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流式淋巴细胞亚群检测技术原理ppt课件
淋巴细胞亚群检测
1
目录
1 淋巴细胞的分类 2 淋巴细胞亚群检测方法 3 淋巴细胞亚群检测原理 4 淋巴细胞亚群的免疫功能 5 淋巴细胞亚群的临床意义
2
淋巴细胞的分类
细胞免疫 T淋巴细胞
体液免疫 B淋巴细胞
淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%
固有免疫 NK细胞
3
检测方法
采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
21
T4细胞降低
提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒 感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显
T4细胞减少也可见于γ免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良 、严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等
22
T8细胞
主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素
等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。
细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分 选的技术
4
FCM
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
5
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
主要检测项目
T4细胞 总T细胞
T8细胞
淋巴细胞
B细胞 NK细胞
15
淋巴细胞的免疫标志
总T淋巴细胞 CD3+
T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
1
目录
1 淋巴细胞的分类 2 淋巴细胞亚群检测方法 3 淋巴细胞亚群检测原理 4 淋巴细胞亚群的免疫功能 5 淋巴细胞亚群的临床意义
2
淋巴细胞的分类
细胞免疫 T淋巴细胞
体液免疫 B淋巴细胞
淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%
固有免疫 NK细胞
3
检测方法
采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
21
T4细胞降低
提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒 感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显
T4细胞减少也可见于γ免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良 、严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等
22
T8细胞
主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素
等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。
细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分 选的技术
4
FCM
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
5
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
主要检测项目
T4细胞 总T细胞
T8细胞
淋巴细胞
B细胞 NK细胞
15
淋巴细胞的免疫标志
总T淋巴细胞 CD3+
T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞检测课件 PPT
工作流程
❖样本制备 ❖荧光染色 ❖上样检测 ❖数据分析
Y
+
Cell Suspension
Fluorescently Labelled Antibody
Histogram
Blue Laser (488 nm)
Fluorescence Detector
Fluorescence
Single Cell Suspension
抗体的选择： ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度：APC >PE >PerCP >FITC
PE较强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
常见荧光物质的应用
直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. X-Axis: 荧光信号强度. Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis：两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.
直方图：可根据单一因素区分细胞亚群
70
70 cells each
have a green
fluorescence
intensity of
荧光信号
➢ 线性放大——DNA、RNA、总蛋白质含量等的检测。 ➢ 对数放大——抗原检测等。 ➢ 荧光信号的面积(FL2－A)——准确反映DNA的含量。 ➢ 荧光信号的宽度(FL2－W)——常用来区分双联体细胞。
常见荧光素： • FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm • PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm • PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm • PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm • APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞检测课件
实验操作步骤
准备实验器材和试 剂
根据实验方案，准备相应的实验 器材和试剂，如试管、移液管、 荧光染料、抗体等。
样品制备
上机检测
按照实验方案要求，对细胞样品 进行处理，并进行抗体孵育和洗 涤操作。
将处理后的细胞样品加入流式细 胞仪中进行检测。同时，设置合 适的参数和阈值，确保数据的准 确性和可比性。
样品制备
将待测细胞样品进行预处 理，如酶消化、固定、破 膜等，以便于抗体或荧光 染料标记，并确保检测结 果的准确性。
抗体孵育与洗 涤
将抗体与细胞样品混合孵 育，使抗体与细胞表面抗 原或标记物结合。然后进 行洗涤，去除未结合抗体 和其他杂质。
流式细胞仪检 测
将处理后的细胞样品通过 流式细胞仪进行检测，收 集荧光信号数据，并对细 胞进行分析。
数据处理与分析
对收集到的数据进行处理和分析 ，提取有用的信息，如细胞分群 、定量和功能分析等。
实验结果分析
数据可视化
将处理后的数据进行可视化处理，生成图表和图形，以便于观察 和分析。
数据分析
对数据进行进一步的分析，如细胞亚群分型、表达谱分析、差异 分析等，以获得更深入的实验结果。
结果验证
对实验结果进行验证和确认，如有需要，可进行重复实验或验证 实验。
04
流式细胞检测实验方案Fra bibliotek实验方案设计
01
02
03
04
05
确定实验目的
流式细胞检测实验旨在检 测细胞表面的标记物、细 胞内抗原、细胞活性等， 从而对细胞进行分群、定 量和功能分析。根据实验 目的，选择合适的实验方 案。
选择抗体和试 剂
根据需要检测的抗原或标 记物，选择特异性抗体或 荧光染料标记的抗体。同 时，根据实验需求，选择 适当的缓冲液、洗涤液和 其他试剂。
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术及其临床应用课件(1)
光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
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10
2 700
3 720
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……
Counts
0…………101…………102…………103
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PE较强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
21 .
常见荧光物质的应用
Fluorophores Conjugated to an Ab
Dead Cell Dyes (DNA staining)
PM1 (Orange) Add nm PE
PI
Live Cell Dye (DNA Staining) Fluorescent Proteins Cell Tracking Dyes
20 .
常见荧光素： A. FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm B. PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm C. PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm D. PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm E. APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
抗体的选择： ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度：APC >PE >PerCP >FITC
2.
流式细胞仪
BD FACSVantage
BD Calibur
Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪
BECKMAN CytoFLEX
3.
Miltenyi MACSQuant
流式细胞仪的组成
Fluidics
Waste
Optics
Electronics
Software
4.
进样准备
样品规格： 96孔板 或 1.5 mL 小管
PM2 (Red) PM3 (Green)
PE-Cy5 7-AAD
FITC
LDS751
GFP CFSE
.
直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. ▪X-Axis: 荧光信号强度. ▪Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis：两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.
Side Scatter
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
荧光信号
488nm excitation
~520nm emission
FITC-labeled antibody binds surface antigen
.
荧光信号
➢ 线性放大——DNA、RNA、总蛋白质含量等的检测。 ➢ 对数放大——抗原检测等。 ➢ 荧光信号的面积(FL2－A)——准确反映DNA的含量。 ➢ 荧光信号的宽度(FL2－W)——常用来区分双联体细胞。
微毛细管流动池
20mm 50-100mm
Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second
0.1mm
Probe Volume = 200 pl
Volume = 200nl
Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01
8.
光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。
液流系统
功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。
No Sheath Fluid Waste： <10ml /hr run
2千—1万 cells/Test
.
Sheath Fluid: ~10 mL/Test Waste：1L / hr run 10万—100万cells/Test
SSC: Side-angle (90) light scatter – 在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。
.
Scatter – How it works
Laser Light
Laser Light
Laser Light
.
SSC 粒细胞 FSC
SSC 单核细胞 FSC
SSC 淋巴细胞 FSC
流式细胞技术
FLOW CYTOMETRY
王丽
2015-07-07
What does it mean?
CYTOMETRY
Cell Measure(ment)
MEASUREMENT OF A CELL
FLOW CYTOMETRY ：在液流系统中，快速测定单个细 胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。 Flow Cytometer (FCM) – 流式细胞仪 Flow Sorter – 流式细胞分选仪
11 .
软件系统
12 .
InCyte 开放模块- Flexibility
整合多组 数据
分析方式 灵活
13 .
R1
拖曳式设门，操
作简单易学
R2
多种Plot 以供选择
Work Station
Min/Max threshold
Heat-Map数据 分析直观化
测量参数
光散射强度 荧光强度 样本体积 细胞数目
5.
工作流程
❖样本制备 ❖荧光染色 ❖上样检测 ❖数据分析
Y
+
Cell Suspension
6.
FluorescentlyFra bibliotekLabelled Antibody
Histogram
Blue Laser (488 nm)
Fluorescence Detector
Fluorescence
Single Cell Suspension
激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm)
检测荧光通道： Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm
10 .
电子器件
检测器 、光电二极管、光电培增管 功能: 1) 量化电压脉冲 2) 将模型信号转换 成数字信号 3) 荧光补偿 4) 数据传给电脑以 便分析
Longpass
Shortpass
Bandpass
460 500 540
460 500 540
460 500 540
LP 500
SP 500
BP 500/50
LP 500 = >500 nm SP 500 = <500 nm BP 500/50 = 475 nm – 525 nm
9.
easyCyte 5HT system
.
前向散射角和侧向散射角
侧向散射角
虽然也与细胞的形状与大小有关， 但是它对细胞膜、胞质、核膜的， 折射率更敏感。
前向散射角
Incident laser light
“大小” 成正比例关系: • 截面积大小 • 折射率 • 细胞形状
FSC: Forward angle light scatter – 区分细胞与细胞碎片
21 .
常见荧光物质的应用
Fluorophores Conjugated to an Ab
Dead Cell Dyes (DNA staining)
PM1 (Orange) Add nm PE
PI
Live Cell Dye (DNA Staining) Fluorescent Proteins Cell Tracking Dyes
20 .
常见荧光素： A. FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm B. PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm C. PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm D. PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm E. APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
抗体的选择： ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度：APC >PE >PerCP >FITC
2.
流式细胞仪
BD FACSVantage
BD Calibur
Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪
BECKMAN CytoFLEX
3.
Miltenyi MACSQuant
流式细胞仪的组成
Fluidics
Waste
Optics
Electronics
Software
4.
进样准备
样品规格： 96孔板 或 1.5 mL 小管
PM2 (Red) PM3 (Green)
PE-Cy5 7-AAD
FITC
LDS751
GFP CFSE
.
直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. ▪X-Axis: 荧光信号强度. ▪Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis：两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.
Side Scatter
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
荧光信号
488nm excitation
~520nm emission
FITC-labeled antibody binds surface antigen
.
荧光信号
➢ 线性放大——DNA、RNA、总蛋白质含量等的检测。 ➢ 对数放大——抗原检测等。 ➢ 荧光信号的面积(FL2－A)——准确反映DNA的含量。 ➢ 荧光信号的宽度(FL2－W)——常用来区分双联体细胞。
微毛细管流动池
20mm 50-100mm
Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second
0.1mm
Probe Volume = 200 pl
Volume = 200nl
Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01
8.
光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。
液流系统
功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。
No Sheath Fluid Waste： <10ml /hr run
2千—1万 cells/Test
.
Sheath Fluid: ~10 mL/Test Waste：1L / hr run 10万—100万cells/Test
SSC: Side-angle (90) light scatter – 在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。
.
Scatter – How it works
Laser Light
Laser Light
Laser Light
.
SSC 粒细胞 FSC
SSC 单核细胞 FSC
SSC 淋巴细胞 FSC
流式细胞技术
FLOW CYTOMETRY
王丽
2015-07-07
What does it mean?
CYTOMETRY
Cell Measure(ment)
MEASUREMENT OF A CELL
FLOW CYTOMETRY ：在液流系统中，快速测定单个细 胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。 Flow Cytometer (FCM) – 流式细胞仪 Flow Sorter – 流式细胞分选仪
11 .
软件系统
12 .
InCyte 开放模块- Flexibility
整合多组 数据
分析方式 灵活
13 .
R1
拖曳式设门，操
作简单易学
R2
多种Plot 以供选择
Work Station
Min/Max threshold
Heat-Map数据 分析直观化
测量参数
光散射强度 荧光强度 样本体积 细胞数目
5.
工作流程
❖样本制备 ❖荧光染色 ❖上样检测 ❖数据分析
Y
+
Cell Suspension
6.
FluorescentlyFra bibliotekLabelled Antibody
Histogram
Blue Laser (488 nm)
Fluorescence Detector
Fluorescence
Single Cell Suspension
激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm)
检测荧光通道： Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm
10 .
电子器件
检测器 、光电二极管、光电培增管 功能: 1) 量化电压脉冲 2) 将模型信号转换 成数字信号 3) 荧光补偿 4) 数据传给电脑以 便分析
Longpass
Shortpass
Bandpass
460 500 540
460 500 540
460 500 540
LP 500
SP 500
BP 500/50
LP 500 = >500 nm SP 500 = <500 nm BP 500/50 = 475 nm – 525 nm
9.
easyCyte 5HT system
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前向散射角和侧向散射角
侧向散射角
虽然也与细胞的形状与大小有关， 但是它对细胞膜、胞质、核膜的， 折射率更敏感。
前向散射角
Incident laser light
“大小” 成正比例关系: • 截面积大小 • 折射率 • 细胞形状
FSC: Forward angle light scatter – 区分细胞与细胞碎片