激光共聚焦显微镜样品制备共53页
激光共聚焦显微镜样品制备方法讲解
电子显微学报J.Chin.Eleetr.Microse.Soc.第29卷图I气体CO:冷冻装置。
Fig.1Gas C02frozen equipment.镜下操作后,置于干冰上(临时无干冰,也可置于一80℃冰箱,待冷冻完全后,将样品移至冷冻切片机中,温度平衡后,将样品从冷冻包埋模具中取出,进行冷冻切片。
冷冻包埋模具见图2。
图2冷冻包埋模具。
Fig.2Frozen embedding mold.液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些的组织块也可采用此方法冷冻。
将组织块置于样品台的OCT中,为防止组织块爆裂,先在液氮中迅速浸提几次,时间从1s开始逐渐增加,直至样品温度与液氮温度平衡,之后移至冷冻切片机中,使温度与切片机箱体温度一致,进行冷冻切片。
直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有OCT的样品台上,于冷冻切片机(箱体温度在一20℃以下中直接冷冻。
3冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从一80℃冰箱中取出,室温放置10min,待切片回温并干燥,浸于PBS中10min 洗去OCT,可以无需Triton处理,即可进行免疫荧光抗体标记,操作步骤与培养细胞反应方法相同口]。
反应在避光湿盒中进行,反应结束时用无荧光封固剂封片,4oC保存。
先用荧光显微镜观察,确认标记成功,移至激光共聚焦显微镜扫描成像。
4荧光染料及荧光蛋白传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluoreseinisothiocyanate,FITC,ex490nm/em520 nm、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC,ex550nm//em 620am、罗丹明(Rhodamine,ex560nm/em540~ 660nnl、四甲基罗丹明(tetramethyl rhodamine, TMR,ex570nm/em595—600nm、德克萨斯红(Texas red,ex592nm/em610rim、氨甲基香豆素(Aminomethylcoumarin aceticacid,AMCA,ex345 nm/em425am等,结合激光共聚焦显微镜技术的发展,这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。
激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解
激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser sea nning con focal microscope)，英文简写LSCM，俗称con focal。
LSCM是一种高科技显微镜，属于最先进的细胞生物学分析仪器。
我们学院使用的是瑞士徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。
使用流程1、登陆或5号楼606室公用电脑下载?激光共聚焦预约使用审核表?，打印并填写。
2、联系卢剑清(手机：)审核并签名。
3、持已签名的?激光共聚焦预约使用审核表? 至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙，联系人：窦凯飞(手机：。
4、在熟练使用者的指导下，进行实验。
5、实验结束，及时归还钥匙。
仪器构造和原理LSCM的根本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。
激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源，普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度、相干性好等优点,可以防止普通显微镜的缺点。
一般常用的气体激光器如氩(Ar)、氪(Kr)、氦(He)、氖(Ne)。
illu min ati ng pin hole (照明针孔)：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后，通过物镜在样品聚焦。
对标本内焦平面上的每一点进行扫描，Focal plane (焦平面)：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。
激光共聚焦显微镜样品制备方法_一_细胞培养样品
第29卷第2期2010年4月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol-29，No.22010-04文章编号：1000-6281（2010）02-0185-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（一）———细胞培养样品余礼厚（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋白能够提供蛋白质在细胞体内的精确时空信息。
因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。
本文主要介绍在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
关键词：绿色荧光蛋白；细胞培养；免疫荧光；激光共聚焦显微镜中图分类号：Q336文献标识码：A收稿日期：2010-03-20作者简介：余礼厚（1982－），男（汉族），四川自贡人，博士，E-mail ：lhyu@.随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内（in vivo ），甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。
而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。
通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。
因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。
鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。
本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
1绿色荧光融合蛋白表达载体的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义［1］。
而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra（Vnieikwo™n）C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
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荧光光谱
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分隔发射的荧光
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Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
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（四）计算机系统
控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光 挡片位置。
（10）、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting，感兴趣区域） 实时（real time）显示
（11）、有线和帧方式的多重扫描功能
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（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无 须很复杂地对仪器参数重新设置
（13）、有记忆功能
（14）、有专用的图象数据库 （15）、系统采用模块化设计，便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能
量共振转移）软件包。 精选课件PPT
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三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
（一）样品制备
激光共聚焦显微镜样品制备
细胞环境，成份和化学物质的荧光染料
染色/区分活和死细胞 细胞成份染料 （线粒体，溶酶体，内质网和Golgi体） 核酸染料（如：DAPI, Hoechst, BO-PRO, POPO） 离子敏感性染料（Ca2+, Mn2+, Zn2+, Na+, K+, Cl-） 膜电位敏感染料（罗丹明123）
B: Immunostaining against endosomal marker EEA1, cy5-conjugated secondary ab
S. Arnold 10/2002
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试
剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖 苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：
Alexa 568 DsRed Rhodamine Texas Red DiD
DiI
Organelle markers
PI
Hoechst 33258
PI
DAPI
MitoTracker
Anti-Calnexin
ER
Phalloidin
GM-130
Actin
EEA1
LysoTracker Tubulin
荧光染料
Atto and Tracy (Sigma Aldrich) Alexa Fluor (Invitrogen) BODIPY (Invitrogen) Cy-dyes FluoProbes (Interchim) DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce) DY and MegaStokes Dyes (Dyomics) Sulfo Cy dyes (CYANDYE, LLC)
激光共聚焦显微镜样品制备方法_二_组织切片样品_边玮
第29卷第4期2010年8月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol.29，No.42010-08文章编号：1000-6281（2010）04-0399-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（二）———组织切片样品边玮（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段。
本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程。
关键词：冷冻组织切片；免疫荧光；激光共聚焦显微镜成像中图分类号：Q336；TG115.21+5.3文献标识码：A收稿日期：2010-05-07作者简介：边玮（1964－），女（汉族），吉林蛟河人，高级工程师.E-mail ：weibian@.应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片，可尽量保持组织样品的抗原活性。
组织采集后，经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片，进行免疫荧光抗体标记。
1组织的采集、固定和保存不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。
实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛（PFA ）固定法。
液氮冷冻法：采取新鲜组织后，即可放入液氮中保存。
多聚甲醛固定法：小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和4%PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于1cm ˑ1cm ˑ1cm ，置于4%PFA 中进行后固定，后固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以4ħ固定过夜，或室温1 4h 。
之后，用0.01mol /L PBS 缓冲液洗3次，每次10 30min 。
在20%蔗糖中4ħ浸泡1h 以上，待组织块下沉后，即可进行冷冻切片。
组织块可置于4ħ冰箱保存于20%蔗糖（含0.05%NaN 3）中，一个月内完成切片。
表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。
激光共聚焦显微镜的样本PPT学习教案
仪器特点
1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差
。因为激光的单色性强、光源波束集中、 波长相同。
2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，
将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差 。
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仪器特点
3、点与面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空 间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源） 逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合， 最后得到一个整体平面的或立体的像。
第23页共42页石蜡切片冰冻切片涂片印片铺片培养的粘附细胞悬浮细胞各种染色非染色荧光标记的组织包括活组织第24页共42页高清晰成像高清晰成像半定量荧光强度分析半定量荧光强度分析荧光探针表达量测定荧光探针表达量测定分层扫描分层扫描多种荧光标记同时检测多种荧光标记同时检测第25页共42页激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制减少了成像的干扰以及使用光色较纯的激光所以制减少了成像的干扰以及使用光色较纯的激光所以成像分辨率可达普通光学显微镜的成像分辨率可达普通光学显微镜的1414倍
仪 器 型 号 ： OLYMPUS IX73 研 究 级 倒 置 荧光显 微镜
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显微镜参数
1．主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能； 2．透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置； 3．物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4×
（数值孔径N.A.≥0.13）、10×（N.A.≥0.3），20×（N.A.≥0.7）、 40×（N.A.≥0.6），60X×（N.A.≥0.7） 4．物镜转盘：6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜 信息，随物镜转换能够自动校准标尺； 5．载物台：精确定位功能手动载物台；具备XY锁定和复位功能, 可 重现标本位置，游标尺的精度≤100μm； 6．聚光镜：超长工作距离万能聚光镜，孔位数≥5；
激光共聚焦制样
非损伤性导入法：在正常的生理条件下加入Ca2+荧光探针与植物细胞共同孵育, 使探针渗入到细胞内的方法。
在培养液中加人荧光探针和增强膜透性的药物, 如去垢剂digitonin(毛地黄甘)、表面活性剂Pluronic F-127等, 药物使细胞膜通透性增强, 利于荧光探针的导入【1】。
周平等发现：在PH5.6条件下，绿豆、花生、水稻、烟草等细胞原生质体用5~10um ol/L Indo-1-K+或Fura-2-AM共同孵育1.5h,荧光探针可导入部分原生质体【2】。
样品的制备1：样品制备是上机检测前的关键步骤。
样品需经荧光探剂标记( 单标、双标、三标) 。
标本可以是固定的或活的组织, 也可以是固定的或活的贴壁培养, 细胞应培养在Confocal 专用小培养皿或盖玻片上, 悬浮细胞, 甩片或滴片后, 用盖玻片封片。
样品的最大厚度约1~ 2 mm, 使用的盖玻片厚度应小于0117mm, 载玻片厚度应在018~ 112 mm 之间, 而且表面光洁, 厚度均匀, 没有明显的干扰荧光。
固定样品常用封片剂进行封片,常用PH815- 9 的PBS 配制的甘油封片。
样品准备2：样品的最大厚度大约1~2mm(10×/ 0.4 物镜), 它取决于物镜的数值孔径(NA) 、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。
一般要求是单层贴壁细胞, 可以是经荧光探针标记(单标、双标、三标)固定的或活的组织; 固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal 专用小培养皿, 盖玻片); 用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。
对于非贴壁细胞的粘贴, 一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸﹑伴刀豆球蛋白﹑cell- tak﹑vectabond﹑琼脂凝胶等。
选择粘贴剂的标准是: 不影响实验目的, 对标本无损害[1]。
激光扫描共聚焦显微镜的样品制备技术3：3.1 取材组织标本：包括活检标本、手术切除标本、动物模型标本及尸检解剖标本等，应在标本离体后立即冰冻切片或贮存于-70℃冰箱备用，以充分保存组织的抗原性。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
激光共聚焦显微镜方法步骤
激光共聚焦显微镜方法步骤
激光共聚焦显微镜（简称CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，常用于生物学、医学和材料科学领域。
下面我将从多个角度全面介
绍激光共聚焦显微镜的方法步骤。
1. 样品准备：
在进行CLSM观察之前，首先需要准备样品。
样品的准备包
括固定、染色和清洁等步骤。
固定样品可以使用化学试剂或生理盐水，染色则可以使用荧光染料或荧光蛋白等方法，以增强样品的对
比度和可见性。
2. 仪器设置：
在进行CLSM观察之前，需要对显微镜进行仪器设置。
这包
括选择合适的激光波长、光学滤波器和放大倍数等参数，以确保获
得清晰的荧光信号和高分辨率的图像。
3. 成像扫描：
接下来是进行成像扫描。
CLSM使用激光束来扫描样品，并
收集样品发出的荧光信号。
通过逐点扫描和逐层堆叠，可以获得样
品的三维图像。
4. 数据分析：
获得图像后，可以进行数据分析。
这包括图像处理和三维重
建等步骤，以获取更多关于样品结构和组织的信息。
5. 结果解释：
最后是结果的解释。
根据获得的图像和数据，可以对样品的
结构和功能进行解释和分析，从而得出科学研究或临床诊断的结论。
总的来说，激光共聚焦显微镜的方法步骤包括样品准备、仪器
设置、成像扫描、数据分析和结果解释。
这些步骤需要精确操作和
细致处理，以获得准确、可靠的显微镜图像和数据。
激光共聚焦样品制备步骤
激光共聚焦使用步骤总结共聚焦实验步骤1.提前将PBS放在37度水浴锅中。
2.将小皿从细胞培养箱中取出，弃掉培养液，用PBS洗2——3次，轻晃几下即可。
注，此步加PBS时一定要轻一点，否则细胞会漂浮起来。
3.弃掉PBS后加1ml 4%多聚甲醛，固定细胞，室温静置30min。
4.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
5.弃掉后加0.1%Triton-X100 1ml，室温透膜静置15min。
6.弃掉后加PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃。
7. 5%PBS脱脂乳，封闭1h，可在摇床上轻晃，也可以室温静置。
8.一抗1h，可在摇床上轻晃。
9. PBS，1ml，3次，5min/次，可在摇床上轻晃10.二抗1h。
避光可在摇床上轻晃11. PBS，1ml，3次，5min/次避光，可在摇床上轻晃12.DAPI染色15min避光，室温静置13. PBS，1ml，3次，5min/次，避光，可在摇床上轻晃14.激光共聚焦显微镜观察。
激光共聚焦显微镜使用步骤1.打开五个绿色按钮和一个钥匙2.将物镜调至最低点。
3.电脑开启，选择TCS_User4.双击LAS AF 注意，双击软件后就耐心等待不要碰显微镜上任何东西，此时系统正在校准数据。
5.点击OK6.选择configuration7.点击像“注射器”一样的图案Laser，此时后便会出现一个画面，四个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，HeNe633和一个尺子一样的长线Stand by。
8.点击选择前三个小格405 Diode，Ardon，HeNe543，将Stand by拉到45左右。
9.选择Acquire10.先确定右侧区域油镜型号是Objective：63×1.4，如果不是点击下拉菜单选择。
11.选择seq，最下面会弹出Sequential Scan区域，该区域作用是根据自己实验需求选择相应激光通道，其中“＋”代表增加激光通道，“－”代表删除激光通道。
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)
2）细胞膜用 NBDPC染色（绿），
3）线粒体用 Mitotracker标记 （红）
如何改善图像质量
1、“更多信号！”
1）、 通过减慢扫描速度 2）、 使用“平均”方法 3）、 增加发射滤镜的带宽 4）、 加大针孔直径； 注意：光学切片的厚度也会相应地增大。 5）、 增大激发能（激光功率）； 注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。
2、“更多细节！”
1）、使用较高数值孔径 (NA) 的物镜 2）、增加“帧大小” = 每条线的像素值 + 每帧的线条数 3）、优化扫描焦距 (Z) 4）、增加动态范围
3、“更可靠！”
1）、使用多轨 2）、提供预定义配置。 3）、可同时定义和使用任何形状的多个研 究区。
Cultured cells, multiple fluorescence
原理 优缺点
激光共聚焦显微镜的基本结构
扫描系统
（1）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微 镜相连，与所接显微镜一体化设计
（2）、检测器数量 （3）、共聚焦针孔
50-300微米
（4）、扫描分辨率及灰度级
（5）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）
（6）、光谱扫描功能 （7）、扫描速度及速度调节
1）蛋白质、单糖和多糖探针； 2）细胞器探针； 3）核酸探针； 4）细胞活性探针； 5）膜和受体探针； 6）细胞膜电位和细胞内pH探针； 7）金属探针； 8）分子的特殊基团结合探针； 9）其他
（三）仪器使用步骤
（1）、选择激光器类型 （2）、选择相应的滤片 （3）、根据实验目的选择适当软件 （4）、按软件要求设置有关参数，进行观 察和分析。
仪器名称
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35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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激光共聚焦显微镜样品制备
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
Байду номын сангаас
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子