重组DNA技术

载体DNA分子，需要具备：
具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我 复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制
具有多克隆位点(multiple cloning site, MCS)，而每 一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。 这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基 因内
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)
聚合酶链式反应是体外快速扩增DNA的方法
PCR反应包括三个步骤： 变性(denature)：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链 低温退火(annealing)：两个引物分别与单链DNA互补复性
延伸(extension)：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃ 合成模板DNA的
因文库 筛选目的克隆 基因表达与产物分离
基因工程的相关技术
核酸的分子杂交 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction):
PCR和RT-PCR (reverse transcription PCR)
核酸的分子杂交
Southern blot-DNA Northern blot-RNA In situ hybridization Fluorescent In situ hybridization
细菌质粒载体
◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能 自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子
☆这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制 后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个
◆早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它 们仅能用于克隆分子量小于10kb( 1000bp =1kb)的外源 DNA片段
☆现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检 测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒 是否携带外源DNA片段
λ噬菌体
◆ λ噬菌体基因组全长49kb。λ噬 菌体DNA中间约三分之二的序列为 中间基因簇，位于两端的为DNA左、 右臂。λ基因组的中间基因簇序列 可被外源DNA片段取代, 而不影响 噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能 力
限 制 性 内 切 核 酸 酶
粘性末端 平整末端
其它工具酶
T4 DNA连接酶(ligase) 反转录酶（reverse transcriptase)
载体(vector)
一个DNA片段只有与适合的载体(vector) DNA 连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下， 才可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并 在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为 DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵 母菌人工染色体（BAC、YAC）等
基因工程重要特征：
可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系 的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的 遗传特性，创造出生物的新性状
某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备 大量纯化的DNA片段提供了可能
基因工程技术路线
DNA片段的取得（目的基因的分离和制备） DNA片段和载体的连接——重组体DNA 外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基
至少具有一个选wenku.baidu.com标记基因，使有或无载体的宿主 细胞具有易鉴别的表型
易从宿主细胞中回收。 较小的相对分子量和较高的 拷贝数
安全性
载体(vector)的种类
细菌质粒载体 λ噬菌体 柯斯质粒(cosmid) 穿梭载体 酵母人工染色体（yeast artificial
chromosome，YAC） Ti质粒
目的: 是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状， 并能稳定遗传。
基因工程的概念
genetic engineering
定义： 又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片 断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受 体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。基因工程是 采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的 现代方法和手段建立起来的基因操作技术。
重组DNA技术（基因工程）
基因工程 基因工程的风险和伦理学问题
基因工程
基因工程概述 基因工程的相关技术 基因工程的工具酶 载体 基因工程的基本步骤 基因工程的应用
基因工程的概念 genetic engineering
基因工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的基因 工程包括：整体水平，如生物的有性杂交；细胞水平， 如细胞融合；分子水平，染色体工程、基因克隆等。 狭义的基因工程即是通常讲的基因克隆。
◆ λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb 的外源DNA片段，它既可作为克隆 载体，也可作为表达载体，在基因 库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌 质粒相比，具有易操作、阳性克隆
数多等特点，现广泛用于各类基因 库的构建
柯斯质粒(cosmid)
➢ 柯斯质粒(cosmid)是利 用部分λ噬菌体DNA与 部分细菌质粒DNA序 列组建而成的
Southern blot
Northern blot
analysis of BLTR mRNA
Tracing and Assaying Molecules Inside Cells
In situ hybridization for RNA localization in tissues.
Fluorescent In situ hybridization
这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环
RT-PCR
限制性内切核酸酶
限制性内切核酸酶或限制性酶(restriction enzymes) 是细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子的一类 酶。以限制(restriction )或阻止病毒侵染
限制性酶据其作用特点，可分为两类 ※第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机切割双链 DNA分子，没有序列特异性 ※第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确 地酶切双链DNA的特异序列。第Ⅱ类限制性酶识别的 序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与 其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方 向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列 (palindrome)