蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进）

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.

4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、

Bl21 codon（DE3）等。

7、蛋白的诱导表达。

1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。

4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.

保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。

8、包涵体检测。方案见附件2

9、如有上清表达，则扩大摇菌。

1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。

2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD= 1.0左右（约

2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当

的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。

3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速140rpm左右。

4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。加入20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。

10、超声波裂解。

1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。

注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。

4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头

松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。

注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解

60分钟，60分钟足够裂解。

11、取得上清

1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm，15min，4°离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。）

12、纯化上清---摸洗脱条件。

1）镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20μl过柱后的样品，以备跑胶。

3）分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。

注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。

4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP 管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。

5）加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。（尿素可能对NI柱有损伤。）注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余Equilibration Buffer pH=7.8 ，上清pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7.2。

13、跑胶验证。

1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。

2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES

3）300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min，只是图没有160V好看。）

4）考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。

5）脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。

14、纯化上清---收集目的蛋白

1)将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）。

2)重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

15、跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。

16、透析。

1）配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H2O充分洗净。

3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。透析3次即可。

注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。