肺癌PDX动物模型建立

恶性肺结节/肺癌PDX动物模型及分子评价体系建立一．研究背景1．临床治疗的问题化疗/靶向治疗中90%达不到预期治疗效果，表明目前的评价肿瘤药物疗效的动物模型局限性较大。

肿瘤动物模型对药物反应的预测价值在于该模型能在多大程度上真实模拟人体内的真实肿瘤环境，如肿瘤发生、微血管形成、免疫反应、肿瘤相关性成纤维细胞浸润和肿瘤基质成分，同时还应该能模拟人体药物反应如耐药性的产生。

然而目前尚无系统的报道介绍实验预测和最终临床效果的相关性，尤其是针对靶向治疗。

2．PDX模型的选择原则（1）标本选择时必须到相关的临床分期，多数抗癌药物表现出阶段性特异的效果，如胰腺癌的药物BB-94就是早期时抗肿瘤效果明显，但对进展期无效；（2）需检测药物与肿瘤各成分细胞的相互作用（如：肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肿瘤-浸润的免疫细胞等）；（3）应该确定药效学与药代动力学的关系，以确定人和小鼠之间药效和毒性的关系。

药代/药效的关系可通过驱动基因突变来确定（如EGFR，Hedgehog信号通路），但对针对基质及肿瘤微环境的药物的价值尚待确定；（4）成功的药效/药代模型用于预测人对药物的剂量反应需要寻找人和小鼠中的生物标志物；（5）如何解决靶向药物的脱靶作用以及非肿瘤组织表面的靶点的作用；（6）如何控制转移及研究药物在抑制转移中的作用。

3．临床研究动物模型现状及问题目前主要的临床前小鼠模型分为两类：（1）移植瘤模型：包括人肿瘤细胞系接种、自体移植模型和患者来源移植模型；是将人源或同源小鼠肿瘤组织接种于皮下或相关原位部位；此模型针对细胞增殖及存活的药物可用于预测临床效果，但对靶向药物的价值有限，尤其是针对肿瘤微环境的药物；（2）遗传调控小鼠模型：包括遗传调控肿瘤模型和非遗传调控肿瘤模型。

通过遗传工程人为导致小鼠基因突变并诱导肿瘤发生，这种模型是基于通过二代测序发现的驱动基因突变建立的突变小鼠模型。

问题：（1）肿瘤异质性使得药物针对肿瘤不同细胞成分的方式及耐药性产生的机制仍不清楚，肿瘤中不同细胞的相互作用，更增加了这个问题的复杂程度；（2）动物模型和临床结果之间结果的一致性仍有差距，如肿瘤的抑制效率、无进展期生存、总生存、转移及复发情况；（3）移植模型与人的基因型及表型缺乏足够准确的生物标志物来验证其匹配性。

4．PDX动物模型在肺癌中的研究现状小细胞肺癌：未经化疗的SCLC组织，经处理后移植入SCID小鼠皮下，肿瘤长到1cm后传代，同时发现可转移到附近淋巴组织；采用Affymetrix 检测平台，对源组织、移植肿瘤、移植肿瘤中分离的肿瘤干细胞进行表达检测，发现在移植肿瘤中出现基因表达丢失现象，结论认为基因表达变化是该类模型中常见的现象，不影响期作为药物测试模型的价值；非小细胞肺癌：来自早期（T2/T3）肺癌患者102例手术标本，成功建立25例PDX模型，检测表明早期传代（P5代）的移植肿瘤与源肿瘤组织相比在形态学及突变位点等方面匹配性很强；化疗后PDX模型也出现和临床治疗后相似的现象，表明PDX模型可做为肺癌患者化疗的检测模型；同时检测到EGFR、P53的新发突变位点，可做为化疗效果预测的标志物；大细胞癌：25例大细胞癌组织建立PDX模型，用厄罗替尼和西妥昔单抗治疗，肿瘤缩小40%即可认为对治疗有反应；对每一肿瘤组织进行RNA 表达谱检测，与分子信号图谱（molecular singaling map, MSM）比对，预测肿瘤对药物的反应，结果PDX对西妥昔单抗的反应率为40%，对厄罗替尼反应率为20%，MSM预测的反应率中西妥昔单抗和厄罗替尼分别为48%和40%。

结论认为MSM可用于药物反应的预测。

目前PDX模型应该解决的问题：PDX模型中应该增加生物标志物的种类及评估方式，以对患者分类及临床药效检测有帮助作用；需要从患者/PDX 模型来进行双重筛选以得到可用于肿瘤进程监测的标志物。

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四．研究内容（一）肺部恶性结节的病程监测、早期治疗效果评估肿瘤传代1．穿刺标本接种SCID小鼠（皮下、肾小囊）（P1），肿瘤长到直径400-600mm3后处死小鼠并取出肿瘤组织；2．剪碎及消化为单个细胞后接种第二批SCID小鼠（皮下、肾小囊、尾静脉注射）（P2代），同时收集P1代肿瘤组织进行蛋白组学、表观遗传谱、驱动基因等检测；3．P2代小鼠1个月后处死，取出肿瘤组织后再次接种SCID小鼠（P3代），同时收集P2代肿瘤组织进行多组学检测，并与P1代肿瘤组织对比，评估其一致性；以后每2月传代一次，并收集肿瘤组织进行多组学检测，评估肿瘤不同代数的匹配性；肿瘤传代不能超过10代；早期治疗评估4．P3代开始进行药物治疗，根据EGFR的检测结果并与临床医生讨论后确定化疗方案或靶向治疗方案；5．每两天测量一次肿瘤大小，评估早期治疗效果；6．每两周进行PET-CT扫描，检测肿瘤的代谢变化。

（二）T淋巴细胞的免疫治疗肿瘤传代选用肺结节患者穿刺标本、晚期肺癌患者手术标本，其余步骤同上。

免疫治疗及评估1．每次肺结节患者随访后，抽取外周血，分离效应T细胞；2．富集后刺激T细胞增殖；3．通过尾静脉注射到PDX模型中；4．通过测量肿瘤组织大小及PET-CT扫描，评估T淋巴细胞治疗效果。

（三）生物标志物筛选及鉴定1．收集不同代数（P1-P10代）、不同治疗方案（T细胞治疗/化疗/靶向治疗）、不同组织来源（肺结节穿刺标本/进展期手术标本）的PDX肿瘤组织，并结合取自患者体内的源组织，进行基因组学、表观遗传图谱、蛋白精确定量等检测方法，筛选在治疗前和治疗后的肿瘤组织中特异的DNA分子、甲基化/磷酸化位点、蛋白质分子标志物；2．结合生物信息学方法，设计不同的生物标志物组合，用于不同治疗方案（T细胞治疗/化疗/靶向）对肺癌治疗效果的评估；同时评价生物标志物对预测患者药物反应的价值；3．选择在肺结节来源PDX模型中差异较明显的驱动基因、表观遗传位点、蛋白分子标志物，结合患者的随访信息、影像学资料及临床病程，评估PDX模型筛选恶性肺结节病程监测的标志物方面的价值。

五．技术路线六．进度安排截止2017年12月底，完成100例肺结节穿刺标本/肺癌手术组织的PDX接种实验，并筛选可用于肺结节病程监测、不同治疗方案药物反应预测的分子标志物组合。

七．详细操作流程（一）皮下接种操作流程1．病人肿瘤标本的收集：尽可能在肿瘤离体后立即收集，标本可来源于组织活检和肿瘤根治手术标本。

新鲜肿瘤组织最好取肿瘤靠近边缘、坏死较少的肿瘤组织，完全浸泡于0℃带或不带血清、0.05%青霉素及链霉素双抗PRMI1640培养基中；2．清洗后转移到带上述培养基的消毒培养皿中（0℃），完全浸泡并带回动物房操作；3．用消毒组织剪将肿瘤组织修剪成2×2×3mm，并用以上培养基中清洗3遍。