第12章荧光分析法

2、荧光光谱的形状与激发波长无关
基态分子跃迁到不同的激发态（如S1*，S2*）， 吸收不同的波长（如λ1，λ2），所以吸收光谱可 能有几个吸收带；但均回到第一激发单重态最低振 动能级后再发射荧光返回到基态，所以荧光发射光 谱只有一个发射带。

3、荧光光谱与激发光谱的镜像关系
蒽的激发光谱： a峰为S0→S2*形成。



6、其它
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧 光的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为内滤光作用，如 色胺酸中的重铬酸钾。 自吸收现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光 谱的长波长端重叠，产生自吸收，如蒽化合物。

第二节 荧光定量分析方法
一、荧光强度与物质浓度的关系
b峰由b0、b1、b2、b3、b4组成， 为S0→S1*各不同振动能级而形 成。
蒽的荧光光谱： 包含c0、c1、c2、c3、c4等 小峰，为S1*(v=0)→S0各 不同振动能级而发出光辐 射所形成。
二、荧光与分子结构

（一）荧光寿命和荧光效率

荧光寿命（fluorescence life time）：除 去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大 荧光强度的1/e所需的时间，常用τf表示。 Ft = F0e-Kt t =τf 时，Ft = (1/e)F0 ln (F0/ Ft )= t/τf 直线斜率即为1/τf

内部能量转换（internal conversion）：内转换
两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有 重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电 子能级的过程。 特点：无辐射跃迁；两个电子激发态具有相同的多重性 （都是单重态或都是三重态，如S2*→S1*，T2*→T1*）。

处于激发单重态的分子通过振动弛豫和内转换，均可返回到 第一激发单重态的最低振动能级。
第十二章 荧光分析法

光致发光：物质受到光照射时，除吸收某种波 长的光之外还会发射出比原来所吸收的波长更 长的光，这种现象称为光致发光。 荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激 发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。 荧光分析法：根据物质的荧光谱线位臵及其强 度进行物质鉴定和含量测定的方法。


外转换及体系间跨越使荧光减弱甚至消失。

磷光发射
分子从单重态以体系间跨越跃迁到三重态后，再经 振动弛豫回到三重态最低振动能级，返回至基态的各个振 动能级而发出光辐射，称为磷光。 特点： 1）发射光量子，磷光波长较荧光更长； 2）时间较长，10-4-10s，甚至更长； 3）光照停止后，可持续一段时间； 4）在室温下很少产生磷光。
基态+hv→激发态 光谱中电子能级可分为二组： 1）电子自旋配对的（电子自旋方向相反，电子的净 自旋S=0，谱线多重性M=2S+1=1）称为单重态或单线 态，以S表示。 2）电子自旋非配对的（电子自旋方向相同，其净自 旋S=1，谱线多重性M=3）称为三重态或三线态，以T 表示。




激发单重态与相应的三重态的区别在于电子自旋方向 不同及三重态的能级稍低一些。 三重态寿命较长。



3、1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（Dansyl-Cl，DANS-Cl， 丹酰氯）： 与伯、仲胺及酚基的生物碱反应生成荧光物质。 丹酰肼（Dansyl-NHNH2）： 与可的松等的羰基缩合，产生强烈荧光。 荧光条件：λex=365nm，λem=500nm。
←含胺基药物的测定
雌激素的测定→



荧光发射
处于第一激发单重态最低振动能级的电子以辐射形式 发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，发射的光量 子称为荧光。 特点： 1）发射光量子，且荧光波长总是长于激发光波长； 2）时间约为10-9-10-7s； 3）荧光谱线有时呈现几个非常接近的峰（电子返回到 基态不能振动能级，能级差不同，吸收波长不同）； 4）处于基态不同能级的电子会通过振动弛豫返回到基 态最低振动能级。

溶液的荧光强度 该溶液中荧光物质吸收光能的程度 荧光效率
条件：极稀溶液
二、定量分析方法

1、校正曲线法：
以荧光强度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标。

2、比例法：
在线性范围内，测定标样和试样荧光强度，对比。

3、联立方程式法：
用于多组分混合物的荧光分析。
第三节 荧光分光光度计 和荧光分析新技术

3、酸度：
荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对其荧光强 度有较大影响，因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变， 因此荧光强度也有差异。 如苯胺：在pH7-12溶液中主要以分子形式存在，发生蓝色荧 光；pH<2或pH>13的溶液中均以离子形式存在，不发射荧光。


4、荧光熄灭剂：
荧光熄灭：荧光猝灭，指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分 子相互作用引起荧光强度降低的现象。 荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质，如卤素离子、重金属离子、 氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。 作用机制： 1）荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量； 2）荧光物质分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位 化合物； 3）溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁 性，促进体系间跨越，激发单重态的荧光分子转变至三重态； 4）浓度较大（超过1g/L）时，发生自熄灭现象。 荧光熄灭法（fluorescence quenching method）：荧光物质在 加入某种熄灭剂后，荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线 性关系，利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量的方法。

5、散射光：
一束平行单色光照射在液体样品上时，大部分光线透过溶 液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发 生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。 瑞利光：仅运动方向改变，无能量交换。 拉曼光：运动方向改变，并有能量交换，波长较入射光稍 长或稍短。 对荧光测定干扰的主要是波长比入射光波长更长的拉曼光。 消除：选择适当的激发波长。

（二）有机化合物分子结构与荧光的关系 能够发射荧光的物质同时具备两个条件： 1）有强的紫外-可见吸收 2）有一定的荧光效率
{
长共轭分子→较强紫外吸收 刚性平面结构分子→较高荧光效率

1、长共轭结构
具有π→π*跃迁 大多数产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，π电子共轭 程度越大，荧光强度越大，荧光波长也长移。

（三）荧光试剂
弱/无荧光物质+荧光试剂→强荧光产物
1、荧光胺（fluorescamine）： 特点：与脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物。 荧光胺及其水解产物均不显荧光。 荧光条件：λex=275/390nm，λem=480nm。




2、邻苯二甲醛（OPA）： 特点：在2-巯基乙醇存在下，pH9-10的缓冲溶液中 能与伯胺类、特别是半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸 外的α-氨基酸生成灵敏的荧光产物。 荧光条件：λex=340nm，λem=455nm。 例：测定磺胺类药物

2、分子的刚性-共平面性
分子刚性-共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。

3、取代基
1）给电子取代基，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN 等，能增加分子的π电子共轭程度，常使荧光效率提高，荧光 波长长移。 2）吸电子取代基，如-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等，减弱分子的π电子共轭程度， 使荧光减弱甚至熄灭。 3）取代基对π电子共轭体系作用较小，如-R、-SO3H、 -NH3+等，对荧光影响也不明显。
处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性 发生变化的过程。如S1*的最低振动能级同T1*的最高振动能级重 叠，则可发生体系间跨越（S1*→T1*）。 特点：无辐射跃迁；发生在不同多重态之间（S1*→T1*）； 含有重原子如溴、碘等的分子，或溶液中存在氧分子等顺磁性 物质容易发生；使荧光减弱。

荧光效率（fluorescence efficiency）： 荧光量子产率（fluorescence quantum yield），指激发态分子发射荧光的光子数与基态分 子吸收激发光的光子数之比，常用φf表示。 φf=发射荧光的光子数/吸收激发光的光子数 一般物质的荧光效率在0-1之间。大小取决于物 质分子的化学结构及环境（温度、pH 、溶剂等）。 荧光效率越高，荧光强度越强。

1、荧光分光光度计的主要部件：
激发光源：氙灯、高压汞灯、激光 激发单色器（样品池前）：光栅或滤光片 发射单色器（样品池后）：光栅或滤光片 样品池：石英 检测系统：光电倍增管


2、仪器的校正
（1）灵敏度校正： 用被检测出的最低信号来表示，或用某一对照 品的稀溶液在一定激发波长光的照射下，能发射出 最低信噪比时的荧光强度的最低浓度表示。 （2）波长校正： 用汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正。 （3）激发光谱和荧光光谱的校正
一、荧光分光光度计



滤光片荧光计：激发滤光片让激发光通过；发射 滤光片常用截止滤光片，截去所有的激发光和散 射光，只允许试样的荧光通过，不能测定光谱， 只用于定量分析。 滤光片-单色器荧光计：将发射滤光片用光栅代替， 不能测定激发光谱，可测定荧光光谱。 荧光分光光度计：两个滤光片都用光栅取代，可 绘制激发光谱和荧光光谱。


荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620


荧光光谱特征：
1、斯托克斯位移（Stokes shift）：荧光发射波长 总是大于激发光波长的现象。 原因：1）激发态分子通过振动弛豫和内转换到 达第一激发单重态最低振动能级；2）荧光发射可能 使激发态分子返回到基态的不同振动能级；3）激发 态分子与溶剂分子的相互作用。

2、荧光的产生
基态
光辐射
激发态
释放能量
基态

Байду номын сангаас
振动弛豫（vibrational relexation）
处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞， 能量传递给溶剂分子，电子返回到同一电子激发态的最低振 动能级。 特点：无辐射跃迁；只能在同一电子能级内进行；时间 约为10-12s；使大多数电子激发态处于其最低振动能级上。

2、溶剂：
1）溶剂极性：极性↑→荧光波长↑，荧光强度↑ 原因：极性溶剂中，π→π*跃迁能量差ΔE小，使紫外 吸收波长和荧光波长均长移；跃迁几率增加，使荧光强度增 强。 2）溶剂粘度：粘度↓→荧光强度↓ 原因：溶剂粘度低，分子间碰撞机会增加，使无辐射跃 迁增加，使荧光减弱。 温度↑→溶剂粘度↓→荧光强度↓
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 T2
发 射 荧 光
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3


（二）荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum）：不同激发波长 的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。 绘制：固定发射波长，荧光强度（F）对激发波 长（λex）的关系曲线，其形状与吸收光谱相似。 荧光光谱（fluorescence spectrum）：在所发射的 荧光中各种波长组分的相对强度。 绘制：固定激发光波长和强度，荧光强度（F） 对发射波长（λem）的关系曲线。 荧光分析法通常采用λexmax与λemmax。
4、测定无机离子的荧光试剂 无机离子+有机化合物→配合物→直接测定荧光强度 加入无机离子（如CN-、F-等）
配合物荧光减弱或消失
荧光猝灭法
三、影响荧光强度的外部因素

1、温度：温度↑→荧光效率↓，荧光强度↓
原因：温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞几率 增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光效率。



特点： 1）灵敏度高 2）选择性好 3）方法简单快速，用样量少 4）应用受限
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 （二）荧光的激发光谱和发射光谱 二、荧光与分子结构 三、影响荧光强度的外部因素
一、分子荧光

（一）分子荧光的产生 1、分子的电子能级与激发过程

外部能量转换（external conversion）：外转换
溶液中的激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子之间相 互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。 特点：无辐射跃迁；常发生在第一激发单重态或激发三重 态的最低振动能级返回基态的过程；降低荧光强度。

体系间跨越（intersystem crossing）