LBA4404电击 电转感受态细胞使用说明
EPI400电击感受态细胞使用手册
EPI400电击感受态细胞EPI400 Electroporation Competent CellEPI400电击感受态细胞基因型：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG trfA tonA pcnB4 dhfrEPI400电击感受态细胞说明：EPI400电击感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。
该菌株来源于EC100菌株，将EC100核基因中控制质粒拷贝数的pcnB基因删除后引入一个诱导启动子驱动的pcnB基因，即是EPI400菌株。
EPI400菌株可以降低质粒的拷贝数，特别适合于各种不稳定DNA 或毒性基因的克隆，在加入诱导剂CopyCutter Induction Solution后又可以提高质粒产量到正常状态。
[mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI400菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。
recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
lacZΔM15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，tonA赋予其抗噬菌体T1和T5的能力，rpsL赋予其链霉素抗性。
EPI400电击感受态细胞适用于不稳定DNA 或毒性基因的克隆，经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>1010 cfu/μg DNA。
EPI400电击感受态细胞操作方法：1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的EPI400电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。
LBA4404感受态细胞使用说明
LBA4404感受态细胞LBA4404Competent Cell规格:LBA4404 ：10×100μlpCAMBIA2301（control vector）：10ng/ul 10ul保存条件：-80℃说明：华越洋生产的LBA4404 农杆菌感受态细胞具有链霉素和利福平抗性，适用于玉米、烟草等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301 质粒检测转化效率高达103cfu/μg。
操作方法:1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上或室温融化。
2. 每100μl 感受态加1ug 质粒DNA 混匀，依次于冰上静置10 分钟、液氮 5 分钟、37℃ 5 分钟、冰浴5 分钟。
3. 加入700μl 无抗生素的2YT 或LB 液体培养基，于28℃振荡培养2~3 小时。
4. 5000rpm 离心1 分钟收菌，留取100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的2YT或LB 平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3 天。
注意事项:1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 混入质粒时应轻柔操作。
3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
关联推荐大肠杆菌感受态细胞TOP10 感受态细胞XL1-Blue 感受态细胞XL10-Gold 感受态细胞Stbl3 感受态细胞DB3.1 感受态细胞DH10BAC 感受态细胞DH5α 感受态细胞JM109 感受态细胞BL21(DE3) 感受态细胞BL21(DE3)plysS 感受态细胞M15 感受态细胞Mach1-T1 Phage Resistant 感受态细胞 Rosetta(DE3) 感受态细胞DH10B 感受态细胞OrigamiB(DE3) 感受态细胞OmniMAX2-T1 Phage Resistant 感受态细胞 JM110 感受态细胞 农杆菌感受态细胞LBA4404 感受态细胞AGL1 感受态细胞EHA105 感受态细胞 GV3101 感受态细胞 酵母感受态细胞Y1HGold感受态细胞 AH109感受态细胞 Y187感受态细胞 EGY48感受态细胞 NMY51感受态细胞 KM71感受态细胞。
嗜水气单胞菌感受态细胞的制备
嗜水气单胞菌电转化感受态细胞的制备（1）将嗜水气单胞菌单菌落接种于 5 mL LB 培养基中,在30℃下振荡培养5h。
取5mL培养液倒入100 mL LB培养基(用500 mL三角瓶)中,在30 ℃下振荡(300 r/min)培养至OD600为0.9-1.0(2) 将培养物在冰水中放置15-30分钟,然后倒入500ml的离心瓶中,在4℃下1000g离心15分钟,弃去上清液。
用100ml冰水悬浮细胞,1000g离心20分钟(3)弃上清,用10ml冰冷的10%甘油悬浮细胞,1000g离心20分钟。
(4)重复步骤3一次。
(5)用冰冷的GYT培养基悬浮沉淀,分装的40uL样品可直接用于电转化或保存于-80 ℃,备用嗜水气单胞菌的电转化（1）将电转仪参数调至2.5 kv,时间5ms,电容5μF,脉冲阻抗控制在400-1000Ω。
(2)从冰箱中取出感受态细胞,在冰上解冻。
在管中加入质粒1-2uL,轻旋以混匀内容物,在冰上放4-5 min。
同时把电击杯放置冰上预冷。
(3)将转化混合物转移到电击杯中,吸干杯的外表面,放入电转化仪的样品槽中。
(4)充电到1.25kV,放电,进行脉冲电转化。
(5)取出电击杯,加入1mL LB培养基后,用移液器反复吹打,然后将菌液转移到无菌的离心管中,30℃中振荡培养120min。
(6)取200-800 uL涂布于含有氯霉素的LB平板上。
(7)将平板置于室温直至液体被吸干。
30℃倒置培养,转化菌落在12-48h内出现GYT培养基：10%(v/v)甘油0.125%(m/v)酵母提取物0.25%(m/v)胰蛋白胨使用0.22um滤器过滤除菌，分装成2.5ml一份，保存于4℃。
北京细胞电转仪操作流程
北京细胞电转仪操作流程
一．准备工作
1. 将设备放置在室内稳定干燥处，以防灰尘污染仪器；
2. 将仪器与220V交流电源接通，打开设备拉开保护杆，仪器开机后可以正常使用；
3. 将需要的池放置好；
3. 确认仪器与计算机的接头连接稳定；
4. 打开计算机，打开文件里的细胞电转仪软件，准备开始实验；
二．操作步骤
1. 确认实验池的位置；
2. 打开细胞电转仪软件，点击“启动细胞”按钮，启动实验；
3. 旋转控制杆，调整池深浅，控制杆右侧点击“脉冲输出”按钮，产生细胞间脉冲；
4. 点击“总览”按钮，屏幕上出现实验池的图像，下方可显示实验池的相关信息；
5. 点击“参数设置”按钮，完成参数设置；
6. 点击“数据录入”按钮，完成数据录入；
7. 点击“数据记录”按钮，完成数据记录；
8. 点击“数据报表”按钮，完成数据报表；
9. 点击“总结”按钮，完成测试结果分析；
10. 完成实验后，录入实验结果，存档，备份；
三．实验结束
1. 将实验池清洗干净；
2. 关闭细胞电转仪软件，关闭计算机；
3. 关闭仪器的供电源；
4. 收好设备；。
感受态细胞操作步骤
感受态细胞(DH5α，，TOP10)操作步骤第一天1.配制试剂100mM CaCl2：7.35g CaCl2.2H2O /500 ml dd H2O100mM MgCl2：10.15g MgCl2.6H2O /500 ml dd H2O50%（V/V）甘油1L LB 培养基（1L dd H2O+25g LB粉末）75%（V/V）酒精配制试剂（100mM CaCl2100mM MgCl2）：称取相应质量的固体粉末将其转移到事先清洗干净的烧杯里（若有容量瓶，使用容量瓶），用超纯水清洗量筒三次，加少量dd H2O到烧杯溶解固体粉末，将烧杯里溶液加到量筒里，用少量dd H2O清洗量筒三次，将量筒定容到500 ml，将溶液加到试剂瓶里，留待消毒。
配制50%（V/V）甘油：用量筒量取250ml甘油，甘油较粘稠，加时要小心慢加，将量好后的甘油加到试剂瓶里。
用另一个量筒量取250ml dd H2O，用少量水清洗量取甘油的量筒，最终将所有dd H2O加到试剂瓶里，留待消毒。
2. 准备实验用品：1个500mL摇瓶、2个2 L摇瓶（加有锡箔纸）；3个无抗生素的LB平板（100ml dd H2O+3.7g LB粉末，可倒6-7个平板，下午1点左右做平板，所有感受态平板侧面需划两条线）；2个Kana LB平板（100ml LB加入50ul kana）；3ml巴氏吸管；1.5ml 小管（使用没有拆封过的小管，不需灭菌）1ml 枪头；200ul 枪头；4个400ml 离心管（每管实际装350ml液体）。
3. 灭菌锅消毒：100mM CaCl2；100mM MgCl2；50%（V/V）甘油；LB 培养基，dd H2O（若有灭菌水则不需灭）；500 ml 摇瓶；2 L摇瓶；1ml 枪头；200ul 枪头；6个100ml 离心管。
灭完菌后拿到烘箱中60℃烘干，试剂则放到4℃冰箱中。
4. 涂布感受态细胞平板（以DH5α为例）pm 2:30-3:00⑴戴好手套，清理干净操作台，喷洒75%酒精；⑵将三个无抗性的LB平板放在工作台上，在底部标记上DH5α及日期；⑶倒5-8个Beads在第一个平板上，将beads倾到一边，在空白处加10ul灭菌的dd H2O；⑷第一个将LB平板，移液枪、枪头一起拿到-80℃冰箱那的操作台上，从冰箱迅速拿出装有感受态细胞的管子（三中感受态细胞的管子装在一个大袋子里，灰色为DH5α，紫色为TOP10，管子上有标记），用枪头在管子中搅出一小冰块，将冰块加到10ul 水上，盖好平板盖子，将感受态细胞管子迅速放到-80℃冰箱里，整个步骤要迅速小心。
EHA105电击电转感受态细胞使用说明
EHA105电击电转感受态细胞使用说明EHA105电击/电转感受态细胞EHA105 Electroporation Competent CellEHA105电击/电转感受态细胞基因型：C58 (rif r) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) SuccinamopineEHA105电击/电转感受态细胞说明：EHA105菌株由EHA101菌株改造而来，为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。
EHA105菌株适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。
唯地生物开发的EHA105电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒(size:11633 bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pCAMBIA2301-ZH质粒（size:40 kd）检测转化效率可达5×103 cfu/μg DNA。
EHA105电击/电转感受态细胞操作方法：1.0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1-5 μg质粒DNA（质粒体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3.启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V （此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。
C43(DE3)感受态细胞使用说明书
C43(DE3)感受态细胞使用说明书OverExpress C43(DE3) Chemically Competent Cell 产品说明书产品规格OverExpress C43(DE3) ：10×100μlpUC19（control vector）：10pg/μl10μl保存条件：-80℃基因型F–ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)产品说明OverExpress C43(DE3) 、OverExpress C41(DE3) 两个菌株均起源于 BL21(DE3) ，其优点是可以高效表达毒性蛋白或疏水性蛋白。
OverExpress C41(DE3) 跟BL21(DE3) 的区别在于其基因组含有至少一个未知突变，这个未知突变使其获得了高效表达毒性蛋白（1-5）的能力，此突变位点参与大肠杆菌表达毒性蛋白时的细胞死亡途径；OverExpressC43(DE3) 来源于OverExpress C41(DE3) ，是通过筛选OverExpress C41(DE3)对另一个不同毒性蛋白的抗性菌株获得。
OverExpress C43(DE3) 菌株具有比OverExpress C41(DE3)更强的表达毒性蛋白和疏水性蛋白的能力，所以说OverExpress C43(DE3)菌株与BL21(DE3)相比拥有至少两个未知突变，正是这两个未知突变使其获得了更广泛的表达毒性蛋白或疏水性蛋白的能力。
此菌株含有DE3区，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。
High5TM系列OverExpressC43(DE3) 感受态细胞由特殊工艺制作，经pUC19质粒检测转化效率可达5×108 cfu/μg DNA。
操作方法1. 取100 μl冰上融化的OverExpress C43(DE3)感受态细胞，加入目的DNA并用指尖轻轻拨打管底混匀(避免用枪吸打)，冰上静置25分钟。
电感受态细胞制备
根据诸多文献，提出如下红球菌电转化感受态细胞制备方案：1.接种一环红平红球菌/紫红红球菌到LB培养基里，30°C，170转/min 过夜培养。
2.取1.0-1.5ml过夜培养菌液，4000转/min离心3min,无菌水洗涤，重新离心一次，重悬浮于1.0ml无菌水中。
3.转移100uL上述菌悬液到一个装有100mlMB培养基的培养瓶中(MB medium (5 g/l酵母膏, 15 g/l胰蛋白胨,5 g/l大豆蛋白胨, 5 g/l NaCl, 2.0%甘氨酸, 1.8%蔗糖，pH7.2。
灭菌后加入0.25ug/m L青霉素G)试验最佳生长培养基：LB含0.5M蔗糖；LB含0.5M山梨醇；LB含0.5M甘露醇；LB+0.5M 蔗糖+0.5M山梨醇；LB+0.5M蔗糖+0.5M甘露醇；LB+0.5M山梨醇 +0.5M甘露醇；MB培养基4. 30°C，170转/min 振荡培养过夜或者O.D.600值达到0.8-1.0之间。
5.用灭菌的离心管（10ml）或者50 ml锥形管和适当的适配器在GSA转子里以 4 000 rpm 的速度离心10分钟（如果细胞没有沉淀下来，改变离心时间和转速为4000g/min，10min）6. 倒掉上清，加入6mL预冷的蒸馏灭菌水，轻轻洗涤，4 000 rpm的速度离心10分钟。
7. 倒掉上清，再次将细胞沉淀加入到6mL预冷的5%甘油蒸馏灭菌，水轻轻洗涤，4 000 rpm 的速度离心10分钟。
8. 用6ml的10%灭菌的冰冻甘油洗涤细胞沉淀一次，4000 rpm的速度离心10分钟。
（重复一次）9. 用6ml的10%灭菌的冰冻甘油洗涤细胞沉淀一次，4000 rpm的速度离心10分钟。
10. 用5ml（20倍浓缩）或更少（40倍浓缩）的灭菌冰冻甘油对细胞沉淀进行重悬浮11. 按120μl等份装入灭菌的微型离心管中于-80°C储藏电转化：1.取400uL冷冻红球菌感受态细胞2.加入1uL质粒DNA(0.5ug),轻轻混匀，冰上放置30min(500ng/400ul=125ng/ul)3.将上述感受态细胞—质粒DNA混合物转移到预冷的0.2cm的电击杯内4.设置电击参数为：电压2.5kV,电抗400Ω，电容25.0uF,脉冲7.0ms5.电转后立即加入1mLLB培养基，30℃培养3h6.适当稀释后涂布LB培养基。
LBA4404根癌农杆菌使用说明
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
转入的双元载体 T-‐DNA 顺利转移）。 pAL4404 型 Ti 质粒含有筛选标签：
strep，赋予 LBA4404 菌株链霉素抗性，适用于菸草、番茄、烟草等植物
的 转 基 因 操 作 。
操作说明：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓 慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。 注 意 事 项 ： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放 置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能 正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
农杆菌电击感受态的制备,转化及验证
农杆菌电击感受态的制备，转化及验证1.制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。
(2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡3-4小时，至OD560=0.5左右。
(3) 5000rpm离心5分钟，去上清。
(4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min.(5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。
(6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟，(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/管)备用。
2 农杆菌感受态的电转化〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。
(2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。
(3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。
(4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培养基平板上，28℃培养2-3天。
其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入感受态制备及转化方案二1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
bio电转仪使用手册
bio电转仪使用手册一、简介与概述本手册旨在为您提供bio电转仪的使用方法、操作步骤以及维护保养等方面的详细指导。
电转仪是一种高效、便捷的将生物大分子、细胞等样本转移到靶细胞或试剂上的设备。
通过使用电转仪，您可以实现实验室研究、药物筛选、基因转移等多方面的应用。
在开始使用电转仪之前，请务必仔细阅读本手册，以确保安全、正确地操作设备。
二、操作步骤1.准备工作a.设备开机：将电源线插入电源插座，按下设备开关，待设备启动后进行下一步操作。
b.样本准备：根据实验需求，将待转染的样本（如细胞、质粒、寡核苷酸等）制备好，放入电转杯中。
c.设置参数：根据实验需求，设置电转参数，如电压、电流、时间等。
您可以参考设备说明书或预先设定的参数进行调整。
2.电转过程a.细胞转染：将电转杯放入设备上，按照设定的参数进行电转。
电转过程中，请确保细胞紧密排列，以获得更好的转染效果。
b.质粒转染：将质粒DNA与转染试剂混合后，放入电转杯中，按照设定的参数进行电转。
注意在转染过程中，保持试剂盒的稳定性。
c.其他样品转染：根据样品性质，选择适当的转染方法，如脂质体介导转染、慢病毒转染等，并按照相应步骤进行电转。
3.转染后处理a.清洗设备：实验结束后，及时关闭设备电源，用清水冲洗设备表面，避免残留物影响设备性能。
b.样品收集与检测：根据实验需求，收集转染后的样品，并进行相应检测，如细胞活力、基因表达等。
三、设备维护与保养1.定期检查设备电源线、插头、开关等部件，确保设备正常运行。
2.保持设备工作环境干燥、通风，避免阳光直射。
3.严禁在设备表面放置重物或尖锐物品，以免损坏设备外观。
4.实验过程中，请勿让儿童、宠物接近设备，确保实验安全。
四、安全与注意事项1.操作设备时，请务必佩戴实验室防护用具，如手套、口罩等。
2.遵循实验室安全规程，避免触电、火灾等事故。
3.如有异常情况，请立即关闭设备电源，并及时联系售后服务。
五、故障排除与售后服务1.如遇设备故障，请先检查电源、电缆、插头等是否正常。
Electro-Cells LBA4404 根癌农杆菌 说明书
Agrobacterium tumefaciensElectro-Cells LBA4404使用说明书Takara Code : D9115包装量Electro-Cells LBA440440 μl × 5 支Control DNA（pRI900，1 ng/μl）10 μl × 1 支保存: -80℃制品说明根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中包含有一个诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
农杆菌通过侵染植物伤口，可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合。
Agrobacterium tumefaciens LBA4404含有经过改造的Ti质粒pAL4404，其只含有vir和ori区域，T－DNA区被删除。
利用LBA4404进行植物基因转导时，需要与合适的双元载体配合使用，如：pRI909，其含有T－DNA区，此区中的致瘤基因被删除，并插入了适当的选择标记和多克隆位点。
实验时，将目的基因插入双元载体，将其电转化至LBA4404中，重组的DNA可以通过pAL4404质粒上的vir区来感染植物细胞，将外源基因整合到植物细胞的染色体DNA 上。
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells可用于介导植物基因的转化，实现外源基因向植物细胞的转移与整合，从而达到植物基因改造的目的。
大肠杆菌电击转化流程
大肠杆菌感受态制备及电转化流程1.细菌电转化感受态细胞的制备准备：50mL离心管3个10%甘油≥200mL 灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。
晚上将新鲜的菌落接种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转速控制在200rpm；2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；3）将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管，然后至于冰水混合物中骤冷，一定要骤冷，冰水混合物中冷却至少15min（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）3）将离心管于4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体，弃上清；4）用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，再重复一次；5）再用10%甘油重复步骤4）两次，4000rpm离心10min，最后一次倒尽上清后，再用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100μL/支（一般，25mL起始培养物最终用200-250μL l0%甘油悬浮）；6）放入-80℃冰箱中速冻。
或者立即用于电转化。
注意：1）菌种最好是-80℃冻存的，活化后生长状态较好。
2）20ml培养过夜，振荡速度不要过高（一般应该是37℃，300rpm，6h，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在200rpm，可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）3）培养完毕后一定要骤冷，是培养物在短时间内迅速冷却。
冰水混合物中摇动瓶子，大约15min。
4）使用的器皿一点要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，再加入NaOH 固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。
TOP10感受态细胞使用方法
TOP10感受态细胞TOP10 Competent CellTOP10感受态细胞基因型：F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1araΔ139Δ(ara-leu)7697galUgalKrpsL(StrR)endA1nupG产品说明：TOP10感受态细胞是目前最常用的感受态细胞，生长速度快，转化效率高，recA1和endA1的突变有利于DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
特殊工艺制作的TOP10感受态细胞经pUC19质粒检测转化效率高于108cfu/μg。
本产品是大肠杆菌TOP10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA 的热击转化。
TOP10是一种常用于质粒克隆的菌株，其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。
使用pUC19质粒检测，转化率可达到108，适用于高效的质粒DNA克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。
TOP10感受态细胞特点·可用于蓝白斑筛选。
·转化效率可达108，适用于高效的质粒DNA克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。
·长时间保存于-80 ℃，转化效率不发生改变。
TOP10感受态细胞操作方法：1.取100μl冰上融化的TOP10感受态细胞，加入目的DNA（质粒或连接产物）并轻轻混匀，冰上静置25分钟。
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基（2YT或LB），混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
TOP10感受态细胞注意事项：1.感受态细胞最好在冰上融化。
2.混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
3.转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
电击法制备感受态细胞
电击法制备感受态细胞电击法制备感受态细胞，听上去就像是个科学实验里的魔法吧？这个过程就像是给细胞来一场“电击派对”，让它们兴奋得不得了，主动接受外面的东西。
哎呀，说到这里，大家可能会想，这种“电击”是不是很可怕呢？其实不然，科学家们用的可是温和的电流，目的是让细胞膜暂时打开一扇小门，像是给细胞开个玩笑，轻松一下。
这样一来，细胞就能吸收一些外来的DNA，简直就像是在给它们加点新装备，提升一下能力。
话说这电击法，可不是随随便便就能用的，得有点技术含量呢。
得准备好这些细胞，细胞的种类多得跟星星一样，要根据研究的需要来选择。
常见的有大肠杆菌、酵母菌，还有那些常常被用在实验室里的哺乳动物细胞。
选定了细胞之后，接下来就是“电击”环节啦。
把细胞放在一个特制的小盒子里，然后用电极夹住，调好电压，心里默念：“来吧，细胞们，准备好迎接这场电流的洗礼了吗？”只要电流一流过，细胞就像是喝了兴奋剂，兴奋得很，瞬间膜就打开了，像是打开了一个“秘密通道”。
不过，这个时候可得小心，电压和时间得控制得当。
太高了，细胞可能就会“被电晕”，直接挂掉。
太低了，门又打不开，白忙一场。
那感觉就像是在调试一个乐器，音准得正好才能发出美妙的音符。
电击过后，细胞就能接受那些外来的DNA了，像是收到一份意外的礼物，里面装着各种新奇的功能。
要是运气好，这些DNA还能帮助细胞生产出一些重要的蛋白质，哇，那可真是太酷了。
说到这里，有人可能会问，为什么要用这种“电击法”呢？这个方法效率高、速度快，想想看，比起传统的转染方法，简直是快得多。
传统方法就像是慢慢推销，而电击法则是突击营销，效果立竿见影，特别适合那些急需实验结果的科学家们。
再加上，电击法适用的范围也很广，能用于基因工程、疫苗研发等等，简直是“万金油”级别的存在。
不过，电击法也不是完美无瑕的，毕竟在科学的世界里，没有什么是绝对的。
比如，有些细胞对电流的敏感度不一样，有的细胞可能就特别怕这个电流，一来就直接晕厥过去。
实验五农杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
感受态细胞制备的原理
• 感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低 渗氯化钠溶液中，菌细胞壁通透性增加。
实验原理
• 转化方法：电击法、 CaCl2、 NaCl等化 学试剂法 • 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通 过时细胞的状态。 • 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( TransfoKan培养基
影响转化率的因素
• • • • 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验试剂
农杆菌LBA4404 YM培养基， 0.1mol/LNaCl溶液（预冷） 20mM CaCl2溶液（预冷） 卡那霉素（50mg/ml） 质粒DNA （上周日提取）
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基（硫酸链 霉素，25mg/ml）中，28℃条件下，250rpm悬 浮培养12-20小时。
3．在超净工作台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管 中，4℃ ，5000×rpm离心8min。 4．在超净工作台上弃上清，用100mM NaCl （4℃ 预冷）重悬农杆菌，4℃， 5000×rpm离心8min。 5．在超净工作台上弃上清，加入原始农杆菌菌液 1/50体积（800ml）的20mM CaCl2溶液重悬菌体， 并分装成500ml/管。 6．将分装后的离心管置于液氮中10秒，-80℃保存。
农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌LBA4404（抗硫酸链霉素，25mg/ml）接 种在YM平板上，26-28℃ 培养48小时。
YM培养基的配方：酵母提取物0.4g/L；甘露醇 10g/L；NaCl 0.1g/L；MgSO4 0.1g/L； K2HPO4 0.5g/L；琼脂粉 15g/L pH：7.2-7.4
AD494(DE3)感受态细胞使用说明
AD494(DE3) Competen94(DE3)感受态细胞
北京华越洋 WR4468 AD494(DE3)感受态细胞
规格
单位
20×100ul 包
20×100ul 包
AD494(DE3)感受态细胞基本信息： AD494(DE3) 基因型:
Rosseta(DE3) Stbl2 Stbl3 Stbl3 Ultracompetent Cells Sure SURE，SURE T1 TB1 TG1 TKB1 TOP10 TOP10 UltraCompetent Cells TOP10F' ,TOP10F' TOP10F` TOP10F′ UltraCompetent Cells Tuner Tuner(DE3) Tuner(DE3)，Tuner(DE3) Tuner(DE3)pLacI Tuner(DE3)pLysS XL10-Gold XL10-Gold UltraCompetent Cells XL1-Blue XL1-Blue UltraCompetent Cells XL2-Blue Y187 Y1HGold Y2HGold
菌株类型: E.coli
培养基: LB 培养基
生长条件: 37 ℃, 有氧
抗性: 卡那霉素
应用: 蛋白表达
质粒转化条件： 42 ℃热激
诱导方法: IPTG
菌株特点: 1. AD494 菌株含有 thioredoxin reductase (TrxB)基因突变，有利于细菌胞内的二硫键形
成，能够帮助蛋白形成正确的三维折叠，形成有功能活力的蛋白。 2. AD494 菌株来源于 K12 菌，有助于蛋白的形成正确的三维结构。 3. AD494 菌株中的 thioredoxin reductase (TrxB)突变具有卡那霉素抗性，因此该宿主菌
电转化大肠杆菌感受态细胞
电转化大肠杆菌感受态细胞
1．从-80︒C冰箱取出感受态细胞，置于冰上解冻。
2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。
3．将解冻的感受态细胞按照100ul/管分装至预冷的1.5ml的离心管中，混匀，冰上放置。
4．向装有感受态细胞的离心管中加入1-2 µl质粒或连接产物，并混匀，冰浴10min。
5．打开电转仪，电压为2.0 kV，电击5ms [这些参数设置可以根据经验略作调整]。
6．将混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。
并用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。
7．将电击杯推入电转仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入2X 500μl 的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
8．37︒C，220rpm复苏1小时。
9．离心，涂板，置于37︒C，过夜培养，次日观察结果。
电击与化学转化
1、电转化感受态细胞的制备（1）从平板上挑取单菌落于10 mL液体LB培养基中，适当温度、200 rpm 活化培养过夜。
（2）按1: 100将过夜培养物加入到100 mL含同样抗生素的液体LB培养基中，适当温度、200 rpm培养，直至OD600介于0.4到0.6之间。
（3）将上述培养物平均装入2支预冷的50 mL无菌离心管中，于冰上静置30 min，待培养物完全冷却至0 ℃。
（4）4 ℃、4, 000 rpm离心10 min，以回收细胞，弃去上清液，用50 mL 冰冷灭菌水重悬沉淀。
（5）4 ℃、4, 000 rpm离心10 min，弃去上清液，并用50 mL冰冷的10%灭菌甘油重悬沉淀。
（6）重复步骤（5）。
（7）于4 ℃、4, 000 rpm离心10 min，弃去上清液，倒置离心管使痕量的液体流尽。
（8）向每管中加入200 μL预冷的10%甘油重悬沉淀，并按每管50 μL分装于1.5 mL的灭菌预冷离心管中，立即使用或于-80 ℃保存。
2、感受态细胞的电击转化（1）取2 μL质粒加入到50 μL电转化感受态中，轻轻混匀，于冰中静置30 min。
（2）调解电击仪电压为1.8 kV。
（3）将感受态细胞和质粒混合物加入到预冷的电击杯内，轻击液体以确保混合物位于电击杯底部，电击转化。
（4）尽可能快地取出电击杯，并在室温下加入1 mL液体LB培养基，适当温度、200 rpm培养45 min到1 h。
（5）收集菌体并涂布于含有适当抗生素的固体LB培养基上，倒置平板，于适当温度培养至长出菌落。
3、用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞（300ml----2ml含15%甘油的CaCl2溶液重悬，每管100μL）（1）从平板中挑取大肠杆菌单菌落于10 mL液体LB培养基中，37 ℃、200 rpm培养过夜。
（2）按1: 100的比例将过夜培养物加入到50 mL液体LB培养基中，37 ℃、200 rpm培养，直至OD600介于0.4到0.6之间。
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LBA4404电击/电转感受态细胞
LBA4404 Electroporation Competent Cell
LBA4404电击/电转感受态细胞基因型：
Ach5 (rif r) Ti pAL4404 (strep r) Octopine
LBA4404电击/电转感受态细胞说明：
LBA4404菌株为Ach5型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404，此质粒含有vir基因(vir 基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。
pAL4404型Ti质粒含有筛选标签：strep，赋予LBA4404菌株链霉素抗性，适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作。
唯地生物开发的LBA4404电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒(size:11633 bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pCAMBIA2301-ZH质粒(size:40 kd)检测转化效率可达103 cfu/μg DNA。
LBA4404电击/电转感受态细胞操作方法：
1.0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正
置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面
0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1-5 μg质粒DNA（质
粒体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。
3.启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推
荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。
4.6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生
素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50 μg/ml kan 时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 时，需
28℃培养60h；如果使用的平板含有50μg/ml rif 则需要28℃培养72-90h）。
注意事项：
1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化
效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2.混入质粒时应轻柔操作。
转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3.平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大
的菌落，应减少质粒用量。
4.利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速
度和转化效率。
本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒
筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。
LBA4404电击/电转感受态细胞保存条件：-80℃
华越洋LBA4404电击/电转感受态细胞相关：
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Rosetta-gami 2(DE3)pLacI感受态细胞TKB1感受态细胞
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Stbl3超级感受态细胞Stbl3感受态细胞
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TOP10F′超级感受态细胞EHA105感受态细胞
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Rosetta(DE3)感受态细胞Y1HGold酵母感受态细胞
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Rosetta(DE3)pLacI感受态细胞AH109酵母感受态细胞
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Rosetta 2(DE3)pLySs感受态细胞EGY48酵母菌感受态细胞
Origami B感受态细胞XL1-Blue感受态细胞
Origami 2(DE3)pLysS感受态细胞DH10Bac感受态细胞
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XL1-Blue化学感受态细胞stbl3感受态细胞，stbl3感受态细胞DH5α超级感受态细胞BL21 Star(DE3)感受态细胞
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BL21(DE3)pLacI感受态细胞EHA101农杆菌感受态细胞
BL21 trxB(DE3)感受态细胞TG1感受态细胞
BL21 trxB(DE3)pLysS感受态细胞XL10-Gold 感受态细胞
Mach1-T1 Phage Resistant 感受态细胞农杆菌感受态细胞
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DH10bac (BmNPV)克隆感受态细胞。