重组人促红细胞生成素的分离纯化工艺
第9章重组人红细胞生成素生产工艺
• 9.1 概述 • 9.2 工程CHO细胞系的构建 • 9.3 CHO细胞培养过程与工艺控制 • 9.4 分离纯化工艺与质量控制
9.1.1 红细胞生成素及其种类
1、红细胞生成素的生成与作用机理 • 1890：现象，低氧压下红细胞增多 • 1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出红细胞生成素（erythropoietin，
3、红细胞生成素的生理作用
• 红细胞生成素，又称促红细胞生成素，或红细胞生 成刺激因子：调节红系祖细胞，对红细胞生成有特 异性刺激作用的细胞因子。
EPO与靶细胞结 合：骨髓细胞、 脾细胞、肝细胞 等，促进前体细 胞增殖和分化， 生成红细胞。
4、人红细胞生成素的生物合成
• 染色体上的位置：在7q11-q22区 • 基因结构：5个外显子和4个内含子，全长2.1kb • 编码特点：外显子1编码5’非翻译区和信号肽的前4个氨基酸，外显
5、重组人红细胞生成素
• 用基因工程技术生产的人红细胞生成素。 • 第一代：两种，天然基因表达，rhEPO-α和rhEPO-β。 • 1989：Amgen，Epogen；1990，Ortho Biotech，Procrit • rhEPO-α，CHO细胞生产 • Roche，NeoRecormon（rhEPO-β），BHK细胞系
EPO）。 • 定义：
• 在哺乳动物肾脏和肝脏产生的一种分子质量为46kDa的糖蛋白细胞因子。能 刺激幼稚红细胞的增生，血红蛋白化和红细胞的成熟。
2、天然红细胞生成素的种类
• 1971：从贫血羊血浆中分离纯化出羊EPO • 1977：从再生障碍性贫血患者的尿液中分离纯化出 人EPO • hEPO形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸组成及 顺序相同，165个氨基酸，活性类似。 • 糖基化及其含量不同： hEPO-α含有较多的N-乙酰 氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸，总含糖量比hEPO-β 高。
第十八章重组人红细胞生成素生产工艺
抗体药物制备
鼠源单克隆抗体
3） 原生质体融合
取对数期骨髓瘤细胞和B淋巴细胞悬液，于离心管中以1:10混 匀，离心、去上清 在37℃下，使两者充分接触 滴加PEG后，继续震动2min 添加培养基稀释PEG，终止其作用 离心后，置于培养板中用HAT培养基进行培养
抗体药物制备
重组人红细胞生成素工艺路线的研究
大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。 家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性 较低、活性较差等问题。 在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞 生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采 用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。
第十八章 重组人红细胞生 成素生产工艺
第一节 概述 第二节 工程CHO细胞系的构建 第三节 CHO细胞系培养过程与工艺控制 第四节 分离纯化工艺
红细胞生成素
细胞系的构建
第二节 工程CHO细胞系的构建
18.2.1 表达载体的构建 18.2. 2 转染 18.2. 3 稳定性筛选
红细胞生成素
18.2.1 表达载体的构建
细胞系的构建
人红细胞生成素基因的克隆策略： 从基因组中克隆编码区片断，拼接成全长；或从基因中 克隆全长，在动物细胞中转录出mRNA，RT-PCR克隆全长 序列 将目标基因与载体在连接体系中连接过夜，连接酶为 Phage T4连接酶 表达载体的构建： 人红细胞生成素基因与载体进行酶切、连接、转化、大肠 杆菌中筛选、鉴定、测序、确证序列、方向无误。
红细胞生成素
18.3. 3 培养过程控制
培养过程与工艺控制
搅拌控制：接种后，搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上， 随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。 温度控制：较为严格，恒定37℃。 pH值控制：7.0-7.2,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。 溶解氧控制：在50％-80％的范围内，通入氧气、空气或 氮气的比例混合气体。 葡萄糖控制：流加补料。 代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度， 减少对细胞损害。
重组人促红细胞生成素的制备
重组人促红细胞生成素的制备一、引言重组人促红细胞生成素（rHuEPO）是一种人工合成的蛋白质，可以刺激骨髓中的造血干细胞增殖和分化，促进红细胞的生成。
它被广泛应用于治疗各种类型的贫血，包括肾性贫血、癌症相关贫血等。
本文将介绍rHuEPO的制备过程。
二、rHuEPO的结构与功能rHuEPO是一种由165个氨基酸组成的糖蛋白，其分子量约为34kDa。
它在体内主要由肾脏分泌，但也可以由其他组织产生。
rHuEPO能够与红细胞前体细胞表面上的受体结合，并通过下游信号通路促进红细胞生成。
三、制备rHuEPO的方法1. 基因克隆制备rHuEPO的第一步是进行基因克隆。
目前已知有三种来源可供选择：人体、小鼠和大肠杆菌。
其中，以大肠杆菌为主要来源最为常见。
2. 转化表达将克隆得到的基因导入到表达载体中，再将载体导入到大肠杆菌中，使其表达rHuEPO蛋白。
这一过程需要进行多次筛选和纯化，以确保得到纯净的rHuEPO。
3. 后续处理经过转化表达后得到的rHuEPO需要进行后续处理，包括蛋白质结构分析、纯化、重组和活性检测等步骤。
其中，重组是指将rHuEPO与其他蛋白质结合形成复合物，以提高其生物活性。
四、rHuEPO的应用1. 治疗肾性贫血rHuEPO是治疗肾性贫血的常用药物之一。
它能够刺激骨髓中的造血干细胞增殖和分化，促进红细胞生成。
对于患有慢性肾病的患者来说，长期使用rHuEPO可以显著改善他们的生活质量。
2. 癌症相关贫血rHuEPO也被广泛应用于治疗癌症相关贫血。
由于化疗和放疗会对正常细胞造成损伤，从而导致贫血发生。
而rHuEPO的使用可以促进红细胞生成，减少贫血的发生率。
3. 运动员兴奋剂rHuEPO也被一些运动员作为兴奋剂使用。
由于它能够提高氧气输送能力，从而增加肌肉耐力和运动表现。
但这种使用方式是不合法的，并且存在一定的风险。
五、结论rHuEPO是一种重要的生物制品，广泛应用于治疗贫血等疾病。
其制备过程需要进行多次筛选和纯化，以确保得到纯净的rHuEPO。
重组人促红细胞生成素的生产与应用
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载重组人促红细胞生成素的生产与应用地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容重组人促红细胞生成素的生产与应用任雅怡3090102202摘要重组人促红细胞生成素是成功应用于生物医药领域的重组蛋白药物产品。
科研领域对其性质和合成方法已有了成熟的了解。
工业生产者也早已开始大量生产重组人促红细胞生成素，并且取得了不俗的市场成效。
关键词重组人促红细胞生成素生产工艺应用市场开发重组人促红细胞生成素的性质促红细胞生成素（erythropoietin,简称EPO）最早于1906年被发现。
EPO 属唾液糖蛋白激素，由165个氨基酸组成，为人体内源性化合物，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为34～36 ku (SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku （凝胶电泳），疏水性极强,pI为3.75~4.15。
它主要来源于肾脏（少量来源于肝脏），由皮质管周围的间质细胞合成。
由基因重组技术合成的rhEPO相对分子质量为30400道尔顿，为含165个HYPERLINK "/92666/" \t "_blank" HYPERLINK "/225210/" \t "_blank" 氨基酸糖的酸性糖蛋白，由哺乳动物细胞培养产生，结构与天然EPO极为相似，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。
其不同点是基因位点在7号染色体。
在基因重组技术诞生前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定。
重组人促红细胞生成素的纯化【精品-PPT】
EPO纯化历史
Miyake的七步法：纯化步骤太多,对设备及 操作要求也较高,不适合工业生产的特点
Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于 凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸 附,使得分离效果降低,成本增高,也不利于大 规模生产
疏水层析,凝胶柱层析等
三步层析法
1. 染料配基亲和层析→反相疏水层析→离 子交换层析;
尿液，血浆，胎盘浸出液 80年代后期编码人EPO基因被克隆 重组人EPO（recombinant human EPO,
rhEPO）在哺乳动物细胞中成功表达
rhEPO的应用
临床应用重组人促红细胞生成素可治疗慢 性肾衰竭合并贫血症，慢性肾功能衰竭 （CRF）贫血，骨髓增生异常综合症贫血 （Myelodys-plastic Syndrom ,MDS）， AIDS病人的伴生贫血，（非髓性）肿瘤伴 生贫血及肿瘤化疗贫血，β地中海贫血,镰刀 形贫血,早产儿贫血等.也可用于外科手术中 的自体输血、骨髓移植等。
为什么第一步先用反相色谱？
综合国外和国内文献，大多数使用的是阴 离子交换柱或亲和柱作为第一步纯化，在 这种方案里，必须先对样品进行超滤，透 析及冻干等以达到浓缩和脱盐目的。
缺点？
低效耗时
糖蛋白对机械作用力敏感，长时间超滤等 处理可能对蛋白造成不可逆损伤，丧失活 性
EPO易吸附在容器表面，处理步骤增多会引 起蛋白回收率下降
而且使用可以用于临床的柠檬酸缓冲液做 流动相，不需另作临床使用溶剂置换处理。
关于三步法的缺点
反相作为起始步骤？ 反相色谱是以高分辨率的纯化方法，将其 作为起始步骤，不能及时处理大量样品， 而且起始物质成分复杂，可能并不能达到 良好的分离效果，还有可能会影响反相介 质的再生作用。
酵母发酵液中重组人生长激素的表达及分离纯化共32页文档
及分离纯化
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华
用三步法纯化重组人促红细胞生成素
用三步法纯化重组人促红细胞生成素技术方法李 琳 邓继先 卢建申 周 江军事医学科学院生物工程研究所 北京 100071【摘要】 用生物反应器培养中国仓鼠卵巢细胞2促红细胞生成素(CHO 2EPO )C2细胞株,培养上清液中重组人促红细胞生成素(rHuEPO )表达水平达2×106～3×106U/L 。
培养上清液经过三步纯化:第一步为反相色谱,可将样品体积浓缩约96.7%,其收集液经充分透析后进行第二步的DEAE 2离子交换色谱,最后进行分子筛色谱,总回收率为30%以上。
经纯化的rHuEPO 比活性为1.5×108U/g 蛋白,SDS 2PA GE 为一条带,扫描测试纯度达98%以上。
关键词 促红细胞生成素;纯化;色谱法中国图书资料分类法分类号 R392.11Purif ication of recombinant human erythropoietin to homogeneity by a rapid three 2step procedureL i L i n ,Deng Ji xian ,L u Jianshen ,Zhou JiangInstitute of Biotechnology ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100071Abstract Chinese hamster ovary 2erythropoietin (CHO 2EPO )C2cells were cultured in the packed bed bioreactor with free 2fetal bovine serum medium.Conditioned medium from the Bioreactor contained 2×106-3×106U/L of recombinant human erythropoietin (rHuEPO ).Crude rHuEPO from the con 2ditioned medium was purified by three 2step procedure to yield preparations with potency of 1.5×108U/g in 30%yield.The three steps involved :(1)reverse 2phase chromatography which made 302fold concentration ;(2)sufficient dialysis and purification with ion 2exchange chromatography ;(3)gel filtra 2tion.SDS 2PA GE result of the preparations showed a single band.Homogeneity was confirmed by UV scanning.K ey w ords erythropoietin ;purification ;chromatography 促红细胞生成素(erythropoietin ,EPO )是一种糖蛋白激素,它通过刺激红细胞前体细胞分化生成成熟红细胞以调节外周血红细胞水平。
第9章重组人红细胞生成素生产工艺
因。 • 1983：Amgen提交了hEPO基因序列与重组hEPO物质组成的专利。 • 分离纯化技术专利：基于天然人红细胞生成素的分离纯化方法。 • 分析方法：形成质量控制技术
rhEPO的生产工艺路线研究
• （1）SV40病毒启动子驱动表达载体，猴肾纤维母细胞（COS-1）中 瞬时表达hEPO。
• （2）昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。产率有所改善，但 糖基化程度较小。
AmpR NeoR
hEPO dhfr
• CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是 neo等非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影 响，用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增 的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因 （dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（gs）。
• 研究工作中发现，GS 系统表达水平高，但细胞长 期连续培养时，生长状况不佳，而DHFR 系统表达 水平较GS 系统低，但细胞生长状况良好。
从肝mRNA，逆转录合成cDNA，进行筛选，得到目标基因。
hEPO
表达载体构架：目标
基因与载体酶切、连接、
转化，大肠杆菌筛选（氨
苄），鉴定，测序确证序
列、方向无误。
2、转染
• 细胞培养：CHO，dhfr-，70%汇合；洗涤3次。 • 脂质复合物制备：载体prEPO和pDHFR与脂质体混 合 • 共转化：与无血清培养基混合，加到培养皿中， 37℃，5%CO2，4h
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26.2重组药物的通用制造方法与技术
重组药物制造的通用方法流程为： ①获得目的基因； ②将目的基因和载体连接，构建DNA重组体； ③将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌； ④工程菌的发酵； ⑤外源基因表达产物的分离纯化； ⑥产物的检验和制剂制备等。
重组药物分离纯化的一般流程为：固液分离、 细胞破碎、提取、浓缩与初步纯化、高度纯化直 至得到纯品以及成品加工等。
而且基因工程菌培养发酵产物中含有大量的细 胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，而目的产物 在初始物料中含量较低，同时重组药物一般都需注 射给药，对其质量、纯度要求高，如需无菌、无热 源等。为获得合格的目的产物，必须建立与上述特 点相适应的分离纯化工艺。 分离纯化重组药物须重点考虑下列几个技术因素： 1. 产物的表达形式 2. 根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型 3. 分离单元之间的衔接 4．分离纯化工艺的要求
26 重组药物
作者：周雅丹
本章目录
26.1重组药物概述 26.2重组药物的通用制造方法与技术 26.3重组药物的分离纯化技术关键 26.4重组药物的质量控制 26.5典型重组药物制造技术及工艺
26.1重组药物概述
20世纪70年代建立的DNA重组技术带来了生 物技术新的变革，促进了以基因工程技术为核心的 现代生物技术的诞生和发展，被认为是20世纪人类 的一项最伟大的贡献。 DNA重组技术，亦称基因重组技术，是指将 DNA片段（如基因）按人们的设计方案定向地与载 体相连，并转入特定的受体细胞，构建成工程菌 （或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的 基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 应用DNA重组技术表达和生产的多肽或蛋白 质类药物，称为重组药物。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
26.1重组药物概述
应用DNA重组技术可大量生 产过去难以获得的生理活性蛋白 和多肽，提供足够数量的生理活 性物质，以便对其生理生化及结 构等进行深入的研究和开发应用， 还可以对已有的药物进行改造， 克服其不足，创造自然界不存在 的全新物质。目前，采用DNA重 组技术生产的药物主要有干扰素、 生长素、胰岛素、重组疫苗等。
如果表达产物前没有信号肽序列，它可以可溶 形式或不可溶形式（包涵体）存在于细胞中。对于 胞内产物，首先要通过离心或过滤的方式收集细胞， 并采用适当的方法破壁。在工业生产中常用大肠杆 菌作为宿主菌来生产目的蛋白，在大肠杆菌中当外 源蛋白的表达量达到20%以上时，它们一般就会以 包涵体（inclusion body）的形式存在。
由于亲和分离的选择性强，因此在产物纯化中 具有较大的潜力；疏水作用层析和反相作用层析是 利用蛋白质疏水性的差异来分离纯化蛋白质。 二者的不同在于疏水作用层析通常在水溶液中 进行，蛋白在分离过程中仍保持其天然构象，而反 相作用层析是在有机相中进行，蛋白经过反相流动 相与固定相的作用有时会发生部分变性；凝胶排阻 层析根据蛋白质的相对分子质量以及蛋白质分子的 动力学体积的大小来进行分离的，它可应用于蛋白 质脱盐和蛋白质分子的分级分离。
另外表达产物还可存在于大肠杆菌细胞周质中， 这是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种 形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋 白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。大肠杆 菌经低浓度溶菌酶处理后，可采用渗透冲击的方法 来获得周质蛋白。 缺点是渗透冲击的方法破壁 不完全，产物的收率较低。
2. 根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型
外源蛋白的复性是利用包涵体获得外源蛋白最 关键也是最复杂的一步。重组蛋白的复性操作主要 有两种方法：一种是将溶液稀释，导致变性剂的浓 度降低，促进蛋白质复性。
如果蛋白质以胞内可溶表达形式存在，则收集 菌体后破壁，离心取上清液，然后用亲和层析或离 子交换法进行纯化。在纯化过程中还常采取适当的 保护措施，如低温、加入保护剂、尽量缩短纯化工 艺及时间等措施来防止产物的降解和破坏。
3. 分离单元之间的衔接
考虑到工业生产成本，一般 早期尽可能采用高效的分离手段， 如通常先用非特异、低分辨的操 作单元方法（如沉淀、吸附、超 滤等），以尽快缩小样品体积， 提高产物浓度，去除最主要的杂 质；然后采用高分辨率的操作方 法（如离子交换色谱、亲和色谱 等），而将凝胶排阻色谱这类分 离规模小、分离速度慢的操作单 元放在最后，以提高分离效果。
基因工程产物常需采用层析来进行精制以达到 药用标准。在选择层析类型和条件时要综合考虑蛋 白质的性质。如蛋白质的等电点和表面电荷的分布 及目的蛋白质的稳定性。 亲和层析是一种高效的分离纯化手段，不同的 蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基，如酶和底 物、抗原与抗体、糖链和凝集素等。 一般是目的蛋白与配基结合而杂蛋白不结合， 目的蛋白吸附后再利用快速变换洗脱液和加入竞争 剂的方法进行洗脱。
对于各单元操作可参考前面各章节叙述，在操作过程中 需注意： 1、操作条件要温和，能保持目的产物的生物活性； 2、选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分 离出来，达到较高的纯化倍数； 3、收率要高； 4、两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理调 整，这样可以减少工艺步骤； 5、整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。
1. 产物的表达形式
根据外源基因表达产物在宿主细胞中的定位， 可将表达方式分为分泌型表达和胞内表达。 外源蛋白的分泌表达是通过将外源基因融合到 编码信号肽序列的下游来实现的。将外源基因接在 信号肽之后，表达产物在信号肽的引导下跨膜分泌 出胞外，同时在宿主细胞膜上存在特异的信号肽酶， 它识别并切掉信号肽，从而释放出有生物活性的外 源基因表达产物。分泌型表达产物的发酵液的体积 很大，但浓度较低，因此必须在纯化前富集或浓缩， 通常可以用吸附、沉淀或超滤的方法来进行富集或 浓缩。
26.3重组药物的分离纯化技术关键
构建好的基因工程菌在适当 条件下培养发酵，表达重组药物 后，还需选择适当的分离纯化方 法将产物提纯，制成特定的制剂， 才能被应用于临床。 重组药物结构上多为活性肽 或蛋白质，稳定性差，对pH、温 度、金属离子、有机溶剂、剪切 力、表面张力等十分敏感，容易 失活、变性。