第八章 研究遗传多样性的基本原理和方法

３ ３ 以 ＰＣＲ 为基础的各种检测 ＤＮＡ 多样性的方法
Ｓａｉｋｉ １９８８ 用耐热的 ＤＮＡ 聚台酶完善了聚合酶链式反应 第一步是用专一的一对引 物 寡脱氧核苷 与变性的模板 ＤＮＡ 形成部分双链 退火 ３８ ６５ 第二步是聚合酶催化 从引物开始的 ＤＮＡ 合成 即延伸阶段 ４５ ７５ 第三步把合成的双链 ＤＮＡ 再变性 ８８０ ９７０ 为两条单链模板 模版 ＤＮＡ 加倍 再经过一个退火 延伸和变性周期 模版增加到 ４ 倍 通过 ３０ 个周期 模版 ＤＮＡ 扩增百万倍 Ｊｅｆｆｒｅｙｓ １９８８ 应用 ＰＣＲ 于 ＤＮＡ 指纹分析 提 出可以鉴定单个细胞的基因型 Ｗｉｌｌｉａｍｓ 等 １９９０ 用单个人工合成的随机排列的 １０ 个碱 基作为引物进行各种生物 ＤＮＡ 扩增 用琼脂糖电泳可以检测到丰富的多态性 称为随机扩增 多态 ＤＮＡ ＲＡＰＤ 原理是这种短引物能同时识别模版 ＤＮＡ 上不止一个同源位点同时扩增几 个 ＤＮＡ 片段 Ｃａｅｔａｎｏ－Ａｎｏｌｌｅｓ 等 １９９１ 改变扩增的条件 用更短的引物 ６ ９ 碱基 进 行 ＤＮＡ 扩增 然后用 ＰＡＧＥ 及银染显示扩增产物 得到极高水平的多样性 称为 ＤＮＡ 扩增指 纹 ＤＡＦ 类似的方法还有 Ｑ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ 扩增多态性 这些方法不经过花费时间的杂交阶 段 所用的模版 ＤＮＡ 量从微克级降到纳克甚至皮克级 １ 微克＝１０３ 纳克＝１０６ 皮克 大大节 省时间 实验材料和实验费用
龙膜因其机械性好 一张膜可反复与不同探针杂交而优于硝酸纤维素膜 放射性标记用自显 影检测 生物素 毛地地苷标记用酶联免疫方法及酶显色 应用发光底物大大提高灵敏度 达到或甚至超过放射性标记的水平 有关模板 ＤＮＡ 提取 限制酶使用 琼脂糖电泳 探针标 记及检测的细节请见 Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９ 著名的实验手册
Hale Waihona Puke Baidu
第八章研究遗传多样性的基本原理和方法
胡志昂 王洪新
１ 遗传多样性的定义 根据麦克尼利等 １９９０ 定义遗传多样性是遗传信息的总和 蕴藏在地球上植物 动物 和微生物个体的基因中 因此 通常谈及生态系统多样性和物种多样性时也就包含了各自 的遗传多样性 这里指的多样性主要是指种内不同群体之间或一个群体内下同个体的遗传变 异的总和 这或许可称是遗传多样性狭义的定义 施立明等 １９９３ ２ 遗传多样性研究简史 从远古时代进行动物驯养 植物栽培起 人类就开始了对生物遗传多样性的利用和认识 但是科学地总结并提高到理论高度进行系统化的首推达尔文 物种起源 第一章便是 在 家养状况下的变异 引用大量资料论证了栽培植物和家养动物种内丰富的显然是可遗传的 变异 并称之为多样性 Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ 在随后出版的 动物和植物在家养下的变异 一书做 了更全面详尽的论述 物种起源 的第二章 达尔文进一步讨论了自然状况下的变异 虽 然当时孟德尔遗传定律尚未被世人所知 但他根据野外观察 认为很多野生生物的个体差异 是遗传的 达尔文 １８６５ 中文版 １９５５ 变异是如此丰富和普遍 他专门写了 可疑的物种 一节 特别提到得康多尔 Ａ ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ 关于世界栋树的著作 其中对变异的频率还进 行了统计 该书中文版 １６５ 页还提到虎克博士从喜马拉雅山上不同高度的地点 采集了同种 的松树和杜鹃花属的种子 把它们栽培在英国 发现它们具有不同的抗寒力 也许这是后来 Ｔｕｒｅｓｓｏｎ 所提出的物种内存在 生态型 分化的最初实验研究 达尔文正是在总结遗传多 样性的基础上提出了进化理论 １９００ 年孟德尔遗传规律被广泛证实以及随后用生物统计方法对微小差异的遗传分析 为群体遗传学奠定了基础 Ｆｉｓｈｅｒ Ｈａｌｄａｎｅ 和 Ｗｒｉｇｈｔ 的学说要点是群体内突变产生不同 的基因型 即遗传多样性 自然选择和遗传漂变改变基因频率导致物种形成 后来被称为新 达尔文主义 ２０ 年代摩尔根染色体遗传学及后来发展成的细胞遗传学为群体遗传学理论提 供实验证据 例如 Ｄｏｂｚｈａｎｓｋｙ 对果蝇自然群体染色体倒位的研究 不管是形态还是染色体的多态性在自然群体中毕竟是罕见的 只有到了 ６０ 年代中期应 用凝胶电泳发现蛋白质和酶的高水平遗传多态现象 才使家养和自然群体生物遗传多样性的 研究得到了空前的发展 积累了大量资料 同工酶 尤其是等位基因编码的等位酶一般表现 为互显性遗传 适合定量分析 虽然 Ａｖｅｒｙ 等 １９４４ Ｈｅｒｓｈｅｙ 和 Ｃｈａｓｅ １９５２ 证明生物遗传信息载体是 ＤＮＡ 尤其 是 Ｗａｔｓｏｎ 和 Ｃｒｉｃｋ １９５３ 双螺旋模型提出并证实之后 遗传多样性在理论上应该是 ＤＮＡ 序列的多样性 但是 ＤＮＡ 序列多样性的检验因技术原因而迟迟不能进行 虽然 １９７２ 年实
简称 ＳＤＳ 下同 则为变性胶 可以进行蛋白质亚基的分离和分子量测定 ＰＡＧ 除进行电泳外 如用两性电解质代替缓冲液可进行等电点聚焦 分辨率极高并可 测定各蛋白的等电点 如果蛋白质先用等电点聚焦 后进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 称为双向电泳 蛋
白质的异质性得到最充分的表现 例如大豆种子蛋白双向电泳可分出 ４３０ 个斑点 Ｌｅｉ ＭｅｉＧｕｅｙ １９８３ 一般认为每一个斑点是一种蛋白 由单个基因或一个基因家族编码 ＰＡＧ 的主要问题是其单体和二体的高度神经毒性 为防止吸入粉未 胶母液的配制是将 一定量的蒸馏水直接加到刚开封的丙烯酰胺中 在原瓶里溶解 不进行称量 ＰＧＡ 的另一个 缺点是工作人员需经过培训 否则掌握不好聚合条件而使制胶失败 胶中蛋白质的染色现在常用考马氏兰 Ｒ－２５０ 或更灵敏的银染法 同工酶显色沿用组织化 学而很少变化 详细方法各种电泳手册中都可查到 电泳缓冲系统对蛋白的分离和酶显色有很大影响 ＳＧＥ 分离同工酶一直沿用 ６０ 年代到 ７０ 年代初的方法 几种不同 ｐＨ 的缓冲液分别用于不同酶的电泳分离和染色 其共同点是 胶的离子强度大大低于电极室缓冲液 胶的低离子强度有利于改变其 ｐＨ 以适合酶最高活 性的需要 电极室缓冲液浓度高 １０ ３０ 倍于胶 可能是因为用量少而且胶不是直接与 缓冲液接触而用滤纸或棉花做桥 有些人用 ＰＡＧＥＥ 代替 ＳＧＥ 但仍为水平电泳 沿用 ＳＧＥ 的 缓冲系统 但多数 ＰＡＧＥ 用垂直电泳如 Ｓｔｕｄｉｅｒ 槽 电泳缓冲液用 ＤａｖｉＳ １９６４ 的下连续 系统 分辨率极高 后来广泛应用的 Ｌａｅｍｍｌｉ １９７０ ＳＤＳ ＰＡＧＥ 系统就是其改良 Ｄａｖｉｓ 系统也可用于一些同工酶电泳分离 如过氧化物酶和淀粉酶 效果极佳 胡志昂 １９８１ 王洪新和崔徵 １９８３ 但用于另一些酶 分离和染色均差 可能是胶的离子强度和 ｐＨ 值 对某些酶均太高了 我们最近试验了不同浓度缓冲液对垂直 ＰＡＧＥ 分离同工酶的效果 看 来 高浓度的电极缓冲液并不必要 梯度胶明显改进酶的分离 证实了 ＭｃＬｅｌｌａｎ 等 １９８１ 将蛋白质反复原位转移到 ＤＥＡＥ 纸 Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ 的方法可以从一块胶 得到好几个不同的酶谱 动物血清 肌肉等都是分析酶和蛋白质的好材料 植物的种子 萌发的幼苗和芽也是好 材料 多年生植物的叶含大量酚类物质 在提取酶时酚氧化为酮结合蛋白干扰电泳 所以要 加酚吸咐剂如吡咯烷酮 ＰＶＰ 和抗氧化剂如抗坏血酸等 植物种子蛋白的多样性比同工酶高得多 Ｇｅｐｔｓ ｌ９９０ 我们用 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 和 ＰＡＧＥ 分析 中间锦鸡儿 Ｃａｒａｇａｎａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ 的种子蛋白 发现至少有 １７ 个可能的变异位点
３ ２ ＲＦＬＰ
基本步骤是用限制性内切酶消化从生物中提取的 ＤＮＡ 模板 ＤＮＡ 为不同长度的片段 用琼脂糖电泳分离开 并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上 然后用专一序列的标记 ＤＮＡ 探针 ＤＮＡ 在膜上与模板 ＤＮＡ 杂交 最后用自显影 或显色或发光分析显示与探针同源的 ＤＮＡ 片 段 因为限制酶识别专一的碱基序列 因此 ＤＮＡ 序列的变异会导致酶切点的消失或增加 限制片段的长度发生变化显示多样性 根据所用探针在模板上的考贝数 ＲＦＬＰ 可分为两类 一类以 ｃＤＮＡ 基因转录物的反转录物 作为探针的一般 ＲＦＩＰ 方法 另一类以小卫星 ＤＮＡ 为探针的 ＤＮＡ 指纹分析 Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ 法 前者只产生少数 甚至一条杂交带 例如 我们用渗调蛋白 ｃＤＮＡ 为探针 番茄 秘鲁番茄 ＤＮＡ 等都只产生 １ ２ 条不同分子量的杂交 带 Ｄｏｎｇ 等 １９９２ 后者可以得到几十条带 多样性特别丰富 Ｊｅｆｆｒｅｙｓ 等 １９８５ 用于 鉴别罪犯 诊断遗传病和病原 近来用来检测野生动植物群体的遗传结构 用于 ＲＦＬＰ 的限 制酶常包括价格较低的 ＥｃｏＲ Ｉ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 等 用于 ＤＮＡ 指纹的有 Ｈａｅ ＩＩＩ Ｈｉｎｆ Ｉ 等识别 小卫星重复序列的酶 最初标记探针用放射性同位素如 ３２ｐ 近年来非放射标记和检测方法 的发明克服了同位素半衰期短及放射性危害问题 应用越来越广泛 王洪新等 １９９３ 尼
现了基因克隆 １９７５ 年发明了快速直读的 ＤＮＡ 序列分析方法 可以比较基因的 ＤＮＡ 序列 但是基因克隆和序列分析要花费大量的人力物力 很难应用到群体的研究 １９７５ 年 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 发明 ＤＮＡ 片段经琼脂糖电泳按分子大小进行分离后转移到硝酸纤维素膜上用标记的探计进 行 ＤＮＡ－ＤＮＡ 杂交可以检测出同源片段的技术 ＤＮＡ 序列多样性开始可以检测出 即限制片段 长度多态性 ＲＦＬＰ 证明 ＤＮＡ 有比蛋白质更丰富的多样性 Ｓａｉｋｉ １９８５ 发明聚合酶链式 反应 ＰＣＲ 后 快速检测 ＤＮＡ 多样性的方法如随机扩增多态 ＤＮＡ ＲＡＰＤ 和 ＤＮＡ 扩增指纹
ＤＡＦ 在 １９９０ 年问世 生物基因图谱和 ＤＮＡ 全序列分析正在有组织地进行 完全检测生物 遗传多样性有了可能 总之 遗传多样性的研究是随着整个生物学的进步从传统的形态和细胞学 经过生物化 学进入分子生物学阶段 目前 主要的检测方法是针对蛋白质和 ＤＮＡ 分子 本文将着重介绍 这两个方面的原理和方法 并根据我们 ２０ 年的经验对各种方法的优缺点略加讨论 ３ 检测遗传多样性的方法
３ １ 蛋白质 酶 的凝胶电泳
最早的蛋白质凝胶电泳例如 Ｓｍｉｔｈｉｅｓ １９５５ 是淀粉凝胶电泳 简称 ＳＧＥ，下同 分离 人的血清蛋白 并有不同人群有不同的蛋白谱的报道 氨基酸顺序不同的蛋白质因所带电离 基团的不同而有不同的净电荷 在电场中显示不同的淌度而相互分离 用染蛋白质的染料可 以显示出来 不久 Ｈｕｎｔｅｒ 和 Ｍａｒｋｅｒｔ １９５７ 用酶组织化学染胶片 发现了酶的多分子形 式 称为同工酶 Ｉｓｏｚｙｍｅ Ｌｅｗｏｎｔｉｎ 和 Ｈｕｂｂｙ １９６６ 以果蝇为材料 首次报道自然群体 存在出乎意料的高度同工酶多样性 淀粉凝胶电泳方法虽然古老 但因淀粉无毒 操作简单 易学 一直广泛应用于动植物和微生物的群体同工酶分析 它的缺点有二 一是比后来发明 的聚丙烯酰胺凝胶电泳 简称 ＰＡＧＥ Ｒａｙｍｏｎｄ 和 Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ １９６９ 分辩率低 二是因为淀 粉是天然产物 不问牌号的产品性能个同 水解过程也会产生差别 因此即使同一厂家生产 的不问批号也会出现质量问题 国外报道最好的是 Ｃａｎｎａｕｇｈｔ 就是 Ｓｍｉｔｈｉｅｓ 在 １９５５ 所用 的产品 国产品尚未有合格的 这就是近一二十年国内学者偏向 ＰＡＧＦ 而不用 ＳＧＥ 的缘故 ＳＧＥ 的低分辨率有时反而成为优点 因谱带少 易十分析 易于推测其遗传背景 适合群体 遗传结构研究 但是用 尸检测遗传多样性 分辨率低有时会成为限制因子 无论是临床上 疾病诊断 如检测肝癌的胎甲球蛋白 还是农业上作物品种鉴定 胡志昂和王洪新 １９９１ ＰＡＧＥ 完全代替了 ＳＧＥ 蛋白质生物化学和整个分子生物学的研究工作从不用 ＳＧＥ 由于分辨 率低和胶机械性能差 ＳＧＥ 后 蛋白质不适合转移到膜作免疫分析 即 Ｗｅｓｔｅｒｎ 分析 聚丙烯酞胺凝胶 ＰＡＧ 在光学上是透明的 可以直接进行紫外扫描或染色后用可见光 扫描 光密度计的数据通过微机进行定性和定量 ＰＡＧ 由人工合成的丙烯酰胺聚合而成 质 量可控制 改变单体和二体交联剂的浓度可随意改变胶的孔径 适合不同分子量范围大分子 的分离 通过制备高 低两种浓度的胶液 用搅拌器逐级混合 可以铺出浓度梯度的胶 蛋 白质带被压紧 分于量的分辨率提高 电荷的效应降低 通过与标准分子量的蛋白质共同电 泳可以定出要分析的天然蛋白质的分子量 如在电极缓冲液和胶液中加入十二烷基硫酸钠