分子生物学技术

分子生物学技术

近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等等。分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。1953年Watson & Crich发现DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。

在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。

一、分子生物学技术

由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。实时荧光定量PCR技术的应用,不仅使临床基因检测更加快速,而且使基因检测进入定量阶段,这特别有利于某些疾病治疗效果的评价。免疫检验中的放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）,酶免疫分析（Enzyme Iimrrmnoassay，EIA）,金标记免疫分析,荧光免疫分析（Fluoroimmunoassay，FIA）,时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）,化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLI A）,电化学发光免疫分析（Electro-Chemiluminescence Immunoassay ，ECLI）技术的临床应用不仅拓宽了免疫学检测的领域,同时提高了免疫学检测的灵敏度,促进了免疫检测的自动化。特别是化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析技术的诞生,使得免疫学检验进入了一个新的时代,检测灵敏度可达pg水平,其检测速度、分析自动化程度及分

析准确性也是其它免疫学方法无法比拟的。流式细胞术进入临床实验室极大地拓宽了临床检验的范围,可应用于细胞DNA、RNA定量及细胞周期分析、细胞表面标志物分析、凋亡细胞的检测等,促进了细胞生物学的临床应用。

生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR 技术后的又一次革命性技术突破。生物芯片已在高通量基因测序、基因表达研究已经发挥了其重要作用,也将在后基因组时代研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用方面发挥其极其重要的作用。由于生物芯片具有高通量、可同时快速检测多种待检分子的特点,故研究适用于临床实验诊断需要的低密度生物芯片近年来已成为检验医学的研究热点之一,用于肝炎病毒、HPV检测及分型、结核分枝杆菌、人巨细胞病毒、幽门螺杆菌、地中海贫血、性传播性疾病等的检测及诊断的基因芯片已相继问世;用于微量蛋白质、激素、肿瘤标志物监测的蛋白质芯片也已得到初步应用。

分子诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。分子诊断以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”针对性强。目前已经能够进行分子诊断的疾病包括:①染色体疾病的诊断和产前筛查。②单基因遗传病的分子诊断和产前诊断。单基因遗传疾病是由单个基因发生突变引起的疾病。已发现的人类单基因遗传病多达400种以上。目前,已经了解许多单基因遗传疾病的致病基因以及发病机制,如Marfan综合征、先天性肾上腺皮质增生症、糖原累积症、家族性高胆固醇血症。③多基因疾病的分子诊断。多基因疾病是危害人类健康的多发病、常见病,如恶性肿瘤、心血管疾病（动脉粥样硬化、高血压等）、糖尿病、精神-心理疾病（精神分裂症、忧郁症等）。这些疾病的分子病因十分复杂,可采用已知基因标志的连锁分析和关联分析方法,对未患病个体进行患病危险性预测,以及对上述疾病进行亚型的基因分型和鉴定等辅助诊断,以利于疾病的正确治疗。④感染性疾病的基因诊断。⑤恶性肿瘤的分子诊断。

二、心血管疾病检测常用的分子生物学技术

心血管疾病是一种与多基因有关的复杂疾病，其发生、发展与多基因位点变异及表达异常有关。高血压、冠心病等心血管疾病, 是由于环境与遗传因素相互作用引起, 涉及多基因的参与, 机制复杂, 分离与克隆相关基因是了解这些疾病机理的基础。研究相关细胞和组织在生理、病理或药物处理状态下的基因表达谱, 分析基因表达差异, 可以为筛选疾病候选基因, 阐释疾病的机理提供重要信息。

分子诊断的常用技术方法有：①核酸分子杂交技术，包括Southern印迹（Southern blot杂交），Northern印迹（Northern blot杂交），斑点杂交（dot blot），原位杂交（insituhybridization）等；②PCR及相关应用技术，包括等位基因特异寡核苷酸探针（Allele Specific Oligoneucliotides，ASO）杂交法、单链构象多态（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析、DNA限制性片段长度多态性（Restrictionfragment Length Polymorphism，RFLP）分析、微卫星DNA