胶原支架材料的制备与表征_谢德明(来源：中国知网付费下载)

第26卷第3期2006年6月 暨南大学学报(自然科学版) Jour nal of Ji n an University(Natura l Sc ience)Vo.l 27N o .3Jun .2006[收稿日期] 2005-09-14[基金项目] 广东省十五重点攻关计划资助项目(A302020104)[作者简介] 谢德明(1970-),男,副研究员,博士,研究方向:生物材料与组织工程胶原支架材料的制备与表征谢德明, 施云峰(暨南大学生物医学工程系,广东广州510632)[摘 要] 分别采用真空高温脱水和化学交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺处理经冷冻干燥后的胶原海绵材料,制备组织工程支架,讨论反应条件对胶原性能的影响,测定胶原支架的力学强度和降解特性.结果发现,不同的处理方法都能保持胶原海绵的三维多孔结构,孔隙率可达到90%;真空高温脱水获得的胶原海绵材料力学强度较小,但断裂伸长率略大;碳化二亚胺交联胶原海绵材料力学强度相对较高,抗张强度为380kPa 左右.胶原海绵交联后,降解速率显著小于未经交联的胶原材料.细胞培养试验表明成纤维细胞可以在支架材料上正常生长.两种交联方法处理胶原海绵,其细胞生长行为差异无显著性,适合于作为组织工程支架.[关键词] 胶原蛋白; 交联; 支架材料; 组织工程[中图分类号] R 318 [文献标识码] A [文章编号] 1000-9965(2006)03-0439-05Preparation and characterization of collagen astissue engineeri ng scaffol dXI E De -m i n g , S H I Yun -feng(D epart ment o f B i om ed i ca l Eng i neer i ng ,Jinan U n i versity ,Guangzhou 510632,Ch i na)[Abstract] The bio m ateria ls of po r ous collagen sponge had been prepared by dehydro -ther m a l treat m entm ethod and usi n g 1-ethy l -3-(3-di m et h y l a m i n opr opy l )car bo -d ii m i d e (EDC)as a che m ical cr oss-li n k i n g respectively .The reaction conditi o ns wh ichm ight a ffect the pr operties o f the m odified co llagen sponge w ere discussed and ,deter m i n ed the rate of degradati o n i n ba lancing salt solution and ,the por osity degree o f t h e sponge sca-f fo lds ,and its m echa n ica l properties w ere also eva l u ated in v itr o .The results sho w that the m ax i m u m tension strength reached 380kPa by EDC cross-linking ,and the m ateri a lswh ich treated by dehydrother m al under vacuu m had slo w deg radation .The inherent por ous charac -ter of co llagen sponge cou l d be kept after t h e t w o treat m ents and had a porosity of 90%.The trial of ce lls culture i n d icated that t h e cells g r o w th behav i o r had no d istinct d ifference w hen the fibr ob lasts w ere seeded i n the collagen scaffo l d m odified before and after .[Key w ords] co llagen ; cr oss-li n k i n g ; scaffold ; tissue eng i n eeri n g440暨南大学学报(自然科学版)2006年胶原蛋白是动物结缔组织的主要结构成分,来源于不同种类动物的胶原具有极其相似的化学和生物学特征,同时胶原具有低免疫原性,而且来源广泛,具有特殊的生物相容性和生物可降解性,是最早被应用的天然生物材料[1].胶原具有特异性的分子识别信号,可促进细胞的黏附和增殖,诱导细胞的分化,可为细胞生长提供支架.胶原在体内降解为各种氨基酸,安全无毒、无刺激性、无致敏源.因此,胶原材料被广泛用作组织工程培养细胞的支架材料.但是,胶原材料的力学性能差,而且在体内体外应用时降解速率高,容易为体内的胶原酶分解,限制了其应用.为了获得一种具有合适的机械强度和可加工性能的胶原支架材料,很多学者进行了各种尝试,如直接采用动物组织脱细胞后的基质作为细胞培养支架[2],或者在具有较高强度的合成高分子材料表面固定胶原[3],而其中最为多见的方法就是对胶原进行化学交联.采用化学交联剂使胶原分子间形成交联键,甲醛、戊二醛、六次甲基二异氰酸酯等是常用的交联剂,除此以外,甲壳糖等天然或合成阳离子大分子物质也可起到交联作用.但是,化学交联剂往往具有细胞毒性,不适合于组织工程支架材料的制备.据文献报道,碳化二亚胺是一类具有良好生物相容性的化学交联剂[4],本文利用碳化二亚胺处理胶原海绵,并与物理交联法进行对比,研究交联前后胶原海绵的力学强度和降解行为,探讨适合于组织工程支架应用的胶原材料成型制备方法.1材料与方法1.1试剂与材料胶原,猪皮中提取Ⅰ、Ⅲ型,实验室自制;1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC),AR,ACROS公司;N-羟基琥珀酰亚胺(NH S),AR,ACROS公司;2-(N-吗啉)乙撑磺酸,AR,F ARCO公司;胃蛋白酶(2500U/mg),SI G MA;胎牛血清,DME M,GI BCO B RL公司.1.2试验方法(1)胶原海绵的制备.将自制的猪皮胶原样品溶解于0.1m ol/L的乙酸溶液中,8000 r/m in冷冻离心30m i n后,取上清液.超声波处理5m in,然后将胶原溶液倒入直径5c m的培养皿中,-20e预冻2h,置于真空冷冻干燥机冻干24h,得多孔胶原海绵.(2)胶原海绵的交联.化学交联法:将3c m@3c m的胶原海绵浸入50mL含50mm o l/L 2-(N-吗啉)乙撑磺酸(M ES)的体积分数为40%的乙醇溶液中,室温下浸泡30m in.加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)65m g和N-羟基琥珀酰亚胺(NH S)15m g,摇动使之溶解,室温下反应数小时.分别用0.1m o l/L N a2H PO4、1m ol/L N a C l 和蒸馏水冲洗胶原海绵,再次冷冻干燥.物理交联法:将3c m@3c m的胶原海绵置于真空干燥箱,50e干燥3h,80e下继续干燥0.5h,然后升到所需温度,干燥适当时间.复合交联法:将3c m@3c m的胶原海绵置于真空干燥箱,120e下处理3d,然后再进行化学交联.(3)机械强度测试.将胶原海绵材料裁剪成4c m@2c m@0.2c m,固定在XL-50型拉力机上,以5mm/s速率,测试材料的抗张强度和断裂伸长率.(4)胶原海绵孔隙率的测定[5].将薄膜状胶原海绵卷成团,称重(m s);然后将其浸入盛满乙醇,质量为m1的比重瓶中,使乙醇充分充盈于胶原海绵孔隙中,脱气,加满乙醇,并称重,质量计为m 2;取出胶原海绵后,称量剩余乙醇与比重瓶质量,计为m 3.孔隙率按照如下公式计算:孔隙率(E )=m 2-m 1-m sm 1-m 3@100%(5)降解速率测定.将胶原海绵样品置于生理盐水中,37e 水浴恒温、振荡.定期取样按照文献[6]方法检测降解液中羟基脯氨酸含量,以计算胶原蛋白的降解速率.(6)细胞培养试验.胶原海绵材料经紫外线辐射消毒处理,接种小鼠胚胎成纤维细胞,37e 体积分数5%CO 2条件下培养一定时间,弃去原培养液,PBS 冲洗,然后往培养瓶中分别加入新鲜培养液D M E M 3mL ,5m g /mL MTT 液200L L ,培养箱中孵育4h ,加入异丙醇裂解液2mL ,转入多孔培养板后,用酶标仪测量吸光度(A ),评价细胞在材料上的生长增殖情况.2 结果与讨论2.1 不同交联方法获得的胶原海绵力学性能比较EDC 是一种高效的交联剂,在低温下就能发生反应.表1所示为不同反应时间下得到的 表1 EDC 交联反应时间对胶原海绵力学性能(½x ?s)的影响1)t /h 抗张强度/kP a 断裂伸长率/%045.7?12.1-184.3?25.368?1.634139.0?45.281?2.368379.0?31.772?1.8416381.0?31.571?2.3224381.0?63.272?1.9348382.0?40.170?1.751)表中数据为5次平行测定的结果胶原海绵材料的力学性能测试结果.从表1中数据可以看出,随着与EDC 交联反应时间的延长,胶原海绵的强度显著增大,交联反应8h ,抗张强度约380kPa ,是交联前的约9倍,同时其断裂伸长率达到72%.反应时间的进一步延长对材料的强度影响不大.表2结果可见,热交联方式对胶原海绵的抗张强度改善不显著,其最佳条件即120e 1.79kPa 下,处理3d ,得到的胶原海绵强度约为EDC 交联海绵强度的1/4,103kPa ,但是其断裂伸长率略大于EDC 处理的胶原海绵材料,为98%.可见,热交联处理后海绵强度比化学交联差,其原因是化学交联能更加有效地在胶原分子间形成交联键.表2 真空加热干燥处理对胶原海绵力学性能(¸x ?s)的影响1)处理条件H /e t /d 抗张强度/kP a 断裂伸长率/%处理条件H /e t /d 抗张强度/kP a 断裂伸长率/%80139.8?3.875?2.3120180.7?4.372?4.680247.6?9.077?1.6120288.4?2.189?3.080345.1?6.580?1.41203103?3.898?5.280441.3?8.3103?3.1120482.5?7.956?2.680541.7?4.3112?2.8120582.9?5.258?7.4100140.5?1083?1.9140148.5?11100?4.1100243.6?6.385?0.8140258.7?3.783?6.2100349.2?5.589?3.5140367.3?6.474?5.4100445.5?8.4101?2.2140469.1?8.655?1.9100558.7?6.493?1.7140555.9?3.353?2.71)维持真空度为1.79kPa ,5次平行测定结果441第3期谢德明,等: 胶原支架材料的制备与表征2.2 不同制备方法对胶原海绵孔隙率的影响测定不同制备方法获得的胶原海绵的孔隙率.冷冻干燥胶原海绵为(95.2?1.1)%;120e 真空干燥3d 的胶原海绵为(94.8?0.7)%;EDC 交联8h 的胶原海绵为(91.3?1.3)%;120e 真空干燥3d 后,EDC 交联8h 的胶原海绵为(89.6?0.9)%.各种不同交联方法对胶原海绵材料的孔隙率的影响不大,化学交联法得到的材料孔隙率略微减小,其原因是海绵材料在化学交联过程中,由于溶剂的作用,使孔洞发生塌陷,材料整体收缩的缘故.但是,其孔隙率仍然可达到接近90%,完全可以满足组织工程支架的要求.2.3 降解结果在胶原基质上培养细胞时,胶原的降解反应也同时进行,随着时间的延长,降解率逐渐增加.作为组织工程支架材料,要求支架材料的降解速率与细胞、组织的形成速率匹配,才能保证组织的成功构建以及新生组织具备一定的三维形态结构.传统的胶原材料在体内的降解速率太快,远远大于组织再生速率,因而不适合于作为组织贴附支架.经过适当的交联处理,可以明显增加支架强度,降低降解速率.图1描述了胶原海绵交联前后和不同交联方法处理的胶原海绵在生理盐水中,37e条件下的降解 图1 不同交联方法处理后的胶原海绵在生理盐水中的降解速率情况.在模拟条件下,经过交联处理的胶原海绵,其降解速率显著低于未交联的胶原海绵.从胶原海绵的失重情况分析,降解4个月,未交联的胶原失重达到35%,而其他3种经过交联处理的材料,相同时间内其失重不超过5%.同时,不同交联方法对胶原海绵的降解速率的影响较小,从图1中可见,此3条降解失重曲线几乎重叠.由于降解介质为37e 的生理盐水,与体内实际环境的差别较大,该降解情况并不能真实反应胶原海绵在体内的降解速率,但是可以反映出经过交联处理后,胶原海绵的降解时间可以较大幅度延长,这一点对于胶原海绵作为组织工程支架材料应用有重要的意义.可以预测,经过交联处理,胶原海绵的降解速率接近某些软组织的 图2 成纤维细胞接种到不同类型胶原海绵材料上的增殖情况再生速率,有望作为软组织工程支架材料.2.4 细胞培养图2表示在制备的不同胶原海绵支架材料上接种小鼠胚胎成纤维细胞,培养不同时间,材料上生长细胞的分析结果.细胞培养试验表明,4种不同的支架材料上,小鼠胚胎成纤维细胞均能生长良好.相对其他3种材料而言,未经过交联处理的胶原海绵更适合于细胞,这一点在细胞培养初期可以看出,接种细胞能较快地贴附于支架材料,其适应期(潜伏期)较短,接种第2天,细胞即开始快速增殖.之后,一直保持较大的细442暨南大学学报(自然科学版)2006年胞增殖速率.在此期间,经过交联处理的胶原海绵支架材料上,细胞的适应期较长,增殖速率相对缓慢.经过一周的培养,细胞在4种不同支架材料上的生长情况接近,这一点从吸光度的数据(A )可以清楚看出来.分析原因,可能有以下几个方面.首先,未经过交联处理的胶原海绵没有变性,能够完整地保持活性胶原分子的分子结构特征,维持特定的构型构象,其分子链中的活性功能区域(RGD 序列)能被细胞膜表面的整合素特异性识别,有效地介导细胞在材料上的黏附,缩短了细胞适应期,因此,细胞很快进入增殖状态.而其它3种胶原海绵材料,由于经过高温或化学反应,胶原分子失活,其特定构型不能保持,丧失了被细胞特异性识别的功能,因此,使细胞适应期延长.其次,由于各种材料的基本化学特征没有明显差异,因此,经过短暂的适应期后,成纤维细胞都能进入旺盛的增殖状态,培养时间达到8d ,其细胞数量接近相同,材料交联与否已无明显差异.另外,培养时间超过8d ,支架材料上细胞的增殖受到空间以及物质交换速率的限制,细胞生长受到抑制,其数量整体变化不似之前显著.3 结论胶原材料是迄今为止最理想的细胞生长基质,由于其力学强度和降解速率的限制,难以作为组织工程支架材料用于各种组织器官的体外构建.采用合适的方法对胶原材料进行改性,一方面保持其优良的组织和细胞亲和特性,同时又能有效提高力学性能,降低其降解速率,是胶原材料在生物材料领域得以更加广泛应用的前提.通过采用热交联和EDC 化学交联方法,一方面可以提高胶原海绵材料的力学强度,同时也能有效延长其降解时间.采用预先热交联,随后在采用EDC 进行化学交联制备的交联型胶原海绵保持了胶原固有的生物相容性,同时在细胞培养介质中不塌陷,能维持一定的强度,保持其形状和多孔性,有望满足组织工程研究的要求.[参考文献][1] W OLFGANG F .Co llagen-b i om 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李玉瑞.细胞外间质的生物化学及研究方法[M ].北京:人民卫生出版社,1988:174-178,223-224.[责任编辑:黄建军]443第3期谢德明,等: 胶原支架材料的制备与表征。