实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥17页
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体 电穿孔法
双子叶植物
无宿主限制， 技术限制
原生质体培 养
操作简单，易造 成原生质体损伤
转基因方法
农杆菌侵染法
基因Fra Baidu bibliotek法
农杆菌侵染法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系
对单子叶植物不敏感
根癌农杆菌和发根农 杆菌中细胞中分别含 有Ti质粒和Ri质粒， 其上有一段T-DNA， 农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物 基因组中。
T-DNA整合植物基因组的分子机理
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。 插入位点特点： T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
SILWET L-77
拟南芥、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国GE公司， Silwet-L77高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水的 表面张力为72.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张力 约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶 面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时，Silwet-L77 有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥及其 它作物常用的转基因用表面活性剂。
• 将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽 转化 真空10 min
• 将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。1~2 d后去除塑料膜，培养至 培养 种子成熟
农杆菌侵染瞬时转化烟草
接种
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基 (Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
植物基因转化受体
高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的外植体来源 对选择性抗生素敏感 对农杆菌侵染有敏感性
植物基因转化受体系统类型： 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞受体系统
植物遗传转化方法
植物遗传转化
农杆菌介导法
基因枪法 PEG诱导原生质
侵染
• 烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染10min后，用无菌滤纸 吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香 酮120µmol/L）上（25±2）℃暗培养条件下培养2d。
注射法瞬时转化烟草
• 种植本生烟(Nicotianabenthamiana)：25 °C，16 h光照，约一个月后可用； 受体材料 在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
• 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前 受体材料 一天去除已开花蕾和果荚
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL， 接种 Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
选择标记基因与报告基因
必备条件： 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 基因较小 能在转化体中得到充分表达 检测容易，并且能定量分析 选择标记基因与筛选标记基因： npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉 素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦） 报告基因：report gene（筛选标记之一） 在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能 在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。 gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因） 转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。
活化
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液 体培养基(Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培 养至菌液OD600为1-2
诱导
• 5000 rpm离心5 min收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖， 乙酰丁香酮120µmol/L)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 活化 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2
• 收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015% Silwet L-77)，将菌液稀释 诱导 至OD600为0.6-0.8
• 小量培养农杆菌16-24 h；按1:100转接到培养液(5 mL YEP，100 µM乙酰 丁香酮(Aldrich)，10 mM MES(pH 5.6)，Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL）
接种与活化 中，28 °C16-24 h
诱导
• 当菌摇到OD6001.0时，5 000 rpm 10 min收集菌体，用溶液(5 ml 10 mM MgCl2，7.5 μL 100 mM乙酰丁香酮)重悬农杆菌至OD6001.0，室温静置 至少3 h
侵染
• 用1 ml注射器注射烟草叶片，避光培养约48 h后，Gus染色观察
乙酰丁香酮
Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具 有重要作用。 乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：
遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能 够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外 源基因的整合。 使用方法： 在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因 高度活化状态，从而提高侵染能力 悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入 加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h后才能进行转 化 在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS
双子叶植物
无宿主限制， 技术限制
原生质体培 养
操作简单，易造 成原生质体损伤
转基因方法
农杆菌侵染法
基因Fra Baidu bibliotek法
农杆菌侵染法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系
对单子叶植物不敏感
根癌农杆菌和发根农 杆菌中细胞中分别含 有Ti质粒和Ri质粒， 其上有一段T-DNA， 农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物 基因组中。
T-DNA整合植物基因组的分子机理
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。 插入位点特点： T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
SILWET L-77
拟南芥、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国GE公司， Silwet-L77高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水的 表面张力为72.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张力 约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶 面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时，Silwet-L77 有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥及其 它作物常用的转基因用表面活性剂。
• 将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽 转化 真空10 min
• 将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。1~2 d后去除塑料膜，培养至 培养 种子成熟
农杆菌侵染瞬时转化烟草
接种
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基 (Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
植物基因转化受体
高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的外植体来源 对选择性抗生素敏感 对农杆菌侵染有敏感性
植物基因转化受体系统类型： 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞受体系统
植物遗传转化方法
植物遗传转化
农杆菌介导法
基因枪法 PEG诱导原生质
侵染
• 烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染10min后，用无菌滤纸 吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香 酮120µmol/L）上（25±2）℃暗培养条件下培养2d。
注射法瞬时转化烟草
• 种植本生烟(Nicotianabenthamiana)：25 °C，16 h光照，约一个月后可用； 受体材料 在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
• 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前 受体材料 一天去除已开花蕾和果荚
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL， 接种 Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
选择标记基因与报告基因
必备条件： 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 基因较小 能在转化体中得到充分表达 检测容易，并且能定量分析 选择标记基因与筛选标记基因： npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉 素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦） 报告基因：report gene（筛选标记之一） 在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能 在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。 gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因） 转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。
活化
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液 体培养基(Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培 养至菌液OD600为1-2
诱导
• 5000 rpm离心5 min收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖， 乙酰丁香酮120µmol/L)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 活化 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2
• 收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015% Silwet L-77)，将菌液稀释 诱导 至OD600为0.6-0.8
• 小量培养农杆菌16-24 h；按1:100转接到培养液(5 mL YEP，100 µM乙酰 丁香酮(Aldrich)，10 mM MES(pH 5.6)，Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL）
接种与活化 中，28 °C16-24 h
诱导
• 当菌摇到OD6001.0时，5 000 rpm 10 min收集菌体，用溶液(5 ml 10 mM MgCl2，7.5 μL 100 mM乙酰丁香酮)重悬农杆菌至OD6001.0，室温静置 至少3 h
侵染
• 用1 ml注射器注射烟草叶片，避光培养约48 h后，Gus染色观察
乙酰丁香酮
Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具 有重要作用。 乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：
遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能 够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外 源基因的整合。 使用方法： 在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因 高度活化状态，从而提高侵染能力 悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入 加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h后才能进行转 化 在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS