组培实验报告——烟草的再生

植物组织培养

题目：烟草的再生

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指导老师：

2012年10月13日

烟草的再生

前言

植物组织培养是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养。细胞全能性是指植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。细胞全能性是植物组织培养的理论基础。

一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。脱分化：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。

植物组织培养的过程：

植物组织培养的类型，按材料分为：愈伤组织培养、器官培养（胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养）、细胞培养（悬浮细胞培养和单细胞培养）、原生质体培养。本次实验采用的就是器官培养，以烟草叶作为培养材料。

植物组织培养可以分为初代培养和继代培养。初代培养是指外植体的最初培养。继代培养是将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，成为继代培养。

植物组织培养的特点：1、培养条件可以人为控制。2、生长周期短，繁殖率高。

3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。故植物组织培养具有良好的前景，可用于快速繁殖、种苗脱毒、远缘杂交、突变育种、单倍体育种等。

一、实验目的

1、了解掌握组织培养的基本概念和基本原理。

2、了解开展组织培养工作的基本设施。

3、了解无菌操作和组织培养的操作技术。

二、实验原理

植物体细胞具有细胞全能性。细胞一旦脱离了母体植株，拜托了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织，即指在人工培养基上外植体长出来的一团无序生长的薄璧细胞。当试管苗在瓶内长满并长到瓶塞，或培养基利用完时就要转接，进行继代，可迅速得到大量试管苗，以便到一定数量时进行移栽。

三、实验材料、药品及仪器

实验材料：烟草的叶片

实验药品：MS培养基所需的各类药品、蔗糖、琼脂条、1mol/LNaOH、70%酒精、升汞、蒸馏水

实验仪器：烧杯、玻璃棒、电子天平、电炉、容量瓶、pH计、塑料瓶、搪瓷杯、量筒、移液管、洗耳球、锥形瓶、漏斗、牛皮纸、棉线、高压蒸汽灭

菌锅、超净工作台、酒精灯、镊子、手术刀、接种针、培养皿、滤纸、

酒精棉培养箱、记号笔

四、实验步骤

（一）MS基本培养基贮备液的配制

在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为了使用方便和用量准确，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。

按表1所示数据分别配制：①大量元素贮备液，②微量元素贮备液，③铁盐贮备液，④除蔗糖以外的有机物质贮备液和⑤CaCl2贮备液。

表1 MS培养基的贮备液

（1）大量元素的配制

在配制大量元素无机盐母液时，要防止在混合各种盐类时产生沉淀，各种药品必须在充分溶解后才能混合，同时在混合时要注意先后次序，把钙离子(Ca2+)、锰离子(Mn2+)、钡离子(Ba2+)和硫酸根离子(SO42-)、磷酸根离子(PO43-)错开，以免KH2PO4和MgSO4与CaCl2等发生作用，相互结合生成硫酸钙、硫酸钡、磷酸钙或磷酸锰沉淀。在混合各种无机盐时，其稀释度要大，慢慢地混合，同时边混合边搅拌。

（2）微量元素的配制

在配制微量元素混合母液时也要注意药品的添加顺序，以免产生沉淀。称取药品时要看清药品名称，以免弄错。

（3）铁盐的配制

铁盐必须单独配制，因为与其他母液混合容易产生沉淀，在培养基中，采用螯合铁的形式配制，即硫酸亚铁和Na2-EDTA的混合物，在pH值7.6~8.0时也可保证铁的供应源。配制铁盐时，要分别溶解，再混合在一起进行加热，直至澄清透明。（4）生长调节物质的配制

原液的浓度不宜配制的过大，一般每毫升原液含生长调节物质0.5mg~1mg，若经常只需配制少量培养基，可将每毫升原液的生长调节物质调至0.1mg~0.2mg，这样既方便量取，精确度也更高。

某些生长调节物质不溶于水，如生长素等，配制时可先用少量95%酒精溶解，再加水定容，也可加热助溶，或用1mol/L KOH(或NaOH)助溶。激动素(KT)和6-苄基氨莽嘌呤(6-BA)，可先溶于少量1mol/L盐酸中，再加水定容。叶酸需用少量稀氨水溶解。（5）CaCl2贮备液的配制

CaCl2要单独配制，以防同硫酸根离子(SO42-)、磷酸根离子(PO43-)形成沉淀。本来要用的是CaCl2·2H2O，不过找不到CaCl2·2H2O，只找到CaCl2，故用CaCl2配制贮备液Ⅴ，用量也按CaCl2计算。

（二）MS培养基的配制和灭菌

将贮备液按顺序排好，按以下步骤配制培养基。

（三）初代培养的接种及观察

（1）前期准备

1、提前将所需的用具灭菌，接种时取出待用。

2、超净工作台灭菌：先用紫外灯照射15~20min，再关掉紫外灯，开照明灯，并用酒精擦洗台面和双手。

3、用沾有酒精的酒精棉擦拭装着培养基的锥形瓶，放进工作台。

4、把手术刀、镊子等浸于酒精中，再在火焰上消毒，然后架在装有滤纸的培养皿上，不能放在台面上。

（2）材料的消毒

1、用镊子夹取一片烟草叶，先放入75%酒精中漂一下，然后放入升汞中浸泡3~4min，期间要不时地翻动叶片，再在无菌水中漂一下，重复2次后，置于滤纸上吸去叶片表面多余的水。

2、在火焰附近切割烟草叶片，用手术刀将叶片分成两半，去掉主脉，并将叶片边缘和两端切去，留下叶肉后将叶片切得大块些。

（3）接种

1、打开瓶口，拿下牛皮纸时，要先将牛皮纸掀开个大口，在火焰附近取下，并用火焰烧瓶口，防止杂菌污染。

2、用镊子将切成块的叶片放入装有培养基的锥形瓶，盖上牛皮纸，同样的也要先弄大点再盖上去，防止杂菌污染，再用棉线扎上瓶口。

3、接种完毕，清理工作台并在锥形瓶上写上名字。