基因工程概述
4 基因工程药物概述
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1972年美国斯坦福大学的Berg获得了SV40和λDNA重组的 DNA分子 1973年美国斯坦福大学的Cohen 等人，将大肠杆菌R6-5质 粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101质粒 DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，产生同 时表现出两种抗性的细菌。 Cohen与Boyer等合作，将非洲爪蟾编码核糖体的基因同 pSC101质粒构成重组DNA分子，并导入大肠杆菌，证实动 物基因进入了细菌细胞，并在细菌细胞中增殖和转录产生相 应的mRNA。
基因工程药物概述
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名词解释：基因工程
基因工程是通过对核酸分子的插入、拼接和重组而实 现遗传物质的重新组合，再借助病毒、细菌、质粒或 其他载体，将目的基因转移到新的宿主细胞系统，并 使目的基因在新的宿主细胞系统内进行复制和表达的 技术。基因是DNA分子上的一个特定片断，因此基因 工程又称DNA分子水平上的生物工程，其主要研究任 务是有关基因的分离、合成、切割、重组、转移和表 达等。所以基因工程又称基因操作、基因克隆或DNA 重组等。
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市场
欧美成熟市场占了71.4%，拉美及亚非市场虽然目前仅占 5.7%及12.7%，但其增长率分别为12.75和15%,远高于北 美1.9%的增长率。 IMS预测，药品支付者对医保体系的影响力更大，未来市 场增长的来源已经从欧美国家转移到新兴市场；在未来五 年内，新兴市场对利润的贡献将与与传统成熟市场平分秋 色。 制药业巨头已经在新兴市场投入多年，投资范围不仅限于 大家普遍看好的“金砖四国”（巴西，俄罗斯，印度，中 国），还进一步扩展到沙特阿拉伯、越南、智力、委内瑞 拉、马来西亚、泰国、土耳其和墨西哥等国家。
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制药巨头的并购
《生物技术概论》1基因工程
二、目的DNA片段的获得
（三）DNA片段的化学合成 1.合成引物 2.合成DNA寡核苷酸连杆 3.合成基因片段
第二节 DNA重组
三、DNA片段的连接
（一）DNA连接酶 （二）DNA片段之间的连接 1. 互补黏性末端片段之间的连接 2.平末端DNA片段之间的连接 3.DNA片段末端修饰后进行连接 4. DNA片段加连杆或衔接头后连接
（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下 一代
第一节 基因工程概述
三、基因工程操作的基本技术路线
第一节 基因工程概述
四、基因工程研究最突出的优点
打破了常规育种难以突破的物种之间的界限， 可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物 之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆 菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动 植物中表达。
第二章 基因工程
第一节 基因工程概述
一、基因工程的含义
按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种 性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创 造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含 义。
第一节 基因工程概述
二、基因工程研究的理论依据
（一）不同基因具有相同的物质基础 （二）基因是可以切割的 （三）基因是可以转移的 （四）多肽与基因之间存在对应关系 （五）遗传密码是通用的
质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体 基因组和叶绿体基因组也有少量的基因
第四节 目的基因的制备
二、分离目的基因的途径
（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离 目的基因
基因工程的主要内容
基因工程的主要内容一、基因工程的概述基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的结构和组成，以实现对其性状和功能进行调控的技术。
它涉及到生物学、化学、计算机科学等多个领域，是当今生命科学领域中最为重要的技术之一。
二、基因工程的主要内容1. 基因克隆基因克隆是指将特定基因从一个生物体中分离出来，并将其插入到另一个生物体中。
这样可以使得目标生物体具有某种特定性状或功能。
常用的基因克隆技术包括PCR扩增、限制酶切割、电泳分离等。
2. 基因编辑基因编辑是指通过CRISPR/Cas9等技术直接对目标基因进行修改，以实现对其性状和功能进行调控。
这种方法可以精确地修改目标DNA序列，从而达到精准治疗的效果。
3. 基因表达调控基因表达调控是指通过改变目标基因的转录和翻译过程，以实现对其表达水平和时间的调节。
常用的方法包括转录因子介导的启动子激活、RNA干扰、CRISPRi等。
4. 基因药物开发基因药物是指通过对特定基因进行调控，以实现治疗某些疾病的药物。
常见的基因药物包括基因表达调控剂、基因编辑剂等。
这些药物可以精准地靶向特定的疾病基因，从而达到更好的治疗效果。
5. 基因检测基因检测是指通过对个体DNA序列进行分析，以了解其患某种遗传性疾病的风险。
常用的基因检测方法包括PCR扩增、DNA测序等。
三、应用前景随着生命科学技术的不断发展和进步，基因工程技术在医学、农业、环境保护等领域中得到了广泛应用。
在医学领域中，基因工程技术可以用于治疗癌症、遗传性疾病等；在农业领域中，可以用于改良作物品种、提高产量和抗逆性能；在环境保护领域中，则可以用于生态修复和污染治理等方面。
四、风险和挑战尽管基因工程技术具有广泛的应用前景，但也存在着一些风险和挑战。
首先，基因工程技术可能会引起生态系统的破坏和生物多样性的丧失；其次，基因工程技术可能会导致人类健康和安全方面的问题；最后，基因工程技术还涉及到伦理和道德问题，需要加强监管和规范。
五、结论总之，基因工程技术是一种非常重要的生命科学技术，具有广泛的应用前景。
基因工程概述
基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制，转录，翻译外援目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
基因工程的目标是实现转基因生物性状的定向改良，技术上包括基因或DNA 的体外重组，转基因，重组子筛选与扩大繁育等多个环节，目的性和技术性都很强，需要严密的实验设计。
基因工程的技术流程包括以下几个基本环节：目的基因克隆，载体的准备，目的基因与载体的连接，重组DNA转化/转染/转导，重组体的筛选与鉴定，最后是重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用。
从技术流程来看，基因工程包括四个基本条件：目的基因，载体，工具酶以及宿主细胞。
基因工程的发展经历了理论和技术的酝酿，诞生和快速发展等几个阶段。
遗传物质DNA 的确定，DNA双螺旋结构的提出以及半保留复制机制的届是以及中心法则的提出为基因工程的诞生奠定了理论基础，而限制性内切酶核酸，连接酶的发现，载体的应用以及大肠杆菌转化体系的建立则为基因工程的诞生奠定了重要的技术基础。
基因工程能够真正应用离不开酶学，DNA重组技术的建立和发展是以各种核酸酶的发现和应用为基础的，特别是限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子的体外切割与连接真正成为可能。
通过切割相邻两个核苷酸残疾之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶叫做核酸酶，把应用于基因工程的各种核酸酶统称为基因工程的工具酶。
基因工程中常用的工具酶有：限制性内切核酸酶（特异切割DNA），DNA连接酶（DNA 片段间连接，产生重组DNA分子），DNA聚合酶Ⅰ（切口平移制作高比活探针；3’突出末端DNA分子标记），Klenow片段（3’凹陷末端的补平；双链DNA 3’末端标记；延伸寡核苷酸引物合成探针），TaqDNA聚合酶（PCR），反转录酶（合成cDNA），碱性磷酸酶（去磷酸化，防止载体自身连接），RNA酶（去除基因中的RNA）。
基因工程概述
第一章 基因工程
第一节 基因工程概述
•主要内容：
（1）基因工程的概念 （2）基因操作的工具 （3）基因操作的基本步骤
一、 基因工程的概念 这种技术是在生物体外，通过对 DNA分子进行人工“剪切” 和“拼接”，对生物的基因进行 改造和重新组合，然后导入受体 细胞内进行无性繁殖，使重组基 因在受体细胞内表达，产生出人 类所需要的基因产物。
三、将目的基因导入受体细胞
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农 • 常用的受体细胞： 杆菌、酵母菌和动植物细胞等
将目的基因导入 植物细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
1、将目的基因导入植物细胞
特点: （1）农杆菌 转化法
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起 始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对 mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因 从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同 而有所差别
3、基因的运输工具——运载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物 体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细 胞内去！能将目的基因送入细胞的工具就是运载体。 运载体必须同时满足 三个要求： ①具有多个限制酶切点； ②能进入受体生物细胞并 在受体生物细胞内复制并 表达； 目 ③具有标记基因。 的 基 常用的载体有质粒、 因 插 噬菌体、动植物病毒等； 入 最早用的载体是一种环状 位 点 DNA——质粒。
基因工程的五个基本流程
基因工程的五个基本流程一、基因工程的概述基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的结构和组成，从而达到改变其性状和功能的技术。
基因工程技术的应用范围广泛，包括农业、医药、工业等领域。
二、基因工程的五个基本流程1.选择目标基因选择目标基因是进行基因工程的第一步。
目标基因可以是已知的具有特定功能的基因，也可以是未知的探索性研究对象。
在选择目标基因时需要考虑多个方面，如所需功能、适用范围、安全性等。
2.克隆目标基因克隆目标基因是进行基因工程的关键步骤之一。
克隆目标基因需要进行以下几个步骤：（1）提取DNA：从生物体中提取DNA。
（2）切割DNA：使用限制性内切酶将DNA切割成特定长度。
（3）连接载体：将目标DNA片段与载体连接起来。
（4）转化宿主细胞：将连接好的载体转化到宿主细胞中。
3.构建重组表达载体构建重组表达载体是进行基因工程的另一个重要步骤。
重组表达载体是将目标基因嵌入到载体中，使其能够在宿主细胞中表达。
构建重组表达载体需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的载体：选择合适的载体，如质粒、病毒等。
（2）插入目标基因：将克隆好的目标基因插入到载体中。
（3）调节表达：调节重组表达载体的启动子和终止子，以控制目标基因在宿主细胞中的表达。
4.转染宿主细胞转染宿主细胞是将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中进行表达。
转染宿主细胞需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的宿主细胞：选择合适的宿主细胞，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等。
（2）转染重组表达载体：将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中。
（3）筛选阳性克隆：通过筛选阳性克隆来确定成功转移和表达目标基因的细胞。
5.分离和纯化目标蛋白分离和纯化目标蛋白是将表达出的目标基因转化为蛋白质，并对其进行分离和纯化的过程。
分离和纯化目标蛋白需要进行以下几个步骤：（1）破碎宿主细胞：将表达目标基因的宿主细胞破碎，释放出目标蛋白。
（2）分离目标蛋白：使用不同的技术对混合物进行分离，如层析、电泳等。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。
基因工程技术
基因工程技术基因工程技术是一种可以人为地操控生物体的遗传信息的科学技术。
通过基因工程技术，科学家可以对生物体的基因进行修改、调整和插入新的基因，从而改变生物体的性状和功能。
随着技术的不断发展，基因工程技术在医学、农业、工业等领域具有广泛的应用和潜力。
本文将从基因工程技术的概述、医学应用、农业应用和伦理道德等方面进行论述。
一、基因工程技术的概述基因工程技术是一种通过修改、调整和插入基因的技术，以改变生物体的性状和功能。
它主要包括基因克隆、基因传递和基因表达等步骤。
在基因克隆中，科学家通过提取和复制目标基因，得到多个基因的复制体。
在基因传递中，复制体被导入到宿主细胞中，成为宿主细胞的一部分。
在基因表达中，目标基因将在宿主细胞中被转录和翻译，从而产生蛋白质。
基因工程技术的应用范围广泛，包括医学、农业、工业等领域。
二、基因工程技术的医学应用基因工程技术在医学领域有着广泛的应用。
例如，通过基因工程技术，科学家可以制造大量的重组人胰岛素，用于治疗糖尿病患者。
此外，基因工程技术还可以用于制造基因药物，如基因治疗药物，通过将正常基因导入患者体内，修复患者体内缺陷基因的功能。
此外，基因工程技术还可以用于生产疫苗、生物传感器和生物材料等。
三、基因工程技术的农业应用基因工程技术在农业领域也有着广泛的应用。
例如，通过基因工程技术，科学家可以改良农作物的抗病性、耐逆性和品质。
其中，转基因作物是指经过基因工程技术改造的农作物，其具有抗虫、抗病、耐旱等优点。
转基因作物的种植可以提高农作物的产量和质量，减少杀虫剂和农药的使用量，对于解决世界饥饿问题具有重要意义。
四、基因工程技术的伦理道德问题随着基因工程技术的发展，伦理道德问题也逐渐引起人们的关注。
人们担心基因工程技术可能带来的道德伦理问题，如基因歧视、基因改良婴儿和生物多样性等。
基因歧视是指在就业、教育和社会等方面，基于基因信息造成的不平等对待。
基因改良婴儿是指使用基因工程技术修改胚胎的基因，以达到某种预期的效果。
生物学案：第章第节基因工程的概述
第一节基因工程的概述一、基因工程的诞生和发展1．基因工程的理论基础（1)艾弗里证明了DNA是__________；沃森和克里克阐明了DNA分子的______________;尼伦贝格等破译了__________.(2）限制性__________酶和__________酶等工具酶、质粒等载体和________酶的发现,直接促使了基因工程的诞生。
（3）基因工程的诞生和发展经历了三个时期：1973～1976年为________，1977～1981年为________，1982年以后为__________________________。
1973年，美国科学家______等将两种不同来源的DNA分子进行体外重组，并首次实现了重组DNA分子在大肠杆菌中的表达，创立了______________的新技术—-基因工程。
2．基因工程基因工程是指在体外通过人工“______”和“______”等方法，对生物的基因进行______和__________，然后导入受体细胞并使重组基因在受体细胞中______,产生人类需要的________的技术。
因而，基因工程又称为____________.基因工程是在基因水平上操作、改变生物的________的技术。
预习交流根据基因工程的概念分析,基因工程的操作对象、操作环境、操作水平和基本方法分别是什么?二、基因工程的工具—-酶与载体1．限制性核酸内切酶——分子手术刀科学家们陆续发现了____________限制性核酸内切酶。
每种限制性核酸内切酶只能识别特定的__________,并在特定的位点上切割DNA分子。
大部分限制性核酸内切酶在切开DNA双链时,切口处的两个末端都带有伸出的由若干特定核苷酸组成的单链,这种单链称为“__________”。
少部分限制性核酸内切酶在切开DNA双链时产生“__________"。
2．DNA连接酶——分子针线DNA连接酶可将用同一种______________切割形成的“__________"或“__________”连接起来.3．载体——将外源基因导入受体细胞的运载工具常用的载体有______、__________、____________等.其中______是最早应用的载体。
基因工程的概述
基因工程的概述定义：狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
基因工程又被称为基因拼接技术或者DNA重组技术，可分为微生物基因工程、动物基因工程和植物基因工程三种生物转基因技术。
其主要特点是通过人工转移的方式，将一种生物的基因转移到另外一个受体细胞中，并使该转移基因在受体细胞中表达，从而获得全新的具有生物活性的产物。
基因工程技术为遗传物质研究和医药研究提供了重要的技术支撑。
动物基因工程技术利用先进的生物技术手段对动物基因进行编辑和改造，以达到揭示基因功能和利用基因治疗疾病等目的。
常见的动物基因工程技术包括基因敲除、基因敲入、基因编辑和转基因技术等。
通过使用基因编辑工具精确地切割和删除目标基因的特定区域，使该基因在动物个体中的表达缺失，可以揭示该基因在特定生理过程中的功能和调控机制。
基因治疗能够通过修复或替换患有遗传性疾病的动物个体的缺陷基因来达到治疗和预防遗传疾病的目的。
如利用基因编辑技术可以修复猫头鹰视网膜变性等遗传性视网膜疾病，从而改善视力。
微生物具有结构简单、迅速繁殖的特性，在其繁殖发展中应用生物基因工程技术能取得显著的效果。
将外源基因转入微生物中表达，使微生物能够生产人所需要的产品，如抗体和药用蛋白质等。
利用基因工程技术开发的重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗及基因疫苗，有利于打破传统疫苗的局限性。
植物细胞具有全能性，在特定环境下，植物组织或者细胞能够生长出完整的植株。
所以，可以将药物基因组合到植物细胞内，通过分别培养，得到具有药物基因的植株。
植物独特的稳定遗传特性为医药领域的发展提供了充足而良好的条件。
目前，借助植物基因工程制造的药物有纯化的血清蛋白、干扰素与脑啡肽等。
基因工程基础知识
第一章基因工程第一节基因工程概述由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。
二．基因工程的基本工具（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（二）“分子针线”——DNA连接酶1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。
(三)“分子运输车”——载体1.载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。
三．基因工程的基本过程(一) 获得目的基因（目的基因的获取）1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。
②用人工的方法合成。
★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
2.利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
高中生物22基因工程(一)基因的结构和基因工程的基本工具-知识讲解
基因工程（一）基因的结构和基因工程的基本工具编稿：闫敏敏审稿：宋辰霞【学习目标】1、了解基因工程的诞生及概念。
2、知道基因的结构。
3、简述DNA重组技术所需三种基本工具及其应用（重点、难点）。
【要点梳理】要点一、基因工程概述要点二、基因工程的诞生【高清课程：基因工程（一）基因的结构和基因工程的基本工具 369163 基因工程的诞生】1.遗传基础理论的重大突破艾弗里、赫尔希、蔡斯等人证明DNA是遗传物质1953年，沃森和克里克提出DNA双螺旋结构1958年，梅塞尔森和斯塔尔证明DNA的半保留复制1963~1967年，尼伦伯格、马太、霍拉纳破译遗传密码中心法则的提出和完善指出遗传信息在大分子间的传递2.技术发明使基因工程的实施成为可能技术上三大发明：⑴基因转移载体的发现——1967年，T.F.Roth（罗思）&D.R.Helinski（海林斯基）发现质粒的自我复制能力，并能够在细菌之间转移。
⑵工具酶的发现——1972年， H.C. Smith 、W.Arber & D.Nathans从流感嗜血杆菌中分离得到限制性内切酶；1970年，逆转录酶的发现使真核细胞的基因制备成为可能；此后，多种限制酶和连接酶被发现。
⑶DNA体外重组的实现—1972年，美国 Berg 第一次构建出了体外重组DNA分子。
重组DNA表达实验的成功—1973年，H.Boyer & S.Cohen选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。
重组的DNA转入大肠杆菌DNA中，转录出相应的mRNA。
3.技术进一步推动基因工程的发展：⑴第一例转基因动物和转基因植物问世1980 年，科学家通过显微注射培育出世界第一个转基因小鼠。
1983年，科学家采用农杆菌转化法，培育出世界上第一例转基因烟草。
⑵PCR技术的发明1988年，美 K.Mullis发明PCR技术，使基因工程进一步发展。
基因工程与食品产业PPT课件
Paul Berg (who shared the 1980 Nobel Prize in chemistry for this work).
1972 Stanley Cohen and Herbert Boyer discover recombinant DNA technology, considered to be the birth of modern biotechnology
食品基因工程：利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏加工性状以及感官性状的技术。
（二） 基因工程的主要内容
概括起来，基因工程的操作过程一般分4个步骤。
获得目的基因；将目的基因与载体连接形成重组DNA；将重组DNA导入受体细胞；筛选出能表达目的基因的受体细胞
底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP
聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶简写 为 DNA-pol
模板(template) : 解开成单链的DNA母链
引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合
解螺旋酶引物酶单链DNA结合蛋白DNA连接酶等
在农业上，基因工程发展速度势头强劲。据统计，2000年全球转基因作物种植面积由1996年的170万hm2，增加到4 420万hm2，增加了25倍之多。 2000年美国、加拿大、阿根廷、中国4个国家转基因作物的种植面积占全球种植面积的99.9％。 全世界转基因作物按种植面积排序分别为大豆、玉米、棉花、油菜籽。
例如，EcoR I中的Eco表示从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出来的，R代表大肠杆菌的R株， I表示从中分离出的第一种限制性内切酶。
什么是基因工程
1.什么是基因工程的定义和概念？基因工程是一门利用分子生物学和遗传学技术对生物体的基因进行操作和改变的科学领域。
它涉及将外源基因导入到目标生物体中，或者对目标生物体的内源基因进行修改，以实现特定的目标。
基因工程的目的是通过改变生物体的基因组来增强其特定性状，或者为人类社会的需要创造新的生物体。
这种改变可以包括插入、删除或修改基因序列，以改变生物体的特征、功能或表达。
基因工程的概念基于对基因的理解和技术的发展。
基因是生物体遗传信息的基本单位，它决定了生物体的遗传特征和功能。
通过基因工程，科学家可以精确操作基因，使得生物体具有特定的性状或功能。
基因工程在农业、医学、工业等领域具有广泛的应用。
在农业上，基因工程可以改良作物，使其具有抗病虫害、耐逆性和提高产量等性状。
在医学上，基因工程可以用于治疗遗传性疾病，生产重组蛋白药物以及开发基因诊断和基因治疗等领域。
在工业上，基因工程可以用于生产生物燃料、酶和其他生物化学品。
然而，基因工程也引发了一些伦理和安全问题，例如对环境和健康的潜在影响，以及基因编辑的道德和法律考量。
因此，基因工程的发展需要平衡科学发展、社会需求和伦理原则之间的关系。
总之，基因工程是一门重要的科学领域，它通过改变生物体的基因组来实现特定目标，具有广泛的应用前景和深远的影响。
2.基因工程的历史和发展背景是什么？基因工程是现代生物技术领域中的重要分支，它的发展可以追溯到20世纪中叶。
以下是基因工程的历史和发展背景的概述：发现DNA结构和基因的本质：在20世纪的早期，科学家们开始对生物遗传的本质进行研究。
1953年，詹姆斯∙沃森和弗朗西西斯∙克里克发现了DNA的双螺旋结构，揭示了基因的分子组成和遗传信息的传递方式。
这一发现奠定了基因工程的理论基础。
重组DNA技术的出现：1972年，保罗∙伯戈和斯坦利∙科恩等科学家首次成功地使用限制性内切酶切割DNA，并将来自不同来源的DNA片段重新组合，形成了重组DNA技术的基础。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1、什么就是基因工程,基因工程得基本流程？基因工程(Genetic engineering)原称遗传工程。
从狭义上讲,基因工程就是指将一种或多种生物体(供体)得基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们得意愿遗传并表达出新得性状。
因此,供体、受体与载体称为基因工程得三大要素。
1、分离目得基因2、限制酶切目得基因与载体3、目得基因与载体DNA在体外连接4、将重组DNA分子转入合适得宿主细胞,进行扩增培养5、选择、筛选含目得基因得克隆6、培养、观察目得基因得表达第二章基因工程得载体与工具酶1、基因工程载体必须满足哪些基本条件？➢具有对受体细胞得可转移性或亲与性。
➢具有与特定受体细胞相适应得复制位点或整合位点。
➢具有多种单一得核酸内切酶识别切割位点。
➢具有合适得筛选标记。
➢分子量小,拷贝数多。
➢具有安全性。
2、质粒载体有什么特征,有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1、克隆质粒2、测序质粒3、整合质粒4、穿梭质粒5、探针质粒6、表达质粒3、质粒得构建(1)删除不必要得 DNA 区域,尽量缩小质粒得分子量,以提高外源 DNA 片段得装载量。
一般来说,大于20Kb 得质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定。
(2)灭活某些质粒得编码基因,如促进质粒在细菌种间转移得 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验得安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应得基因,提高质粒得拷贝数(3)加入易于识别得选择标记基因,最好就是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒得受体细胞。
(4)在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点得 DNA序列,即多克隆接头(Polylinker),便于多种外源基因得重组,同时删除重复得酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因得准确插入。
(5)根据外源基因克隆得不同要求,分别加装特殊得基因表达调控元件。
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用同种限制酶切割
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CTTAA G 基因的针线：DNA连接酶
CTTAA G
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DNA连接酶
DNA连接酶
1、连接酶的作用： 将互补配对的两个黏性末端连接起来， 使之成为一个完整的DNA分子。
2、连接的部位 ：
将受体细胞 进行扩增
• 目的基因可以随着受体细胞进行 快速的繁殖，在很短的时间内获 得大量的基因。
筛选含有目的基因的受体细胞
筛选含有目的基因的受体细胞
前三步的处理十分繁锁，为保证目的 基因得到有效利用，通常用大量的受体细 胞来接受不多的目的基因。这样，处理的 受体细胞中真正摄入了目的基因的很少， 必须将它从中检测出来。
2、原理 通过基因重组技术,让目的基因
：
在受体细胞中稳定和高效表达
操作水平
3、操作水平： DNA分子水平 4、结果： 定向地改造生物的遗传性状，
获得人类所需要的品种。
为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上？ DNA是生物的主要遗传物质 DNA都是由四种脱氧核苷酸形成的规则的双螺旋结构
推测这种“嫁接”怎样才能实现？
将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来
取出 DNA
用限制酶 切断DNA
目前被较广泛 提取使用的目的基 因有：苏云金杆菌 抗虫基因、人胰岛 素基因、人干扰素 基因、种子贮藏蛋 白基因、植物抗病 基因等。
人工基因合成法
2、人工基因合成法
1. 直接合成法：已知某基因的序列的前 提下,可以用化学方法合成或 用PCR 技术扩增大量获取目的因.(如胰岛素 基因)
• 世界生物技术产业现状 （2001统计数据）
全球生物技术公司4284家 ；美国1457家。 全球收入384.7亿美元；美国253.19亿美元 全球研发费用164.27亿美元；美国115.32亿美元
• 我国生物技术产业现状
300家公司，有能力生产的150家，上市40多家。 产品总销售额200亿RMB。
DNA合成仪
想一想:还有其他的方法可以合成目 的基因吗?
1. 逆转录法:以信使RNA为模板，在逆 转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合 成DNA(基因)。
PCR扩增仪
2. 根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使 RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因 DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱 氧核苷酸直接合成相应的基因。
基因工程操作的工具
基因工程操作的工具
1. 将目的基因片断从受体细胞内提取，
需要基因的剪刀——限制性核酸内切酶。
2. 将目的基因与质粒DNA连接，
需要基因的针线——DNA连接酶。
3. 将目的基因运入大肠杆菌，
需要基因的运输工具——运载体。
限制性核酸内切酶
2020年4月27日星期一
限制性核酸内切酶
转基因鱼
转基因鱼
转基因鱼
转基因蚕
转基因蚕
据日本共同社报道，日本农业生物 资源研究所与群马县蚕丝技术中心 等研究组10月24日宣布成功大量培 养出了可结出荧光色蚕茧的转基因 蚕，并研发出了能保持发光特性而 将蚕茧转为生丝的方法 研究组通过多次对转基因蚕进行交配，解决了蚕茧较小的缺点， 并培养出含绿、红、橙3色荧光蛋白质的转基因蚕各两三万只。
目的基因与运载体结合-----形成重组DNA
目的基因与运载体结合-----形成重组DNA
用限制酶切割目的基因 和用相同的限制酶切割 质粒使之出现一个切口 ，将目的基因插入切口 处，让目的基因的黏性 末端与切口上的黏性末 端互补配对后，在DNA 连接酶的作用下连接形 成重组DNA分子
提取质粒并用 限制酶切割
康活泼，与另外两只小猴生活在
特制的“公寓”里。
俄勒冈州波特兰市俄勒冈卫生科技大学俄勒冈区域灵长类研究中
心的专家沙藤说：“举例而言，我们可以轻易的植入老年痴呆症基
因，以加速发展出治疗此种疾病的疫苗。”
转基因番茄
转基因番茄
以色列研究人员日前宣布，他们利用 转基因技术培育出一种具有柠檬和玫 瑰香味的新品种番茄。生成类胡萝卜 素的其他农作物和花也可以像番茄一 样，通过转基因技术改变气味和口味 吃个番茄也能抗乙肝，。这绝非天方夜谭。每天坐在家里， 吃上三五只西红柿，人们体内就能产生乙型肝炎病毒的抗体， 达到和注射疫苗一样的效果。 中国农科院生物研究所有关研究人员指出，“利用转基因 植物生产乙型肝炎口服疫苗”是国家863高新生物技术领域中的 一项研究，该项研究经过研究人员的共同努力，现已取得重大 成果，科研人员在研制出转基因马铃薯后，现又将乙型肝炎病 毒包膜中蛋白抗原基因成功导入西红柿并获得稳定和高效表达 ，这就意味着，人们不必忍痛，轻松地吃几个西红柿就能将谈 之色变的乙型肝炎轻松拒之于身外。
质粒
质粒
质粒是能自主复制的双链环状DNA分子
质粒
质粒
标记基因，便于进行检测
基因操作的基本步骤
基因操作的基本步骤
1. 获取目的基因 2. 形成重组DNA分子 3. 将重组DNA分子导入受体细胞 4.筛选含有目的基因的受体细胞 5.目的基因的表达
提取目的基因的方法
提取目的基因的方法 1、直接分离基因
基因工程概述
2020年4月27日星期一
什么是生物技术？
1、生物技术 = 生物工程
生物技术是应用自然科学及工程学的原理， 以微生物、动物、植物作为反应器，将物料进行 加工，以提供产品为社会服务的技术。
2、现代生物工程：
发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工 程、蛋白质工程
生物技术现状如何？
生物技术现状如何？
基因工程
基因工程
• 20世纪70年代随着DNA重组技术的出现而发 展出来。
• 对基因进行加工，使生物体发展成为新的 有机生物体。
• 是生物工程四兄弟中发展最迅速，威力最 大的一个。 各种生物工程在实施上大多离 不开基因工程手段，现代生物技术中，主 要的是基因工程。
基因工程定义
基因工程(gene engineering)
这种蚕被导入了水母、珊瑚等的荧光蛋白质基因，所结的茧在自 然光照射下呈淡绿色或粉色，但经蓝色发光二极管等光线照射后， 通过滤镜观察则呈荧光色。该成果有望应用于衣料及家装等领域。
由于以前用热水煮茧抽丝的方法会破坏荧光蛋白质，研究组在低 于60度的真空锅中加入药剂煮茧抽丝。
此外，研究组还培养出了新的转基因蚕，这种蚕吐出的丝比普通 丝细一成且不易断，还具有易于粘合细胞的性质。据称这一成果有 望被应用于人造血管等领域
转基因猴
世界上首例转基因灵长类动 物—转基因猴“安迪”
为人类最终战胜糖尿病、乳腺癌
、爱滋病、帕金森氏症和艾滋病
等顽症提供帮助。
完成此项研究的美国俄勒冈保健
科学大学提供的新闻公报称，这
只名为“安迪”（Andi）的恒河猴
于2000年10月2日诞生，它是由
一粒被植入追踪基因的未受精卵
孕育而成的转基因猴。它目前健
检测依据：
受体细胞是否具运载体特有的“标记基因”所控制 的性状
目的基因的表达
磷酸二酯键，不是氢键。
运载体
运载体
要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体 内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞 内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体
1、条件： ①能自我复制 ②含有限制性内切酶的位点 ③含有筛选标记，一般为抗性基因 ④能启动外源目的基因的转录和翻译 ⑤能在宿主细胞内复制并稳定地保存 2、种类： 细菌、酵母质粒、改造和修饰后的噬 菌体、病毒DNA
又称基因操作(gene manipulation), 重组DNA(recombinant DNA)。基因工程是以 分子遗传学为理论基础,以分子生物学和微 生物学的现代方法为手段,将不同来源的基 因(DNA分子), 按预先设计的蓝图，在体外 构建杂种DNA分子,然后导入活细胞, 以改变 生物原有的遗传特性,获得新品种, 生产新 产品, 或是研究基因的结构和功能。
问题
问题：
1.已学过的育种方法有哪些？ 杂交育种、诱变育种、单倍体育种、 多倍体育种、转基因技术
2.基因工程方法育种的优越性体现在哪里?
能定向改造生物的性状 3.什么是基因工程?
基因工程的原理是什么?
1、基因工程：
又叫做基因拼接技术或DNA重组技术
通俗的说，就是按照人们的意愿，把 一种生物的某种基因提取出来，加以修 饰改造，然后放到另一种生物的细胞里 ，定向地改造生物的遗传性状。
2、分布： 主要在细菌中。
3、特点 特异性，即识别特定核苷酸序
：
列，切割特定切点
例如：大肠杆菌的一种限制性核酸内切酶能 识别GAATTC序列，并在G和A之间切开
4、结果： 产生黏性未端
被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？
被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？
G AAT T C
用连接酶将目的 基因和ຫໍສະໝຸດ 粒连接将重组DNA导入受体细胞并扩增
将重组DNA导入受体细胞并扩增
• 基因工程中常用的受体细胞有大
肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动 植物细胞等。如用质粒作运载体
将目的基因导 入受体细胞
,则选大肠杆菌为受体细胞
• 导入受体细胞常用的方法是借鉴 细菌或者病毒侵染细胞的途径。 通常还要对一些受体细胞进行增 大通透性的处理。