包涵体蛋白的分离纯化,所以可通过探索可溶性蛋白的表达条件,最终加大上清可溶性蛋白的含量,以便实现下一步实验的进行。

全式金蛋白表达与纯化的实验

全式金蛋白表达与纯化的实验
全式金蛋白表达与纯化的实验
C端融合:
构建时注意避免移码 基因不能自带终止密码子 提前终止不影响纯化 二级翻译起始会干扰纯化
全式金蛋白表达与纯化的实验
常用融合标签 • His·Tag • GST·Tag • MBP·Tag
pET系统 pGEX系统 pMal系统
全式金蛋白表达与纯化的实验
常用表达载体系统
转化
培养,诱导
表达载体
重组载体
表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
全式金蛋白表达与纯化的实验
• 启动子 • 融合标签 • 常用表达载体系统
表达载体
全式金蛋白表达与纯化的实验
常见启动子 • λpL启动子: • trp启动子: • trc启动子: • tac启动子:
•T7/T7lac启动子:
热诱导启动子 化学诱导启动子 trp+lac杂交启动子 trp+lacUV5杂交启动子; pGEX(Pharmacia)、pMal(NEB) pET(Novagen)、pEASY-E1/E2(Transgen)
全式金蛋白表达与纯化的实 验
全式金蛋白表达与纯化的实验
上篇 原核表达
• 原核表达概述 • 原核表达策略选择 • 表达结果验证 • 常见问题与实验例
全式金蛋白表达与纯化的实验
原核表达概述 ➢原核表达原理概述 ➢表达载体 ➢表达菌株 ➢表达条件
全式金蛋白表达与纯化的实验
目的基因

原核表达原理概述
构建
tac、trc…… (pGEX、pMal)
特性 适用于非T7启动子的表达系统
T7/T7lac (pET,pEASY)
T7/T7lac (pET,pEASY)
全式金蛋白表达与纯化的实验

strep标签纯化蛋白步骤

strep标签纯化蛋白步骤

strep标签纯化蛋白步骤一、引言蛋白纯化是生物学研究中非常重要的一个步骤,通过对目标蛋白进行分离和纯化,可以获得高纯度的蛋白样品,为后续的结构和功能研究提供可靠的基础。

strep标签是一种常用的蛋白纯化标签,具有高亲和力和高特异性,被广泛应用于蛋白纯化领域。

本文将介绍strep标签纯化蛋白的步骤和技术。

二、strep标签纯化蛋白的步骤1. 基因工程构建含有strep标签的目标蛋白表达载体需要将目标蛋白的编码序列与strep标签的编码序列进行连接,构建含有strep标签的目标蛋白表达载体。

通常使用重组DNA技术,在目标蛋白的N端或C端引入strep标签的编码序列,使其与目标蛋白融合表达。

这样,在细胞内合成的目标蛋白就会带有strep标签。

2. 目标蛋白的表达与细胞培养将构建好的目标蛋白表达载体转化至适合的宿主细胞中,如大肠杆菌。

经过培养和诱导,目标蛋白将在细胞内得到高效表达。

细胞培养过程中,需要注意选择适当的培养条件,如温度、培养基组成等,以确保目标蛋白的表达量和质量。

3. 细胞破碎与裂解经过培养和诱导后,细菌细胞中含有大量的目标蛋白。

为了获得目标蛋白,需要对细胞进行破碎和裂解。

常用的方法有超声波破碎、高压融菌等。

破碎后,目标蛋白被释放到裂解液中。

4. 蛋白裂解液的预处理裂解液中通常含有大量的杂质蛋白、核酸、小分子化合物等。

为了提高后续纯化步骤的效果,需要对裂解液进行预处理。

可以通过离心、滤过等方法去除细胞碎片、沉淀杂质等。

5. strep标签亲和层析纯化将预处理后的裂解液加载到含有strep标签亲和树脂的层析柱中。

strep标签与亲和树脂之间形成特异性的结合,目标蛋白会与亲和树脂特异结合,而其他杂质蛋白则流经。

接着,通过洗脱缓冲液将目标蛋白从亲和树脂上洗脱下来。

6. 洗脱产物的后续处理洗脱得到的产物中仍可能含有一些杂质,需要进行进一步的处理。

可以通过柱洗脱、凝胶电泳等方法进行杂质去除。

最终得到的产物即为纯化后的目标蛋白。

蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告

蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告

实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达:将外源基因克隆在特殊的表达载体中,让其在E. coli中表达,该表达载体上含有lac操作子的启动子。

在不加诱导剂的条件下培养宿主菌,lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合,使外源基因不能表达;向培养基中加入诱导物IPTG后,LacI阻遏蛋白变构失活,不能与lac操作子结合,外源基因就表达。

2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离:SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

其分离原理是根据蛋白质分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构,并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,稳定地存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。

3.考马斯亮蓝法检测蛋白质:考马斯亮蓝是一种蛋白质染料,主要有R-250和G-250两种类型。

考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基(Arg,Trp,Tyr,His,Phe)结合。

考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色;因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red,偏红,红蓝色,与蛋白质结合虽然比较缓慢,但是染料可以穿透凝胶,染胶效果好,染色后为蓝色,且与胶的结合可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。

4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起,融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。

蛋白质的表达纯化及结晶

蛋白质的表达纯化及结晶

2.3.2.2 蛋白质表达、纯化(1)初始种子培养:挑取阳性克隆到10 mL的含有Amp抗生素的液体LB培养基中,在37℃过夜振荡培养。

(2)扩大培养:将初始种子接入1 L含抗生素的液体培养基中,37℃振荡培养至菌浓OD600为0.6-0.8时,降温至15℃或20℃;一个小时后加入终浓度为0.6 mM的IPTG,并诱导表达过夜。

(3)收集菌体:于4200 rpm,4℃下离心15 min,弃去上清,收获菌体;加入重悬溶液(25 mM Tris-HCl pH8.0,100 mM NaCl),悬浮菌体细胞;细胞破碎前加入终浓度为2 mM的蛋白酶抑制剂PMSF(Phenylmethyl sulfonyl fluoride,苯甲酸磺酰氟)。

(4)超声破碎细胞:400W下,超声3s,间隔6s,工作60次。

(5)超速离心:细胞裂解液于14000 rpm,4℃下离心50 min,收集上清液,进行下一步的分离纯化。

(6)Ni-NTA亲和层析:将上清液体倒入Ni-NTA柱中。

流净后,用wash buffer (25 mM Tris-HCl pH8.0,100 mM NaCl,15 mM imidazole)冲洗10个柱体积,除去杂蛋白;最后使用elution buffer(25 mM Tris-HCl pH8.0,100 mM NaCl,250 mM imidazole)将目的蛋白洗脱下来。

使用SDS-PAGE检测蛋白的可溶性、挂柱效率及蛋白的浓度。

由于本实验中YdiV等蛋白都是连接到pGl01载体中,带有可以用PPase切除的6×His标签。

为了获得更纯净的、不带标签的蛋白,我们在有那个wash buffer冲洗去除杂蛋白以后,每根镍柱中加入5 ml的重悬缓冲液然后加入100-200 μL的PPase,3-5 h后,用5 ml重选冲洗柱子,电泳检测酶切效率。

(7)阴离子交换层析纯化:先平衡离子交换柱。

然后将上一步洗脱下的蛋白用溶液A(25 mM Tris-HCl, pH8.0)稀释4-6倍,上样到离子交换柱Source Q上,使用溶液A与溶液B(25mM Tris-HCl pH8.0,1M NaCl)进行线性梯度洗脱。

表达纯化蛋白基本步骤

表达纯化蛋白基本步骤

蛋白表达纯化的基本步骤包括:质粒转染、细胞培养、蛋白质收集、蛋白质纯化和蛋白质鉴定。

其中,质粒转染是表达蛋白的第一步,通过将质粒导入细胞中,使细胞表达出目标蛋白。

细胞培养是将转染后的细胞培养在合适的条件下,使其持续表达蛋白。

蛋白质收集是在细胞培养过程中收集蛋白质,通常采用离心、过滤或凝胶过滤等方法。

蛋白质纯化则是将收集到的蛋白进行分离和纯化,以去除杂蛋白和杂质,从而获得高纯度的蛋白质。

最后,通过蛋白质鉴定来确认所纯化的蛋白是否满足要求,通常使用SDS-PAGE、Western blotting和MALDI-TOF等分析方法。

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蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。

7、蛋白的诱导表达。

1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。

37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。

4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。

2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。

1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。

2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。

)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。

另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。

3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18°左右),转速140rpm左右。

4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。

加入20mM PBS,洗一遍后用平衡缓冲液重悬。

每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。

可用4支50ml的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。

10、超声波裂解。

1)用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。

注意:1.要冰浴。

2.要随时观察裂解情况以防意外。

3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。

一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。

4.正常声音为:孜孜声,尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头松动等原因,要及时调整。

溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成(后面3000转离心时,如果沉淀少说明裂解的好)。

5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关)。

注意:1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF),PMSF工作浓度为1%。

2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解60分钟,60分钟足够裂解。

11、取得上清1)将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。

10000rpm,15min,4°离心。

沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。

轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。

(此时可以测量一下pH值,pH值最好在7.5左右。

平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在7.5左右。

)12、纯化上清---摸洗脱条件。

1)镍柱处理。

将1ml镍柱吸入空层析管中,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2)将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。

(若是流速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1ml的枪将胶体吹散。

)取20μl过柱后的样品,以备跑胶。

3)分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。

每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。

每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中,以备跑胶。

注意:理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度,直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。

实际上测不到零,怎么都会有一点的,上面说的量已经做够洗脱了。

4)加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。

上样量为4.5ml(将前面的0.5ml单独接入EP 管,再将后面的4ml接入另外两个EP管),留跑胶样品。

5)加MES将NI柱重生。

MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O。

流完后保存于2倍体积的20%乙醇中,镍柱至少能重复利用6次。

(尿素可能对NI柱有损伤。

)注意:所有溶液使用前都要确定其pH是否正确,pH对挂柱及洗脱影响较大。

镍柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。

13、跑胶验证。

1)跑2块0.75mm的PAGE胶,把所有的样品都加上去,注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。

2)跑胶顺序:负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES3)300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右。

(也可以300V,30min,只是图没有160V好看。

)4)考马斯亮蓝染色。

一般染色2h即可。

5)脱色。

先用脱色剂1脱15min,再用脱色剂2脱过夜。

14、纯化上清---收集目的蛋白1)将重生的镍柱再次平衡(即加Equilibration Buffer 3ml)。

2)重复步骤12中的操作,只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

15、跑胶验证。

同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点(用160V),保存好。

16、透析。

1)配制2L透析液(配方见附件1),并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2)透析袋(剪10cm即可)用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗净。

3)用透析夹将透析袋夹住(将透析袋折叠一下会夹的更牢),将洗脱的蛋白样品加入其中,置入提前预冷的500ml透析液(20mM PBS+50 mM NaCl)中。

冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。

透析3次即可。

注意:用广口瓶装透析液,将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。

冰浴以防活性降低。

17、浓缩。

1)将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中,用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2)30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除,加入新的固体聚乙二醇。

3)每隔10min观察一次,一旦出现浑浊立即停止浓缩。

4)透析袋用完后,洗净,保存于20%乙醇中4°存放。

注意:浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现,由于透析袋使溶液成薄层状,透明度较高,不易发现小颗粒或絮状沉淀,要看仔细。

如果看不到,可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。

用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分装后-20度保存。

18、超滤法浓缩、透析蛋白。

使用超滤法就可省去16、17两步。

1)将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2)配平。

3)7400g,30min,4°离心,结束时4ml变为1ml左右。

浓缩4倍。

可根据需要选择不同的离心时间,以达到不同的浓缩倍数。

可以几次的Elution液一起浓缩。

4)加入需要的蛋白储存液至4ml,离心。

重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。

蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。

如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油(1%-5%即可)助溶。

5)收集。

将溶液从超滤管中收集到EP管中,标记好储存液的成分,蛋白名称,蛋白浓度(测量后),制备日期。

注:超滤管的使用方法见附件419、蛋白浓度测定。

见附件320、蛋白活性测试。

转染细胞测量荧光。

21、抗原处理。

蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

22、注射兔子。

选择合适的注射方式和合适的免疫程序。

23、收集免疫血清。

提取抗体。

24、抗体效价评定。

附件1所需溶液配方:1)2)Equilibration Buffer(平衡缓冲液): PBS with 10 mM 咪唑pH 7.43)Wash Buffer(清洗缓冲液): PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑pH 7.44)Elution Buffer(洗脱缓冲液): PBS with 250 mM 咪唑pH 7.45)MES(再生缓冲液): 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodiumchloride; pH 5.0。

即0.3904g MES+0.5844g NaCl.6)透析袋处理液: 2%(w/v)碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA7)TIPS:1—4的溶液可以一起配制。

先配10ml 8M的咪唑。

再配1L的PBS,用500ml水将试剂溶解,取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中,作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer,再向其分别加入适当体积的8M咪唑。

最后,定容。

Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml,Equilibration Buffer配了300ml。

PBS配了500ml。

附件2包涵体检测1.摇10ml菌,加0.5%葡萄糖和相应抗性。

培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温(16-25度)诱导过夜(也可不离心,在原来LB中直接加IPTG)。

在离心前取500μl菌液作为负对照,诱导完成后取500微升作为正对照。

正负对照不用超声波裂解,直接煮沸10min跑胶。

2.诱导完成后,用2ml EP管6000rpm,2min,4度,收集10ml菌液。

1.5ml PBS (50m MPBS,300m M NaCl )重悬细菌。

3.裂解细胞。

用超声波破碎细胞直到悬液变清亮,一般15到30min。

裂解3s,停止6s,裂解时冰上放置。

4.分离上清。

5000rpm,4min,4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。

然后,10000rpm,10min,4度。

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