实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥17页
烟草遗传转化实验报告
烟草遗传转化实验报告实验目的烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系｡本实验以烟草为实验材料,了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤, 掌握遗传转化的基本操作技术｡实验要求:掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法;理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理:了解转基因植物筛选的方法｡实验原理:根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌,根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称为Ti质粒｡野生型农杆菌的Ti质粒,含有两个与致瘤有关的区域: 一个是T-DNA区,含致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割､转移与整合过程中起作用｡用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建,是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除,并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点｡p BI121载体是常用的植物表达载体,载体的骨架是pUC18,以CaMV3SS启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素(kan) 抗性选择标记基因,含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因｡β一葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因,转化的获得的转基因细胞､组织或植株,具有抗卡那霉素的特性,经组织化学染色呈蓝色｡实验器材摇床､超净工作台､小型离心机､冰箱､移液抢､镊子､手术刀､酒精灯､棉球､培养皿､三角瓶､滤纸､牛皮纸､牙签｡实验材料植物材料:烟草无菌苗农杆菌与载体:农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基:牛肉膏(5 g/L)､蛋白胨(5 g/L)､酵母提取物(1 g/L)､蔗糖(5 g/L)､MgSO4(0.5g/L)､pH 7.0烟草分化培养基: MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA烟草生根培养基: MS + 0.5mg/L IAA卡那霉素(Kan) 母液: 50mg/ml, 过滤除菌,分装,-20°C保存｡头孢霉素(cef) 母液: 300mg/ml, 过滤除菌,分装,-20"C 保存｡利福平(rif): 50mg/ml,过滤除菌,分装,-20"C保存｡。
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
农杆菌花序侵染法转化拟南芥
侵染液制备
1、将保存的农杆菌拿出按1：100的比例接种与5ml含抗生素的液
体YEP培养基中。
28°C、220rpm过夜培养。
农杆菌2h左右繁殖一代，培养时间较大肠杆菌长。
2、将活化好的农杆菌按1：100的比例加入100ml含抗生素的液
体YEP培养基中继续28°C、220rpm培养16h左右。
3、次日中午测菌液OD600值，用含抗生素的液体YEP培养基作为
空白对照。
OD600值达到1.0-1.3之间时，用50ml离心管，
室温4000rpm离心10min集菌。
倒掉上清，加入悬浮液重悬
菌体，调节OD600达到0.8-1.0.
悬浮液100ml为例：ddH2O 1OOml、MS 0.216g、蔗糖5g、
L-77 30ul，调节PH=5.8
4、拟南芥有花序、花蕾的植株浸入悬浮好的菌液40-50s ,确保
所有的花都浸在农杆菌培养液中。
浸染后避光过夜，第二天
揭开覆膜。
正常光照培养。
每隔七天转化一次。
可转化3次
提高转化效率。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
05
CATALOGUE
实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
02
01
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学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
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等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
01
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将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
基因转化小实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因转化是分子生物学领域的一个重要技术，它通过将外源基因导入宿主细胞中，使宿主细胞表达外源基因所编码的蛋白质。
基因转化技术在基因工程、生物制药、农业等领域具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究基因转化技术在微生物中的可行性，以期为后续研究提供参考。
二、实验目的1. 了解基因转化技术的基本原理和操作步骤；2. 掌握基因转化实验的操作方法；3. 评价基因转化技术在微生物中的可行性。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、显微镜等；2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、质粒载体、抗生素等；3. 实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）。
四、实验方法1. 提取目的基因：采用DNA提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA，通过PCR技术扩增目的基因；2. 构建重组质粒：将目的基因插入到质粒载体中，通过连接酶将两者连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：采用热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察菌落生长情况；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，并通过测序验证其正确性。
五、实验结果1. 提取目的基因：通过PCR技术成功扩增出目的基因，片段大小与预期相符；2. 构建重组质粒：通过连接酶将目的基因与质粒载体连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：通过热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到转化子；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察到部分菌落生长；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，结果与预期相符；通过测序验证，目的基因正确插入到质粒载体中。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了基因转化，证明了基因转化技术在微生物中的可行性；2. 实验过程中，热冲击法是一种有效的转化方法，转化效率较高；3. 实验结果表明，通过PCR技术和测序验证，目的基因已成功导入宿主细胞，为后续研究提供了基础。
[必读]农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法
![[必读]农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法](https://img.taocdn.com/s3/m/fc83f73f657d27284b73f242336c1eb91a37334e.png)
0000000000农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法00000000制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。
2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。
1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。
3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。
28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。
用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。
转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。
2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。
3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。
4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。
5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。
花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS 培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。
转Mn-SOD基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究
中国农业大学博士学位论文转Ｍｎ－ＳＯＤ基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究摘要盐、渍、干旱和低温等逆境胁迫是农业减产的重要原因。
长期而严重的环境胁迫会引起植物体内活性氧的积累，导致氧化胁迫，给细胞乃至整个植株带来严重伤害。
ＳＯＤ被认为是细胞内的维持活性氧平衡的关键酶，它能快速清除超氧阴离子，防止毒性最强的羟自由基的生成，清除活性氧的毒害。
Ｍｎ—ＳＯＤ位于真核细胞的线粒体中，尽管人们早己认识到线粒体是盐胁迫下最易受到伤害的细胞器之一，但是对于植物的线粒体内Ｍｎ．ＳＯＤ在盐胁迫条件下的适应性调节及其在植物耐盐性中作用还未有详尽的报道，而且在目前有限的研究结果中还存在很多的分岐。
为此本研究构建了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子控制下的Ｍｎ．ＳＯＤ重组质粒，通过农杆菌的介导获得了转Ｍｎ－ＳＯＤ的拟南芥和烟草。
通过比较野生型与转基因的拟南芥和烟草的耐盐性、Ｍｎ—ＳＯＤ和其它抗氧化酶类活性和ＭＤＡ含量的差异、以及它们在盐适应反应中的变化，阐明Ｍｎ．ＳＯＤ在维持细胞内活性氧的平衡、保护细胞免受活性氧的伤害中的作用，为进一步改造植物耐盐品种提供理论依据。
／～√采用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆得到拟南芥Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列，并构建Ｍｎ－ＳＯＤ片段的原核表达载体，获得融合蛋白并制备抗体，抗体效价为１：１００００。
同时以Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列构建真核生物表达载体，分别转化拟南芥和烟草，通过ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＳＯＤ活性鉴定，得到阳性转基因植株。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定转基因植株的线粒体中有外源的Ｍｎ—ＳＯＤ的表达。
野生型拟南芥和烟草组培苗经不同浓度ＮａＣＩ胁迫处理１５天后，发现拟南芥在】５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下烟草在２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下植株遇到明显伤害，生长受到抑制。
检测叶片Ｍｎ．ＳＯＤ活性，结果表明拟南芥和烟草叶片中Ｍｎ．ＳＯＤ活性受盐胁迫调节，在一定盐浓度范围内（烟草１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、拟南芥１００ｍｍｏｌ／Ｌ）Ｍｎ—ＳＯＤ活性与盐胁迫程度正相关。
烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草农杆菌转化实验步骤1烟草农杆菌转化实验实验配方：1LRMOP: 20×大量元素50ml200×微量元素5ml200×有机5ml200×铁盐5ml3%蔗糖30g0.8%琼脂（国产）4g/500ml灭菌后，每500ml培养基加入:0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μLYEB:液体培养基：1L酵母提取物1g牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4?7H2O 0.5gpH7.0 高压灭菌。
固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml 预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。
二．质粒DNA导入农杆菌①电转法：1.取农杆菌感受态在冰上冻融；2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。
拟南芥转基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。
2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。
3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。
转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。
本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。
实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。
4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。
将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。
将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。
3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。
将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
转基因拟南芥实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握转基因技术的基本原理和操作流程。
2. 学习拟南芥转基因方法，包括农杆菌介导转化和基因枪法。
3. 鉴定转基因植株，并分析其遗传稳定性。
二、实验材料与试剂1. 拟南芥植株（野生型、突变型）2. 农杆菌菌株（如Agrobacterium tumefaciens C58）3. 转基因载体（含目的基因、抗生素抗性基因）4. 培养基、抗生素、除草剂等5. PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA测序仪等三、实验方法1. 目的基因克隆：根据目的基因序列设计引物，从基因库中克隆目的基因，并进行测序验证。
2. 构建转基因载体：将目的基因克隆到载体上，并插入抗生素抗性基因作为筛选标记。
3. 农杆菌转化：将转基因载体转化农杆菌，制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选：将转化介质喷洒或浸泡拟南芥植株，筛选出转基因植株。
5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否成功插入。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性。
四、实验结果与分析1. 目的基因克隆：成功克隆目的基因，并进行测序验证。
2. 构建转基因载体：成功构建转基因载体，并插入抗生素抗性基因。
3. 农杆菌转化：成功转化农杆菌，制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选：通过喷洒或浸泡转化介质，成功筛选出转基因植株。
5. PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，成功检测到目的基因。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析：通过自交、回交等手段，分析转基因植株的遗传稳定性，结果表明转基因植株遗传稳定性良好。
五、实验讨论1. 农杆菌转化法是一种常用的植物转基因方法，具有操作简便、转化效率高等优点。
2. 在转基因过程中，抗生素抗性基因作为筛选标记，可以有效筛选出转基因植株。
3. PCR检测是鉴定转基因植株的重要手段，可以快速、准确地检测目的基因是否成功插入。
4. 遗传稳定性分析是评估转基因植株遗传特性的重要环节，有助于确保转基因植物的安全性。
农杆菌转化和侵染拟南芥及其种子的消毒与筛选
一、拟南芥种子的消毒1、网筛：硅胶干燥过两三周的种子，用漏网筛滤几遍，尽量除去皮壳等杂质，倒入EP管中；2、消毒：于超净台上，用无菌枪头，向EP管中加入1ml的70% 酒精，并计时8分钟，在此期间不停的振荡，以使种子与酒精充分接触，最后12000rpm离心30s；3、洗涤：回到超净台上，酒精消毒双手，用无菌枪头将70% 酒精吸出，更换无菌枪头，吸取1ml无菌水加入管中，反复颠倒振荡，以使种子与无菌水充分接触，最后12000rpm离心30s；重复上述操作两次；4、春化：无菌枪头吸取1ml无菌水，加到种子EP管中，放入4℃冰箱中三天。
二、表达载体克隆构建转化农杆菌1、冲洗电击杯：水龙头下流水冲洗3min以上；于超净台上无菌水冲洗：用无菌蓝枪头将无菌水加入电击杯中，然后吸出并打入电击杯底部狭缝，如此重复吹打几次，再换成新的无菌水，如此反复3次；无水乙醇冲洗，同上反复3次；70%酒精冲洗，同上反复3次；最后无水乙醇冲洗1次，并平放于枪头盒上对着超净台风向吹干；2、加样：将已经吹干的电击杯放在冰上预冷，与此同时，从-20℃取出的质粒解冻后亦放在冰上预冷；然后从-80℃中取出已制备好的农杆菌感受态，解冻时离心几秒钟使其均匀分布（储存完整量为50ul）；准备工作做好后，白枪头吸取质粒1ul打入50ul农杆菌感受态细胞中，然后轻轻反复吹打使两者混匀，再用黄枪头全部吸出，沿着电击杯内壁或侧壁打入缝隙中，最后放于冰上保持低温；3、电击：插上电击仪电源，打开开关，调至Bacteria，调至Agr（农杆菌），将电击杯外壁突出面放在前面，并放在电击仪槽中，然后将槽推进去，使两边电击卡住，最后摁下Pulse脉冲进行电击，听到蜂鸣后取出电击杯放回冰上；4、复苏：于超净台上，沿电击杯内壁，往电击杯狭缝中，加入800ul无抗LB培养液，然后换用黄枪头，反复吸出培养液并吹打底部感受态细胞，使其悬浮起来，最后吸到2ml无菌EP管中，于28℃恒温箱中复苏1～2小时；5、涂板：复苏结束后，将菌液涂至含有利福平（菌种自身抗性）和表达载体抗性抗生素的固体培养基平板上，于28℃恒温箱中倒置过夜培养；三、侵染拟南芥植株1、栽种：将春化种子点在土里，隔两天浇一次水；2、打顶：拟南芥幼苗抽薹两三天后，去除其顶上花序，注意要避免伤及叶生花序；3、转化：打顶三四天后，进行侵染转化。
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。
拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。
本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。
该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。
通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。
标签：植物转基因；农杆菌；浸花法植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。
利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。
植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。
基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。
农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。
农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。
科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。
利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。
浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。
这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小的，但是具有完成“复 杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h， 使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸 取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾 花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现 侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇 营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其 角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中 （在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后， 放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌侵染拟南芥花序的转化
农杆菌渗透转化拟南芥
1）取含有重组质粒的农杆菌，在含有相应抗生素的YEP（LB也可以）平板上划线，28℃培养2-3d。
2）取划线的农杆菌单菌落，接种在3ml含相应抗生素的YEP培养液中，28℃，250rpm，振荡过夜培养。
3）在400-500ml 含相应抗生素的YEP培养基中，接种3ml过夜培养的起始农杆菌液，并在28℃摇床上振荡过夜，培养至细菌OD600值大于2.0。
4000rpm离心
10min收集细胞并悬浮于大约3倍体积的渗透培养液（1/2MS，50g/L蔗糖，0.5g
MES，pH=5.7-5.8，250ul/L silwetL-77(0.02%silwet)）中，此时的OD600值约
为0.8。
一般来说，400ml YEP过夜培养的农杆菌应至少可以渗透转化6钵植株。
4）在一个开口的大器皿（如500ml烧杯）内倒入200-300ml的悬浮有农杆菌的渗透液。
5）将生长有拟南芥的培养钵（盛花期拟南芥，最好在转化前修剪掉果荚和已经开放的花）小心地反扣在上述器皿内，让拟南芥的花芽完全浸入农杆菌悬浮液中
大约1min，将培养钵移开侧倒放入大盘中，让多余液体流净。
6）将处理过的植物用塑料盖盖上避光大约24h培养。
7）将植物放置在适宜的条件下培养3-4周，收集种子，进行下一步的筛选处理。
转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。
Silwe-77t：加300微升/L 浸30s 50-100微升/L 浸3分钟。
拟南芥模拟植物实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种重要的模式植物，在植物遗传学、分子生物学和发育生物学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用。
由于其生长周期短、繁殖速度快、基因组相对较小、易于转化和遗传操作等特点，拟南芥成为科学家们研究植物生命现象的理想材料。
本实验旨在通过模拟拟南芥的生长过程，了解其生物学特性，并掌握相关实验技术。
二、实验目的1. 了解拟南芥的生长周期和生物学特性。
2. 掌握拟南芥种子萌发、移栽、生长和观察的基本实验技术。
3. 熟悉拟南芥的遗传转化和基因编辑方法。
三、实验材料1. 拟南芥种子2. 培养基（MS培养基）3. 培养皿、移栽盘、水培箱等容器4. 电转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等仪器5. 相关试剂（如DNA提取试剂盒、PCR试剂等）四、实验方法1. 种子萌发（1）将拟南芥种子用70%乙醇消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。
（2）将消毒后的种子接种到MS培养基上，置于培养箱中，保持适宜的温度和光照条件。
（3）观察种子萌发情况，记录萌发时间和生长状况。
2. 移栽（1）待拟南芥幼苗长到2-3片真叶时，将其移栽到移栽盘中。
（2）在移栽盘中加入适量的营养土，保持土壤湿润。
（3）观察移栽后的生长状况，记录生长时间和生长情况。
3. 生长和观察（1）将移栽后的拟南芥放置于水培箱中，定期更换营养液。
（2）观察拟南芥的生长状况，包括叶片、茎、根的生长速度和形态变化。
（3）记录生长数据，分析生长规律。
4. 遗传转化和基因编辑（1）利用电转化法将目的基因导入拟南芥细胞。
（2）通过PCR和DNA测序验证基因转化成功。
（3）利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥基因进行编辑，观察基因编辑效果。
五、实验结果与分析1. 种子萌发实验结果显示，拟南芥种子在消毒后2-3天内开始萌发，5-7天内大部分种子萌发，生长状况良好。
2. 移栽移栽后的拟南芥生长迅速，叶片展开，茎、根生长良好。
3. 生长和观察实验过程中，观察到拟南芥在适宜的生长条件下，生长速度较快，叶片、茎、根的生长状况良好。
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤第一篇：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤整理人：早熟组赵凤利一、准备试剂：1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。
1).500 mM MES(Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于4℃2).20 mM Na3PO4·12H2O(BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于4℃3).1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于-20℃。
二、实验步骤：1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值；注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。
6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml 的最终悬浮菌液就能满足侵染了；如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。
7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；11.侵染前，用记号笔标记待转区域；12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；14.将侵染后的烟草放回培养室15.2-3天后：1).亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；2).启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。
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必备条件： 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 基因较小 能在转化体中得到充分表达 检测容易，并且能定量分析 选择标记基因与筛选标记基因： npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉 素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦） 报告基因：report gene（筛选标记之一） 在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能 在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。 gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因） 转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
真空浸透法转化拟南芥
• 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前 受体材料 一天去除已开花蕾和果荚
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL， 接种 Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
T-DNA整合植物基因组的分子机理
T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。 插入位点特点： T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点 T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对 植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。 但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复 等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。
• 将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽 转化 真空10 min
• 将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。1~2 d后去除塑料膜，培养至 培养 种子成熟
农杆菌侵染瞬时转化烟草
接种
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基 (Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
活化
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液 体培养基(Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培 养至菌液OD600为1-2
诱导
• 5000 rpm离心5 min收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖， 乙酰丁香酮120µmol/L)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8
体 电穿孔法
双子叶植物
无宿主限制， 技术限制
原生质体培 养
操作简单，易造 成原生质法
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系
对单子叶植物不敏感
根癌农杆菌和发根农 杆菌中细胞中分别含 有Ti质粒和Ri质粒， 其上有一段T-DNA， 农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物 基因组中。
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 活化 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2
• 收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015% Silwet L-77)，将菌液稀释 诱导 至OD600为0.6-0.8
侵染
• 用1 ml注射器注射烟草叶片，避光培养约48 h后，Gus染色观察
乙酰丁香酮
Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具 有重要作用。 乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：
遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能 够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外 源基因的整合。 使用方法： 在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因 高度活化状态，从而提高侵染能力 悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入 加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h后才能进行转 化 在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS
侵染
• 烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染10min后，用无菌滤纸 吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香 酮120µmol/L）上（25±2）℃暗培养条件下培养2d。
注射法瞬时转化烟草
• 种植本生烟(Nicotianabenthamiana)：25 °C，16 h光照，约一个月后可用； 受体材料 在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；
植物基因转化受体
高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的外植体来源 对选择性抗生素敏感 对农杆菌侵染有敏感性
植物基因转化受体系统类型： 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞受体系统
植物遗传转化方法
植物遗传转化
农杆菌介导法
基因枪法 PEG诱导原生质
SILWET L-77
拟南芥、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国GE公司， Silwet-L77高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水的 表面张力为72.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张力 约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶 面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时，Silwet-L77 有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥及其 它作物常用的转基因用表面活性剂。
• 小量培养农杆菌16-24 h；按1:100转接到培养液(5 mL YEP，100 µM乙酰 丁香酮(Aldrich)，10 mM MES(pH 5.6)，Rif 100 μg/mL，Kan 50 μg/mL）
接种与活化 中，28 °C16-24 h
诱导
• 当菌摇到OD6001.0时，5 000 rpm 10 min收集菌体，用溶液(5 ml 10 mM MgCl2，7.5 μL 100 mM乙酰丁香酮)重悬农杆菌至OD6001.0，室温静置 至少3 h