β-半乳糖苷酶活性测定方法
用试纸法快速检测β-半乳糖苷酶活性的研究
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板栗花中β-半乳糖苷酶活性的研究
。 ＨＨ — Ｓ数显 恒 温水浴 锅 、 电子 天平 、 Ｓ Ｐ 一 ７ ２ ３型可 见光 分 光 入表 １
２ 试 验方法
花 中的 １ ３ 一半 乳糖 苷 酶 的性 质 。 探 知 所 有 品 种 的 板 栗 花 的 １ ３ 一 半 乳 糖 苷 酶 活 性 在 采 花 后 的前 ９天 都 呈 现 先 减 小 后 增 大 的趋 势 。燕胜
２ ． １ １ ３一半乳 糖 苷酶 的提 取 提取 方法 ： 取 １ ｇ花瓣 样 品， 用剪 刀剪 成 小 碎 片 后 ， 置于 研 钵 中 ； 再 向研 钵 中 加 入 板 栗花中的 １ ３一半 乳糖 苷 酶 活 性 最 适 温 度 为 ４ Ｏ ℃ ，最 适 ｐ Ｈ值 为 １ ０ ｍｌ 磷酸 盐缓 冲 溶液 ， 将样 品研 磨 成 匀浆 ， １ ２ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ离 ５ 。
板 栗花 中 ｐ 一 半乳糖苷 酶活性 的研究
唐 烨 苏琪 张萍珍 （ 圣 元 营 养 食 品 有限 公司 北 京 营 养 研究 院 ）
摘要 ： 以１ ２种 板 栗 花 为试 验 材 料 ， 采用磷酸缓 冲溶液提取 １ ３ 一 光 度计 。
半 乳糖 苷 酶 并 用 分 光 光 度 计 测 定 其 活 性 ， 并测定 了“ 燕胜 ” 品 种 板 栗
３ 结果 与分 析 ３ ． １ 不 同板 栗 花 品种 中 １ ３一半 乳 糖 苷 酶 在 不 同储 存 期 间 的活 性 本 次试验 分 别在 采花 后第 １ 、 ３ 、 ５ 、 ７ 、 ９天 对 各 玻璃棒、 标签。 品种板 栗花 进行样 品 处理 和 酶活性 测定 ，五 次试验 结果列 １ ． ３ 试 验 仪器 Ｒ Ｊ — Ｔ ＤＬ 一 ５ Ａ低 速 台式 大 容量 离 心机 、
β-半乳糖苷酶活性测定方法
β-半乳糖苷酶活性测定方法β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟；5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度；7、计算β-半乳糖苷酶酶活力：Miller Units = 1,000×[(OD420－ 1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数；OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；t ----显色反应时间(单位min)；V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。
Z buffer (总体积100 ml)：Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.624gKCl 10mM 0.07455gMgSO4·7H2O1mM 0.0246gβ-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl加水到总体积90 ml，待试剂溶解后调pH 至7.0，最后定容到100 ml，4℃储存。
Substrate solution(总体积10ml)----现用现配Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 g NaH2PO4·H2O 40mM 0.0624g ONPG 4mg/ml 0.04g终止液（100ml）：Na2CO3 1M 10.6g。
(完整版)β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化毕业设计
摘要从土壤中筛选出一株产β-半乳糖苷酶的枯草芽孢杆菌，并对菌株和其产生的β-半乳糖苷酶进行了测定。
单菌落的最佳生长时间是10h，最佳接种量是2.0%，最佳培养时间24h；该菌株产生的β-半乳糖苷酶的最适pH 是6.5，最适生长温度为37℃，酶的稳定性较高，4h后相对酶活仍能维持85%以上；Mg2+对酶活性的促进作用最强，当浓度为10 mmolL时，酶活力可达112.24％，Cu2+对酶活性抑制作用最强，少量Cu2+（1mmolL）就可使酶失活。
本实验还进行了β-半乳糖苷酶的固定化实验。
以海藻酸钠为栽体、戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行固定化。
研究了海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度、固定化时间对酶固定化的影响，并对固定化酶酶促反应的最适pH、温度等进行了测定。
结果表明，4％的海藻酸钠，在温度37℃、pH6~7、氯化钙浓度1％、戊二醛浓度0.1%下对乳糖酶的固定化率最高。
酶促反应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适pH范围与非固定化乳糖酶大致相同。
但固定化酶珠体机械强度较差，尚待改进。
关键词：β-半乳糖苷酶酶活性酶的固定化AbsractA strai n isolated from soil in producing β-galactosidase of Bacillus subtilis, and strains and β-galactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was 2.0%, the best culture time 24h; optimum pH β-galactosidase enzyme produced by this strain is 6.5, the optimum temperature is 37℃, enzyme be maintained above 85%; Mg2+on the activity of promoting the strongest, when the concentration of 10 mmolL, the enzyme activity of up to 112.24%, Cu2+ inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu2+ (1mmolL) can inactivate the enzyme.The experiments were also β-galactosidase immobilization experiments. The lactase was immobilized on sodium alginate carrier by cross-link with glutaraldehyde. The effects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of the immobilized lactase were studied. The results show that the of enzyme目录摘要 (I)Absract (II)目录 ............................................................................................................................................ I II 第1章绪论 (7)1.1 研究背景 (7)1.2 课题研究目的和意义 ..................................................................... 错误！未定义书签。
细胞衰老检查的实验技术及原理(一)
细胞衰老检查的实验技术及原理（一）关键词：细胞色素成纤维细胞酶磷酸试剂标准物质北京标准物质网衰老细胞的形态变化主要表现为形状变大、变平、胞核增大、核膜内陷、染色质固缩、胞内溶酶体变多等。
衰老细胞中细胞器数量尤其是线粒体数量减少，胞质内有色素堆积和空泡形成，最终导致细胞死亡。
总体来说衰老细胞的各种结构呈退行性变化。
根据其特征，目前常用于检测衰老的方法如下：一、β-半乳糖苷酶活性1995年，Dimiri等发现体外培养二倍体成纤维细胞在培养基pH值为6时，其β-半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而逐渐上调，他们把这种中性β-半乳糖苷酶定义为SA-β-gal，即衰老相关的β-半乳糖苷酶。
衰老细胞或组织产生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X—Gal，生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下很容易观察到(图5-5-1)。
在人体表皮角质层细胞中，也可以发现SA-β-gal 随年龄的增加而增加。
并且，SA-β-gal不依赖于DNA复制，可以区分衰老细胞与静止期的细胞。
SA-β-gal是一种体内体外都适用的检测衰老的生物标记物。
由于检测SA-β-gal的方法简单易行，其在检测衰老细胞方面有很广泛的应用，目前已经有2400多篇论文应用了这种方法。
二、端粒长度的检查端粒是位于真核细胞染色体末端顶部的核蛋白结构，由高度保守的TTAGGG 重复序列组成，其存在可以保护染色体末端，是维持染色体稳定的重要因素。
鉴于端粒的特殊结构，端粒的长度会随着每次细胞的分裂而缩短，因此，端粒长度是衰老的一个重要生物标志。
这里我们主要讨论端粒限制性片段(TRF)分析及荧光原位杂交(FISH)法。
端粒限制性片段分析：TRF分析也称作端粒的Southern印迹法，是应用针对端粒重复序列的探针来检测限制性酶切后所保留的端粒的方法。
限制性酶会将基因组DNA消化为短的片段，留下大量完好的端粒，即所谓的端粒限制性片段。
以凝胶电泳分离基因组片段，通过放射性探针(CCCTAA)。
荧光素酶活性实验
荧光素酶活性实验（1）.以5*104的细胞/孔接种于24孔板中，24hr后用磷酸钙转染，转染所有所需的DNA。
包括受体表达载体、包含荧光素酶报告基因的各种表达质粒和B-gal半乳糖苷酶表达质粒共转入细胞中。
(2).弃去培养液后，PBS洗一次，每孔加入120ul裂解液，4℃放置10min，13000rpm离心5min，取上清。
（3）.B-gal半乳糖苷酶活性测定：配制B-gal半乳糖苷酶活性测定液：880ul ONPG+40ul 100*镁离子溶液+2280ul 0.1M磷酸盐缓冲液。
每个样品加入B-gal测定液120ul和细胞裂解液20ul。
以上混合液于37℃孵育至有黄色出现为止，加入60ul 1M的Na2CO3终止反应。
于酶标仪410nm 测定吸收值，以此作为B-gal半乳糖苷酶的相对活性，用于内对照，已标定转染效率。
（4）.荧光素酶活性测定：将20ul的细胞裂解液（用细胞裂解液补至100ul）与10ul的荧光素酶检验试剂（Lueiferin solution荧光素一管和ATP一管）混匀，立即用sepctrafluor plus检测发出的荧光信号，该荧光值与相对应的B-gal半乳糖苷酶的OD值之比为标定后的荧光素酶的相对活性。
附:试剂配方：磷酸盐缓冲液：NaHPO4， Na2HPO4 pH7.3 详细配法见分子克隆100*镁离子溶液(0.1M MgCL2, 5M B-巯基乙醇)ONPG 4mg( O–nitropheny-B-D-galactopyanoside)溶于1ml 0.1M磷酸盐缓冲液Lueiferin solution:10 mg Lueiferin溶于36ml 5Mm KH2PO4(pH7.8),分装成432ul每管.储存于-80℃.用前应先于室温放30min, 注意避光。
ATP:25 ml 1M Tris+5ml 1M MgCL2 + 0.48gATP分装成120ul每管.储存于-80℃.0.1M PBS 溶液，以1L量为例：NaCl 80g 9Na2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠，最常见，不怎么吸潮，如果你有无水的这两种磷酸盐也行，换算一下即可，无水的容易吸潮。
半乳糖苷酶活测定
1.5 β—半乳糖苷酶粗酶液的提取将菌株接种于产酶培养基中，30℃培养60h，过滤收集菌体，充分洗涤，加柠檬酸--磷酸氢二钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）研磨，破壁菌液离心所得上清液即为粗酶液。
1.6 酶活力的测定在试管中加入100µl邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷（ONPG），800µL 10.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，100µl酶液，混匀，50℃水浴中反应10分钟，加2ml 1mol/L终止反应，测定计算酶活力。
酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟分解ONPG，生成1µ mol邻硝基苯酚（ONP）所需的酶量为1个酶活力单位（U）。
1.2.1 酶活力的测定以ο-NPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
酶活力单位定义为以ο-NPG为底物37℃保温酶解，每分钟释放出1µmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
β-半乳糖苷酶活测定采用Genstar 的β-半乳糖苷酶检测试剂盒法。
在有β-半乳糖苷酶存在的条件下，无色的反应底物会转化生成黄色的硝基酚(o-nitrophenol)。
向各管中加入一定量的反应终止液，离心测定420 nm 和550 nm 下的吸光度。
β-半乳糖苷酶活性单位数(U)=1000- (OD420 -1.7 OD550)/Time(min)×V(mL)×1.5 酶活力测定方法将pH6.5的磷酸缓冲液500µl和0.25%的ONPG 200µl加入比色管,在25℃的温度下温浴5min,加入适当稀释的粗酶液0.5ml,反应10min,加入800µl 5%Na2CO3终止反应,蒸馏水定容至10ml,用分光光度计420nm测定OD值,通过标准曲线方程计算酶活。
在上述条件下1ml粗酶液1min催化水解ONPG生成1µmol邻硝基苯酚(ONP)的量,定义为1U。
1.2培养基初筛培养基：乳糖0.5%，硫酸镁0.007%，磷酸氢二钾0.01%，氯化钙0.004%，硫酸铵0.01%，琼脂1.5%，自然pH，每100mL培养基中加入20mg/mL X-gal溶液200µL；复筛培养基：乳糖1.5%，蛋白胨1.0%，酵母浸膏0.3%，氯化钠0.1%，pH值7.0；发酵培养基：乳糖3.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.3%，pH值7.0。
β-半乳糖苷酶 标准 -回复
β-半乳糖苷酶标准-回复标题：β-半乳糖苷酶的标准：理解、应用与评估一、引言β-半乳糖苷酶，也被称为乳糖酶，是一种在生物体内广泛存在的水解酶。
它主要负责催化β-半乳糖苷键的断裂，从而在各种生物过程中发挥关键作用。
本文将详细探讨β-半乳糖苷酶的标准，包括其定义、性质、功能、应用以及评估方法。
二、β-半乳糖苷酶的定义和性质β-半乳糖苷酶是一种糖苷水解酶，属于GH家族的一类酶。
它能特异性地催化β-半乳糖苷键的水解反应，生成半乳糖和非还原性末端。
这种酶在酸性和中性pH条件下具有活性，最适pH值通常在6.0-7.0之间。
β-半乳糖苷酶的分子量通常在50,000-100,000 Da之间，其三维结构包含一个或多个β-螺旋和α-螺旋结构域。
这些结构域共同构成了酶的活性位点，其中包含一个或多个保守的氨基酸残基，这些残基直接参与底物的识别和催化反应。
三、β-半乳糖苷酶的功能β-半乳糖苷酶在生物体内的功能多种多样。
在消化系统中，乳糖酶是人体分解乳糖的关键酶，对于乳糖的吸收和利用起着至关重要的作用。
在工业生产中，β-半乳糖苷酶被广泛应用于食品、制药、纺织和环保等领域。
在食品工业中，β-半乳糖苷酶常用于乳制品的加工，如乳糖的水解、奶酪的成熟和风味的改善等。
在制药工业中，β-半乳糖苷酶可用于制备药物前体和生物标记物。
在纺织工业中，β-半乳糖苷酶可用于棉织物的预处理和染色。
在环保领域，β-半乳糖苷酶可用于废水处理和生物质能源的生产。
四、β-半乳糖苷酶的应用1. 食品工业：β-半乳糖苷酶在乳制品加工中的应用最为广泛。
例如，通过乳糖酶的作用，可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，使得乳糖不耐受的人群也能享受到乳制品的美味。
2. 制药工业：β-半乳糖苷酶可用于制备某些药物的前体，如抗生素、抗癌药物等。
此外，它还可以用于生物标记物的制备，如用作诊断工具的糖缀合物。
3. 纺织工业：在纺织工业中，β-半乳糖苷酶可用于棉织物的预处理和染色。
它可以去除棉纤维表面的半乳糖基团，提高染料的吸附性和染色效果。
β半乳糖苷酶染色统计方法
β半乳糖苷酶染色统计方法β半乳糖苷酶染色统计方法引言β半乳糖苷酶是一种重要的酶，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
为了准确测定β半乳糖苷酶的活性，我们需要针对其染色来进行统计分析。
本文将详细介绍几种常用的β半乳糖苷酶染色统计方法。
方法一：比色法1.准备样本：收集待测试的样本，如细胞培养液或组织切片。
2.制备底物：制备含有4-甲基-β-半乳糖苷（MUG）的底物溶液。
3.加入样本与底物：将样本与底物溶液混合，以触发酶底物反应。
4.加入停止液：加入含碱性溶液，停止反应，生成可测量的产物。
5.比色测定：使用比色法测量产物的吸光度，根据标准曲线计算β半乳糖苷酶的活性。
方法二：荧光法1.准备样本：与比色法相同，收集待测试的样本。
2.加入底物：使用荧光底物（如4-甲基-7-氨基香豆素）进行反应。
3.反应停止：加入相应的化学物质停止反应，生成可测量的荧光产物。
4.荧光测定：使用荧光光谱仪或流式细胞仪来测量荧光产物的荧光强度，并计算β半乳糖苷酶的活性。
方法三：显微镜法1.准备样本：制备待测试的组织切片或细胞样本。
2.染色：使用具有底物性质的染色剂（如X-β-D-GlcA）来染色。
3.显微镜观察：使用显微镜观察到染色后的样本，测量正、负染色细胞的数量。
4.统计分析：根据正、负染色细胞的数量计算出β半乳糖苷酶的活性。
方法四：酶组学技术1.准备样本：收集待测试的细胞或组织样本。
2.酶组学分析：使用高通量酶组学技术（如蛋白质微芯片）来评估多个酶的活性。
3.数据分析：将得到的酶组学数据进行统计分析，计算β半乳糖苷酶的活性。
4.结果验证：使用其他方法对结果进行验证，如比色法、荧光法或显微镜法。
结论根据上述介绍的方法，研究人员可以选择适合自己研究需求的β半乳糖苷酶染色统计方法。
无论是比色法、荧光法、显微镜法还是酶组学技术，都可以提供准确的β半乳糖苷酶活性数据，助力相关研究的开展。
在选择方法时，需根据实验条件、设备设施和预算等因素进行综合考虑，以确保研究结果的可靠性和准确性。
β-半乳糖苷酶检测
迪信泰检测平台
β-半乳糖苷酶检测
β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）是广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中的一种水解酶，能够催化β-半乳糖苷键水解，还具有转半乳糖苷的作用。
β-半乳糖苷酶不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还可以在多糖代谢、细胞壁组分代谢过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。
此外，β-半乳糖苷酶可作为老化的标志物以及监测基因表达的指标印记。
因此，β-半乳糖苷酶已广泛应用于食品工业、生物技术和医药等领域。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测β-半乳糖苷酶的活性变化。
此外，我们还提供其他糖代谢类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定β-半乳糖苷酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. β-半乳糖苷酶活性信息。
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。
大肠杆菌生化实验报告
大肠杆菌生化实验报告大肠杆菌生化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，广泛存在于人类和动物的消化系统中。
由于其简单的生长条件和高度适应性，大肠杆菌成为了许多生化实验的理想模型。
本报告旨在介绍大肠杆菌在生化实验中的应用和结果。
实验一：酶活性测定酶活性是衡量细胞代谢活跃程度的重要指标之一。
在本实验中，我们选择了大肠杆菌中的一种酶，β-半乳糖苷酶（LacZ），来进行酶活性测定。
实验步骤：1. 培养大肠杆菌细胞。
2. 采集细胞样品，并进行离心。
3. 悬浮细胞样品，并加入底物。
4. 反应一段时间后，停止反应，并测定底物的降解程度。
结果与讨论：通过测定底物的降解程度，我们可以得到β-半乳糖苷酶的酶活性。
实验结果显示，在不同培养条件下，大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶酶活性存在差异。
这表明培养条件对细菌酶活性有一定的影响。
进一步的研究可以探究这些影响因素，并优化培养条件，提高酶活性。
实验二：代谢产物分析大肠杆菌是一种典型的乳酸菌，其代谢途径复杂多样。
在本实验中，我们选择了大肠杆菌中的乳酸代谢途径作为研究对象，通过代谢产物分析来了解细菌的代谢特征。
实验步骤：1. 培养大肠杆菌细胞。
2. 采集细胞样品，并进行离心。
3. 提取细胞内代谢产物。
4. 使用色谱或质谱等技术，对代谢产物进行分析。
结果与讨论：通过代谢产物分析，我们可以了解大肠杆菌在不同培养条件下的代谢特征。
实验结果显示，大肠杆菌在不同培养基中产生的代谢产物有所差异。
这表明培养基成分对细菌代谢途径的选择有一定的影响。
进一步的研究可以探究这些影响因素，并优化培养基配方，调控代谢途径，提高产物产量。
实验三：抗生素敏感性测试抗生素敏感性测试是评估细菌对抗生素的耐药性的重要方法之一。
在本实验中，我们选择了几种常用的抗生素，对大肠杆菌进行敏感性测试。
实验步骤：1. 培养大肠杆菌细胞。
2. 制备不同浓度的抗生素溶液。
3. 在琼脂平板上涂布细菌样品。
β-半乳糖苷酶活力测定原理
β-半乳糖苷酶活力测定原理
β-半乳糖苷酶是一种酶，能够催化底物β-半乳糖苷的水解反应。
测定β-半乳糖苷酶的活力可以通过以下原理进行：
1. 准备反应体系：将底物β-半乳糖苷和β-半乳糖苷酶加入反应体系中。
2. 反应进行：酶催化底物水解，生成产物。
3. 酶活测定：通过测定产物的生成量，间接反映酶的活力。
4. 甲基麦芽糖法：常用的方法是利用甲基麦芽糖作为内标物。
在反应体系中加入一定量的甲基麦芽糖，同时加入β-半乳糖苷酶。
酶催化底物β-半乳糖苷和甲基麦芽糖分别生成产物。
然后使用色谱或其他分析方法对产物进行定量分析，计算出β-半乳糖苷酶的活力。
5. 光度法：在反应体系中加入某种显色剂，当底物被酶催化水解时，产生特定的颜色变化。
通过光度计测量产生的颜色变化的吸光度，可以计算出酶的活性。
这些方法都是通过测定底物的转化率或产物的生成量来间接反映β-半乳糖苷酶的活力。
β-半乳糖苷酶(LACZ)酶活测定
警示：在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性，要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。
作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。
麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险。
法律声明β-半乳糖苷酶（LAC Z）酶活测定1. 在冰上解冻样品，同时准备裂解液（见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项）。
2. 准备若干(至少每个样品3个和空白一支)透明的塑料比色皿，每支装有500μl的碳酸钠终止液。
你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。
3. 在微量离心试管中加入如下试剂：400μl 磷酸钠盐缓冲液（pH 7.5）133μl ONPG溶液6μl 镁离子溶液4. 把反应混合物放置在37°C的水浴中或者加热垫上预温育。
5. 一旦预热后，加入如下物质：60μl 细胞萃取物比较明智的做法是同时做阴性对照，即用抽提物或不表达β-半乳糖苷酶的细胞抽提物代替前述的细胞抽提物。
6. 留心观察每个反应试管里黄色（o-硝基酚）的出现，在适当的时间点，从每种反应混合物中等量移取100μl的溶液，把它加到装有碳酸钠终止液的比色皿中。
7. 当完成所有时间点测定后，在420 nm处测光密度，记录吸光值，并且计算吸光值与时间的斜率。
斜率和β-半乳糖苷酶的活性成正比。
注意：若在420nm处吸光值高于1.0，则不能采信。
8. 在计算其实际活性时，先制作o-硝基酚标准曲线图，然后根据样品的吸光值在曲线上找出对应的浓度。
一个酶活力单位是指酶在37ºC每分钟可催化产生1 μmol的o-硝基酚。
收集和裂解细胞的注意事项细胞培养物的收集1. 在适当的培养时间，取出1.6 ml的培养物放入微量离心管中，并把它置于冰上。
2. 迅速将1.6 ml样品在涡旋混匀器上振荡，然后移出100μl放入已装有900 μL新鲜培养基的比色皿中。
离心剩下的1.5ml样品，去掉上层清液，把沉淀迅速放在-80°C冷藏。
普通酸奶制品在贮存过程中发酵剂菌的β—半乳糖苷酶活性测定及变化规律研究
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维普资讯
研究与探言 寸
普通酸奶制品在贮存过程中发酵剂菌的 １ 半乳糖苷酶活性测定及变化规律研究 ５ 一
（ 南理 Ｉ犬 学化 Ｉ所 ， 州 ５０４） 华 广 １６０
（ 北 农 业 犬 学食 品 学 院 ，５ ０ ０ 东 １０ ３ ）
郭清泉
张 兰戚 林 淑 英
ｐ 半 乳糖 苷酶 可 以降低 乳 制 品 中乳 糖 含 量 ， 一 防 止 乳 糖 不 耐 症 的 发 生 ， 在 乳 糖 代 谢 中 起 着 重 要 作 并 用 ， 对 其 研 究 很 有 必 要 。 目前 对 日 半 乳 精 苷 酶 活 故 一 性 测 定 方 法 有 很 多 种 ， 结 果 差 异 较 大 ， 主 要 是 但 这 由 于 培 养 摹 质 中 菌 体 细 胞 数 目 不 同 而 造 成 的 ｉ 而 。 采 用 菌 体 细 胞 蛋 白 重 来 代 替 细 胞 干 重 或 发 酵 基 质 重 是 比 较 精 确 的 测 定 ｐ一 乳 糖 苷 酶 特 异 比 活 力 的 半
不同类型标本的衰老相关β-半乳糖苷酶染色方法
β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）是一种常见的酶，它在细胞和组织的老化过程中起着重要作用。
研究β-半乳糖苷酶在不同类型标本的衰老过程中的表达和活性对于理解衰老的机制具有重要意义。
在实验室研究中，需要使用染色方法来检测β-半乳糖苷酶的活性和表达情况。
本文将介绍几种常用的β-半乳糖苷酶染色方法，并比较它们在不同类型标本的应用效果。
一、X-gal染色法X-gal（5-溴化-4-氯-3-吲哚乙酸甲酯）是一种常用的β-半乳糖苷酶底物，可以被β-半乳糖苷酶水解成产生蓝色沉淀物。
X-gal染色方法简单、快速，被广泛应用于细胞和组织的β-半乳糖苷酶活性检测。
然而，X-gal染色对于一些类型的标本，如皮肤和硬组织，染色效果不佳，可能出现背景染色。
二、ONPG染色法ONPG（2-硝基苯基-β-D-半乳糖苷）也是一种常用的β-半乳糖苷酶底物，它与β-半乳糖苷酶发生反应生成黄色产物。
相比于X-gal染色，ONPG染色对于硬组织和皮肤等类型标本的染色效果更好，且背景染色较少。
然而，ONPG染色方法需要较长的反应时间，且操作相对复杂。
三、Elderly染色法Elderly染色法是一种相对较新的β-半乳糖苷酶染色方法，它以Elderly底物与β-半乳糖苷酶发生反应产生紫色产物。
Elderly染色方法在对皮肤和硬组织等类型标本的染色效果较好，且背景染色较少。
Elderly染色法还可以在镜下观察β-半乳糖苷酶活性的分布情况，对于研究β-半乳糖苷酶与细胞老化的关系具有重要意义。
不同类型标本的衰老相关β-半乳糖苷酶染色方法各有优劣。
研究者在选择染色方法时需要根据标本类型和研究需求进行选择，以获得准确的实验结果。
随着科学技术的不断进步，相信在未来会有更多更高效的β-半乳糖苷酶染色方法出现，为衰老研究提供更多的可能性。
β-Galactosidase (β-Galactosidase) is amon enzyme that plays an important role in the aging process of cells and tissues. Therefore, studying the expression and activity of β-Galactosidase in the aging process of different types of specimens is of great significance for understanding the mechanism of aging. In laboratory studies, staining methods are required to detect the activity and expression of β-Galactosidase. This article will in troduce severalmonly used β-Galactosidase staining methods andpare their application effects in different types of specimens.I. X-gal StainingX-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) is amonly used substrate for β-Galactosidase, which can behydrolyzed by β-Galactosidase to produce a blue precipitate. X-gal staining method is simple and quick, and is widely used for the detection of β-Galactosidase activity in cells and tissues. However, X-gal staining may not be effective for some types of specimens, such as skin and hard tissues, and background staining may occur.II. ONPG StainingONPG (o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) is also amonly used substrate for β-Galactosidase, which reacts with β-Galactosidase to produce a yellow product. Compared to X-gal staining, ONPG staining has better staining effects on hard tissues and skin specimens, with less background staining. However, ONPG staining method requires a longer reaction time and is relatively moreplex to perform.III. Elderly StainingElderly staining is a relatively new β-Galactosidase staining method, which uses Elderly substrate to react with β-Galactosidase to produce a purple product. Elderly staining method has good staining effects on skin and hard tissue specimens, with less background staining. In addition, Elderly staining method allows for the observation of the distribution ofβ-Galactosidase activity under the microscope, which is of great significance for studying the relationship between β-Galactosidase and cell aging.In summary, there are advantages and disadvantages to the different β-Galactosidase staining methods for aging-related specimens. Researchers should choose a staining method based on the specimen type and research requirements to obtain accurate experimental results. With the continuous advancement of scientific technology, it is believed that more efficient β-Galactosidase staining methods will emerge in the future, providing more possibilities for aging research.Expanding on the current information, further detail on the significance of β-Galactosidase in the aging process and the potential implications of studying its activity in different tissues can be provided.β-Galactosidase is an enzyme that is involved in the breakdown of lactose, which is a sugar found in milk and dairy products. In addition to its role in lactose metabolism, β-Galactosidase has been implicated in the aging process of cells and tissues. As we age, the activity of β-Galactosidase may change, leading toalterations in cellular function and contributing to the aging phenotype.Studying the expression and activity of β-Galactosidase in different tissues can provide valuable insights into the mechanisms underlying aging. For example, in skin tissue, changes in β-Galactosidase activity may be associated with the breakdown of extracellular matrixponents, leading to decreased skin elasticity and wrinkle formation. In muscle tissue, alterations in β-Galactosidase activity may impact the turnover of cellularponents, affecting muscle function and strength.Furthermore, β-Galactosidase activity has been linked to cellular senescence, a state of irreversible cell cycle arrest that is associated with aging. By examining the distribution and activity of β-Galactosidase in senescent cells, researchers can gain a better understanding of the molecular pathways involved in the aging process. This information may have implications for the development of novel therapies aimed at mitigating age-related changes in tissues and organs.In addition to its role in aging, β-Galactosidase has been studied in the context of various diseases, including lysosomal storagedisorders and cancer. Understanding how β-Galactosidase activity is altered in these pathological conditions can provide important insights for the development of targeted therapies.Overall, the study of β-Galactosidase in the context of aging and disease holds promise for uncovering novel mechanisms underlying tissue dysfunction and age-related pathologies. By leveraging the different staining methods available, researchers can gain aprehensive understanding of β-Galactosidase activity in various tissues, paving the way for the development of interventions to improve healthspan and quality of life in aging populations.。
β-半乳糖苷酶(LACZ)酶活测定
警示：在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性，要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。
作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。
麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险。
法律声明β-半乳糖苷酶（LAC Z）酶活测定1. 在冰上解冻样品，同时准备裂解液（见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项）。
2. 准备若干(至少每个样品3个和空白一支)透明的塑料比色皿，每支装有500μl的碳酸钠终止液。
你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。
3. 在微量离心试管中加入如下试剂：400μl 磷酸钠盐缓冲液（pH 7.5）133μl ONPG溶液6μl 镁离子溶液4. 把反应混合物放置在37°C的水浴中或者加热垫上预温育。
5. 一旦预热后，加入如下物质：60μl 细胞萃取物比较明智的做法是同时做阴性对照，即用抽提物或不表达β-半乳糖苷酶的细胞抽提物代替前述的细胞抽提物。
6. 留心观察每个反应试管里黄色（o-硝基酚）的出现，在适当的时间点，从每种反应混合物中等量移取100μl的溶液，把它加到装有碳酸钠终止液的比色皿中。
7. 当完成所有时间点测定后，在420 nm处测光密度，记录吸光值，并且计算吸光值与时间的斜率。
斜率和β-半乳糖苷酶的活性成正比。
注意：若在420nm处吸光值高于1.0，则不能采信。
8. 在计算其实际活性时，先制作o-硝基酚标准曲线图，然后根据样品的吸光值在曲线上找出对应的浓度。
一个酶活力单位是指酶在37ºC每分钟可催化产生1 μmol的o-硝基酚。
收集和裂解细胞的注意事项细胞培养物的收集1. 在适当的培养时间，取出1.6 ml的培养物放入微量离心管中，并把它置于冰上。
2. 迅速将1.6 ml样品在涡旋混匀器上振荡，然后移出100μl放入已装有900 μL新鲜培养基的比色皿中。
离心剩下的1.5ml样品，去掉上层清液，把沉淀迅速放在-80°C冷藏。
β-半乳糖苷酶的测定方法
β-半乳糖苷酶的测定方法嘿，咱今天就来聊聊β-半乳糖苷酶的测定方法。
你可别小看这个酶呀，它在好多领域都有着重要的作用呢！要说测定它的方法，那就像我们生活中找东西一样，有好多种途径呢。
比如说，有一种方法就像是拿着一个特别的“探测器”，能准确地找到β-半乳糖苷酶的存在。
这种方法通过一些特定的化学反应，让酶显现出来，就好像它在跟我们玩捉迷藏，而我们通过这个“探测器”一下就把它给抓住啦！还有一种方法呢，就像是给β-半乳糖苷酶做一个特殊的“标记”，然后我们就能根据这个标记轻松地找到它啦。
是不是很神奇呀？这就好比你在一群人中，一眼就能认出那个穿着特别衣服的人一样。
另外呢，也有利用仪器来测定的方法。
这些仪器就像是超级厉害的“眼睛”，能看到我们肉眼看不到的东西。
它们能精确地检测到β-半乳糖苷酶的各种特征，然后告诉我们结果。
你想想，这多厉害呀！那这些方法都有啥优缺点呢？嗯，就像人无完人一样，每种方法也都有它自己的特点。
有的可能很灵敏，稍微有一点β-半乳糖苷酶就能检测出来，但操作可能会稍微复杂一些；有的可能操作简单，但是准确性可能就没那么高啦。
这就好比有的鞋子好看但可能不太舒服，有的鞋子舒服但样子可能没那么好看，你得根据自己的需求来选择呀！在实际应用中，我们得根据具体情况来选择合适的测定方法。
要是要求特别高的精度，那咱就得选个厉害点的方法；要是只是大概了解一下，那简单点的方法也够用啦。
这就跟咱出门一样，要是去重要场合，那肯定得精心打扮一下；要是只是下楼取个快递，那就随便穿穿就行啦。
而且呀，不同的领域对β-半乳糖苷酶的测定要求也不一样呢。
在生物研究中，可能需要非常精确的数据；在工业生产中，可能更注重速度和成本。
这就好像不同的比赛有不同的规则一样，我们得根据比赛的要求来调整策略。
总之呢，β-半乳糖苷酶的测定方法有很多，我们得好好了解它们，才能在需要的时候选出最合适的那个。
这可不是一件容易的事儿呀，但只要我们用心去学，肯定能掌握好的。
β-半乳糖苷酶活性分析
β-半乳糖苷酶活性检测nifH-lacZ表达的β-半乳糖苷酶活性测定：（1）液体活化待测菌株，将待测菌株接种于5ml含适当抗生素的液体L3基本培养基中，37℃摇床，250rpm振荡，过夜培养；（2）收集菌体，并用无氮的L3基本培养基洗2次；（3）将菌液用不含氮的L3培养基稀释至OD600=0.2~0.4；（4）将4ml菌液注射至事先配气的血清瓶中（空气+氩气，调整合适的氧气浓度，微好氧3%），37℃，200rpm诱导3.5~4hr（每个样品3个重复）；（5）取出2ml样品于离心管中，100μl用于测定β-半乳糖苷酶活性，其余用于测定OD600；（6）100μl样品加到2ml离心管中，加入900μl Z-Buffer混匀，加入20μl 0.1%SDS，40 μl 氯仿，振荡20~30sec，同时设两个空白对照，加入100μl不含菌体的培养基作为样品，其余与测试样品的处理完全一致；（7）样品和ONPG (4mg/ml)置于28℃水浴平衡5~10min，依顺序加入200μl ONPG并准确计时，直至样品变黄，加500μl 1M Na2CO3溶液终止反应，准确记录反应时间；（8）离心12000rpm，15min，取上清测定OD420和OD550。
按以下公式计算β-半乳糖苷酶的活性：（T：反应时间，V：反应中菌体体积）β-半乳糖苷酶活性分析试剂:（1）Z-buffer：16.1g/L Na2HPO4·7H2O；5.5g/L NaH2PO4·H2O；0.75g/L KCl；0.246g/L MgSO4·7H2O；调pH至7.0，121℃灭菌30min，室温可保存一年。
（2）Z-buffer/β-ME ：100ml Z-buffer中加入0.27ml β-巯基乙醇。
（3）ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷): 提前两小时将ONPG溶于Z-buffer/β-ME中，浓度为4mg/ml，-20°C保存。
β-半乳糖苷酶活性检测
β-半乳糖苷酶活性检测材料及试剂准备：材料准备：1.5ml无菌离心管若干、计时器等。
试剂准备：（1）ONPG（O-nitrophenyl β-D-galactopyranoside）：4 mg/mL 溶于Z buffer，混匀，调节至pH 7.0。
ONPG 需要1-2 h 溶解，每次使用时必须配制新鲜的溶液，且需避光存放。
（2）Z buffer：16.1 g Na2HPO4· 7H2O，5.50 g NaH2PO4· H2O，0.75 g KCl，0.246 g MgSO4· 7H2O，ddH2O定容至1000 mL，调节至pH 7.0，121℃灭菌20 min，室温可存放一年，根据需要使用前可加β-巯基乙醇2.7 mL。
（3）YPD 培养基：20.0 g Peptone，10.0 g Yeast Extract，20.0 g Glucose，蒸馏水定容至1000 mL，调节至pH 5.8，121℃灭菌20 min。
（4）SD 培养基： 1.7 g YNB (Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate)，5.0 g (NH4)2SO4，20.0 g Glucose，100 mL 10×Dropout 溶液，ddH2O 定容至1000 mL，调节至pH 5.8，115 ℃灭菌20 min。
（5）Na2CO3溶液： 1 mol/L实验步骤：(1)准备5 mL在液体SD筛选培养基中过夜培养的待测菌液。
(2) 实验当天，提前准备4 mg/mL的ONPG 溶液，用Z buffer 溶解，在摇床上摇1-2 h。
(3) 混匀过夜培养物，迅速将2 mL培养物加入8 mL YPD 培养基中，30℃，220 r/min 培养3-5 h（使OD600 值达到0.5-0.8），记录收集细胞时的OD600值。
(4) 取3个1.5 mL离心管，每个离心管内收集1.5 mL的培养物，14000 r/min 离心30 s。
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β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）
1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）
2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；
3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；
4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟；
5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；
6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度；
7、计算β-半乳糖苷酶酶活力：
Miller Units = 1,000×[(OD420－1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数；
OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；
t ----显色反应时间(单位min)；
V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。
Z buffer (总体积100 ml)：
Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 g
NaH2PO4·H2O 40mM 0.624g
KCl 10mM 0.07455g
MgSO4·7H2O1mM 0.0246g
β-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl
加水到总体积90 ml，待试剂溶解后调pH 至7.0，最后定容到100 ml，4℃储存。
Substrate solution(总体积10ml)----现用现配
Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 g
NaH2PO4·H2O 40mM 0.0624g
ONPG 4mg/ml 0.04g
终止液（100ml）：
Na2CO3 1M 10.6g。