重组人促红细胞生成素的分离纯化工艺
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外源蛋白的复性是利用包涵体获得外源蛋白最 关键也是最复杂的一步。重组蛋白的复性操作主要 有两种方法:一种是将溶液稀释,导致变性剂的浓 度降低,促进蛋白质复性。
如果蛋白质以胞内可溶表达形式存在,则收集 菌体后破壁,离心取上清液,然后用亲和层析或离 子交换法进行纯化。在纯化过程中还常采取适当的 保护措施,如低温、加入保护剂、尽量缩短纯化工 艺及时间等措施来防止产物的降解和破坏。
26.1重组药物概述
应用DNA重组技术可大量生 产过去难以获得的生理活性蛋白 和多肽,提供足够数量的生理活 性物质,以便对其生理生化及结 构等进行深入的研究和开发应用, 还可以对已有的药物进行改造, 克服其不足,创造自然界不存在 的全新物质。目前,采用DNA重 组技术生产的药物主要有干扰素、 生长素、胰岛素、重组疫苗等。
另外表达产物还可存在于大肠杆菌细胞周质中, 这是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种 形式,它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋 白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化。大肠杆 菌经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透冲击的方法 来获得周质蛋白。 缺点是渗透冲击的方法破壁 不完全,产物的收率较低。
2. 根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型
1. 产物的表达形式
根据外源基因表达产物在宿主细胞中的定位, 可将表达方式分为分泌型表达和胞内表达。 外源蛋白的分泌表达是通过将外源基因融合到 编码信号肽序列的下游来实现的。将外源基因接在 信号肽之后,表达产物在信号肽的引导下跨膜分泌 出胞外,同时在宿主细胞膜上存在特异的信号肽酶, 它识别并切掉信号肽,从而释放出有生物活性的外 源基因表达产物。分泌型表达产物的发酵液的体积 很大,但浓度较低,因此必须在纯化前富集或浓缩, 通常可以用吸附、沉淀或超滤的方法来进行富集或 浓缩。
26 重组药物
作者:周雅丹
本章目录
26.1重组药物概述 26.2重组药物的通用制造方法与技术 26.3重组药物的分离纯化技术关键 26.4重组药物的质量控制 26.5典型重组药物制造技术及工艺
26.1重组药物概述
20世纪70年代建立的DNA重组技术带来了生 物技术新的变革,促进了以基因工程技术为核心的 现代生物技术的诞生和发展,被认为是20世纪人类 的一项最伟大的贡献。 DNA重组技术,亦称基因重组技术,是指将 DNA片段(如基因)按人们的设计方案定向地与载 体相连,并转入特定的受体细胞,构建成工程菌 (或细胞),实现遗传物质的重新组合,并使目的 基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 应用DNA重组技术表达和生产的多肽或蛋白 质类药物,称为重组药物。
基因工程产物常需采用层析来进行精制以达到 药用标准。在选择层析类型和条件时要综合考虑蛋 白质的性质。如蛋白质的等电点和表面电荷的分布 及目的蛋白质的稳定性。 亲和层析是一种高效的分离纯化手段,不同的 蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基,如酶和底 物、抗原与抗体、糖链和凝集素等。 一般是目的蛋白与配基结合而杂蛋白不结合, 目的蛋白吸附后再利用快速变换洗脱液和加入竞争 剂的方法进行洗脱。
由于亲和分离的选择性强,因此在产物纯化中 具有较大的潜力;疏水作用层析和反相作用层析是 利用蛋白质疏水性的差异来分离纯化蛋白质。 二者的不同在于疏水作用层析通常在水溶液中 进行,蛋白在分离过程中仍保持其天然构象,而反 相作用层析是在有机相中进行,蛋白经过反相流动 相与固定相的作用有时会发生部分变性;凝胶排阻 层析根据蛋白质的相对分子质量以及蛋白质分子的 动力学体积的大小来进行分离的,它可应用于蛋白 质脱盐和蛋白质分子的分级分离。
而且基因工程菌培养发酵产物中含有大量的细 胞、代谢物、残留培养基、无机盐等,而目的产物 在初始物料中含量较低,同时重组药物一般都需注 射给药,对其质量、纯度要求高,如需无菌、无热 源等。为获得合格的目的产物,必须建立与上述特 点相适应的分离纯化工艺。 分离纯化重组药物须重点考虑下列几个技术因素: 1. 产物的表达形式 2. 根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型 3. 分离单元之间的衔接 4.分离纯化工艺的要求
如果表达产物前没有信号肽序列,它可以可溶 形式或不可溶形式(包涵体)存在于细胞中。对于 胞内产物,首先要通过离心或过滤的方式收集细胞, 并采用适当的方法破壁。在工业生产中常用大肠杆 菌作为宿主菌来生产目的蛋白,在大肠杆菌中当外 源蛋白的表达量达到20%以上时,它们一般就会以 包涵体(inclusion body)的形式存在。
3. 分离单元之间的衔接
考虑到工业生产成本,一般 早期尽可能采用高效的分离手段, 如通常先用非特异、低分辨的操 作单元方法(如沉淀、吸附、超 滤等),以尽快缩小样品体积, 提高产物浓度,去除最主要的杂 质;然后采用高分辨率的操作方 法(如离子交换色谱、亲和色谱 等),而将凝胶排阻色谱这类分 离规模小、分离速度慢的操作单 元放在最后,以提高分离效果。
26.3重组药物的分离纯化技术关键
构建好的基因工程菌在适当 条件下培养发酵,表达重组药物 后,还需选择适当的分离纯化方 法将产物提纯,制成特定的制剂, 才能被应用于临床。 重组药物结构上多为活性肽 或蛋白质,稳定性差,对pH、温 度、金属离子、有机溶剂、剪切 力、表面张力等十分敏感,容易 失活、变性。
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26.2重组药物的通用制造方法与技术
重组药物制造的通用方法流程为: ①获得目的基因; ②将目的基因和载体连接,构建DNA重组体; ③将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌; ④工程菌的发酵; ⑤外源基因表达产物的分离纯化; ⑥产物的检验和制剂制备等。
重组药物分离纯化的一般流程为:固液分离、 细胞破碎、提取、浓缩与初步纯化、高度纯化直 至得到纯品以及成品加工等。
对于各单元操作可参考前面各章节叙述,在操作过程中 需注意: 1、操作条件要温和,能保持目的产物的生物活性; 2、选择性要好,能从复杂的混合物中有效地将目的产物分 离出来,达到较高的纯化倍数; 3、收率要高; 4、两个技术之间要能直接衔接,不需要对物料加以处理调 整,这样可以减少工艺步骤; 5、整个分离纯化过程要快,能够满足高生产率的要求。